離子交換層析說明書

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離子交換層析說明書

CMBestaroseFastFlowDEAEBestaroseFastFlowQBestaroseFastFlowSPBestaroseFastFlow

CM,DEAE,QandSPBestarose快速離子交換劑屬于分開介質(zhì)的一部分,主要為色譜工作服務(wù)，所有的介質(zhì)都經(jīng)過嚴(yán)格的控制生產(chǎn)從而保證其能夠滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。

為了正確操作以便得到最好的分開效果，請?jiān)谑褂们伴喿x該手冊。

目錄

1.Bestarose快速離子交換劑的特性32.裝柱指南123.裝柱評價(jià)144.保養(yǎng)5.疑難解答

1717-19

1.BestaroseFastFlow離子交換劑的特性

BestaroseFastFlow離子交換劑是以高度交聯(lián)的瓊脂糖為基質(zhì)，它的化學(xué)、物理性質(zhì)穩(wěn)定，即離子載量、洗脫狀況、反壓及流量等特性不受層析和清洗過程中溶液的影響，詳見下表。高物理穩(wěn)定性使它能在低背壓下提供快速液流，在柱高15cm，1bar壓力下，它的流速可達(dá)300-700cm/h，見圖1。另外，剛性介質(zhì)體積基本不因pH和離子強(qiáng)度的變化而變化。線性流速

圖1.Bestarose快速離子交換劑典型的壓力/流速曲線。

CMBestaroseFastFlow離子交換劑的特性

CMBestaroseFastFlow是一種弱陽離子交換劑，離子交換基團(tuán)

是羧甲基，如下：-O-CH2COO-

表一.CMBestaroseFastFlow特性。

項(xiàng)目指標(biāo)

離子交換劑類型弱陽離子

總離子載量0.09-0.13mmol/ml排阻限4×106（球形蛋白）骨架6%交聯(lián)瓊脂糖顆粒類型球形，45-165μm流速300–600cm/h*工作溫度4–40°C工作pH見圖2

pH穩(wěn)定性2-14(短期，CIP)4-13（長期）

化學(xué)穩(wěn)定性適合所有的緩沖體系1MNaOH8MUrea6MGuHCl70%乙醇

避免事項(xiàng)氧化劑長期暴露（1星期，20°C）pH

DEAEBestaroseFastFlow離子交換劑的特性

DEAEBestaroseFastFlow是一種弱陰離子交換劑，離子交換基團(tuán)是二乙基氨基乙基，如下：-O-CH2CH2-N+(C2H5)3H

表2DEAEBestaroseFastFlow的特性

項(xiàng)目指標(biāo)

離子交換劑類型弱陰離子

總離子載量0.11-0.16mmol/ml

6

排阻限4×10（球形蛋白）Matrix6%交聯(lián)瓊脂糖顆粒類型球形45-165μm流速300–600cm/h*工作溫度4–40°C工作pH見圖3

pH穩(wěn)定性2-14(短期，CIP)2-12（長期）

化學(xué)穩(wěn)定性適合所有的緩沖體系1MNaOH8MUrea6MGuHCl70%乙醇

避免事項(xiàng)氧化劑長期暴露（1星期，20°C）pH

圖5滴定曲線說明SPBestaroseFastFlow的pH工作范圍，例如SP基團(tuán)的pH工作范圍。

圖5SPBestaroseFastFlow的滴定曲線

2.裝柱指南

CM，DEAE，QBestarose離子交換劑貯存在20%乙醇中，而SPBestarose離子交換劑則貯存在20%乙醇和20mM的醋酸鈉中，使用前，將勻漿中的乙醇倒出，用起始緩沖液代替。

裝柱說明

裝柱的質(zhì)量主要影響分開效果，請參照如下說明來檢測，填裝層析柱。首先測量最適流速。下面是用于測量帶轉(zhuǎn)接器并固定柱床的層析柱最適流速方法。

測量最適裝柱流速：

最適裝柱流速與溫度、柱子大小型號、介質(zhì)體積有關(guān)，因此，建議獨(dú)立的裝置都需分別測量最適裝柱流速，測量方法如下：1.確切計(jì)算所需介質(zhì)的量（這對固定柱高的層析柱特別重要）。1L填充柱所需的介質(zhì)量大約是1.15L自然沉淀勻漿的量。2.參照層析柱使用手冊安裝柱子。3.開始以較低的速度填充柱子（30cm/h）。

4.不斷增加壓力，并記錄下來壓力穩(wěn)定時(shí)的流速，不要超過柱子能承受的最大壓力，或介質(zhì)允許的最大流速。

5.當(dāng)壓力/流速曲線不再變化或?qū)游鲋惺艿膲毫_(dá)到最大時(shí)，達(dá)到最大流速。此時(shí)中止裝柱，并且不要超過最大流速。最適裝柱流速/壓力是最大流速/壓力的70-100%。

6.制作壓力/流速曲線見表1，測得最適裝柱流速，實(shí)際操作時(shí)的流速/壓力應(yīng)小于最大流速/壓力的70%。

3.裝柱的評價(jià)

為了檢查裝柱質(zhì)量，并對使用過程中質(zhì)量監(jiān)控，裝柱完要馬上檢測柱效，然后定時(shí)檢查，此時(shí)可以檢查出分開效果是否正常。我們用等高塔板、HETP、峰不對稱因子、As等術(shù)語來衡量填充柱的性能，通過應(yīng)用樣品如1%丙酮，這些指標(biāo)是很簡單測得。（有色的化合物和鹽溶液避免使用，它們可能會與介質(zhì)發(fā)生反應(yīng)）

理論塔板數(shù)可以隨著檢測條件的變化而改變，因此它只能作為一個參考值。儀器和條件保持不變得到的結(jié)果才有可比性，溶質(zhì)、溶液、洗脫液、樣品體積、流速、滾動路徑、溫度等條件改變都影響結(jié)果。為了得到最好的結(jié)果，應(yīng)當(dāng)控制樣品在最大柱體積的1.0%，并且線性流速在15-30cm/h。

假使最大裝柱量是由柱效來決定的，那么理論塔板數(shù)就可以在使用柱子時(shí)做為裝柱量的參考。

測量HEPT和As的方法

為了防止樣品的稀釋，盡量接近柱子的進(jìn)口處參與樣品。條件

樣品體積：1.0-2.0%柱體積樣品conc：1.0%（v/v）丙酮水溶液，

0.8MNaCl或10×buffer

洗脫劑：水，0.5MNaCl水溶液或者是稀釋的緩沖液流速：20–30cm/h檢測：

丙酮：UV280nm;NaCl,buffer：電導(dǎo)率

根據(jù)UV曲線（或者是電導(dǎo)率曲線）計(jì)算HETP和As，公式如下：

HETP=L/N

N=5.54(VR/Wh)2VR=保存體積Wh=半峰寬L=柱高

N=理論塔板數(shù)

VR和Wh的單位要一致.

為了便利比較柱效，經(jīng)常會用到“還原塔板高度“這個概念，其計(jì)算公式是：HCTP/d

其中d是顆粒的直徑，一般來說，這個指標(biāo)小于3才是正常的。

峰形應(yīng)當(dāng)是對稱的，不對稱因子要盡量接近1（0.8-1.5一般是可以接受的）。峰形發(fā)生變化往往是柱床變差的首要標(biāo)志。

峰不對稱因子的計(jì)算：

As=b/a

其中：

a=在10%峰高處的第一個半峰寬b=在10%峰高處的其次個半峰寬

圖6表示丙酮典型的UV吸收色譜圖，并從該圖中可以計(jì)算HETP和As。

圖6在測定HEPT和As時(shí)丙酮典型UV吸收圖譜。

柱子：BPG300

介質(zhì)：Bestarose6FastFlow株高：57.5cm柱體積：40.6L

樣品：1.05L（1%丙酮）洗脫液：蒸餾水流速：19cm/hWh=0.9

HEPT=0.024cma:0.9b:0.85As：0.94

4.保養(yǎng)

為了長期保持Bestarose快速離子交換劑的最正確性能，請參照以下操作。

平衡

裝柱完，用5倍柱床體積的washingbuffer平衡柱子。

再生

分開后，用高離子強(qiáng)度的緩沖液（例如1MNaCl）和/或增加PH

值來洗柱，然后用至少5倍柱床體積的startingbuffer平衡柱子，或直到柱子流出液的電導(dǎo)率和pH值穩(wěn)定時(shí)。

清潔

在位清潔主要是去除再生后殘留在柱子中的污染物，包括脂質(zhì)、沉淀物或變性蛋白。這些污染物可能在分開未預(yù)先處理的樣品時(shí)殘留。定期清潔不但可以防止這些污染物的固定，還可以保持介質(zhì)的載量、流速及一般性能。

每次清潔應(yīng)根據(jù)不同的污染物制定清潔措施，清潔的頻率主要由分開樣品的性質(zhì)和條件所決定，建議分開1-5次后清潔一次。

標(biāo)準(zhǔn)的清潔流程

因離子交換而吸附的蛋白質(zhì)，可以用0.5膠床體積的2MNaCl溶液反方向洗柱10-15分鐘。

沉淀、疏水性蛋白和脂蛋白時(shí)，可用1MNaOH溶液以40cm/h的線性流速反方向洗柱1-2小時(shí)。

去除吸附性強(qiáng)的疏水性蛋白和脂質(zhì)時(shí)，用2-4倍柱床體積的0.5%無離子的去污劑（如1M醋酸）反向洗柱1-2h。同樣可以用2-4倍柱床體積的高達(dá)70％的乙醇或30％異丙醇反方向洗柱1-2h。

（*特別說明：當(dāng)使用70%乙醇時(shí)，需要在防爆的區(qū)域或設(shè)備。）

凈化

為了降低柱床中微生物污染，用0.5-1MNaOH反向洗柱1h。上述的清潔步驟同樣可以凈化柱子。

滅菌

只能采用高壓滅菌處理。用pH7，0.5MNaCl平衡柱子，倒出介質(zhì)，120℃高壓滅菌介質(zhì)30min。參考層析柱使用手冊對柱子的滅菌處理，然后再重新安裝、填柱并檢測。

保存

未用過的介質(zhì)可以貯存于4-30℃，確保容器蓋子擰緊。填充柱用workingbuffer平衡后貯存于20%乙醇中，以防微生物生長。

5．疑難解答

高背壓

1.檢查泵與收集管間所有的閥門是否都是完全開啟的。2.檢查所有的閥門是否清白的，且沒有堵塞。3.通過清潔，去除吸附性強(qiáng)的雜質(zhì)。

4.依照層析柱使用指南，檢查柱子各個部分如濾器、濾網(wǎng)等。

未預(yù)料的層析結(jié)果

1.檢查記錄速度/信號。2.檢查流速。3.檢查緩沖液。

4.檢查轉(zhuǎn)接器與柱床之間沒有間隙。5.檢查填充柱的性能，見14頁。6.檢查預(yù)處理樣品產(chǎn)生的變化狀況。

表5.離子交換層析的試驗(yàn)條件是如何影響分開步驟中的主要參數(shù)。優(yōu)化后的關(guān)鍵參數(shù)可以幫助達(dá)到理想的分開結(jié)果，并且有助于制定一套經(jīng)濟(jì)有效的分開方案。

條件分開目標(biāo)選擇性柱效載量（理論塔板）