植物組織培養(yǎng)的基本方法

目的要求1．一般掌握滅菌和消毒的區(qū)別2．掌握滅菌的方法和具體操作過程3．掌握無菌接種的步驟4．掌握外植體的選擇、培養(yǎng)方法和步驟5．一般掌握外植體褐變和玻璃化的處理方法6．掌握試管苗馴化的基本程序7．一般掌握快速繁殖試管苗的計劃安排及增殖倍數計算方法現在是1頁\一共有33頁\編輯于星期二滅菌滅菌是組織培養(yǎng)重要的工作之一。初學者首先要清楚有菌和無菌的范疇。這里所指的菌，包括細菌、真菌、放線菌、藻類及其它微生物?，F在是2頁\一共有33頁\編輯于星期二滅菌是指用物理或化學的方法，殺死物體表面和孔隙內的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質全部殺死。消毒，它指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用，顯然經過消毒，許多細菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不會完全殺死，即消毒后的環(huán)境里、物品上還有活著的微生物。而通過嚴格滅菌的操作空間（接種室、超凈臺、等）和使用的器皿，以及操作者的衣著和手都不帶任何活著的微生物。在這樣的條件下進行操作，就叫做無菌操作?，F在是3頁\一共有33頁\編輯于星期二常用的滅菌方法可分為物理的和化學的兩類。物理方法如干熱（烘燒和灼燒）、濕熱（常壓或高壓蒸煮）、射線處理（超聲波、微波）、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施?；瘜W方法是使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學藥品處理。這些方法和藥劑要根據工作中的不同材料不同目的適當選用。

現在是4頁\一共有33頁\編輯于星期二1．培養(yǎng)基用濕熱滅菌培養(yǎng)基在制備后的24小時內完成滅菌工序按容器大小不同，保壓時間有所不同（下表）。

容器的體積（ml）在121℃滅菌所需最少時間（min）２０～５０１５７５～１５０２０２５０～５００２５１０００３０現在是5頁\一共有33頁\編輯于星期二2.用于無菌操作的器械采用灼燒滅菌在無菌操作時，把鑷子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精燈火焰上灼燒滅菌。冷卻后，立即使用。操作中可采用250或500ml的廣口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。3.玻璃器皿及耐熱用具采用干熱滅菌干熱滅菌是利用烘箱加熱到160～180℃的溫度來殺死微生物。通常采用170℃持續(xù)90分鐘來滅菌。4.不耐熱的物質采用過濾滅菌一些生長調節(jié)劑，如赤霉素、玉米素、脫落酸和某些維生素是不耐熱的，不能用高壓滅菌處理，通常采用過濾滅菌方法-防細菌濾膜?，F在是6頁\一共有33頁\編輯于星期二5.空間采用紫外線和熏蒸滅菌（1）紫外線滅菌在接種室、超凈臺上或接種箱里用紫外燈滅菌。紫外線滅菌是利用輻射因子滅菌。細菌吸收紫外線后，蛋白質和核酸發(fā)生結構變化，引起細菌的染色體變異，造成死亡。紫外線的波長為200～300nm，其中以260nm的殺菌能力最強，但是紫外線的穿透物質的能力很弱，所以只適于空氣和物體表面的滅菌，且要求距照射物以不超過1.2米為宜。（2）熏蒸滅菌

用加熱焚燒、氧化等方法，使化學藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴散到空氣中，以殺死空氣和物體表面的微生物。這種方法簡便，只需要把消毒的空間關閉緊密即可。升汞與高錳酸鉀，常用熏蒸劑是甲醛?，F在是7頁\一共有33頁\編輯于星期二6.一些物體表面用藥劑噴霧滅菌物體表面可用一些藥劑涂擦、噴霧滅菌。如桌面、墻面、雙手表面、植物材料表面等?？捎?0％的酒精反復涂擦滅菌，１％～２％的來蘇兒溶液以及0.25～１％的新潔爾滅也可以?，F在是8頁\一共有33頁\編輯于星期二7.植物材料表面用消毒劑滅菌外植體的選擇:外植體部位：不同植物以及同一植物的不同器官對誘導條件的反應不一樣；取材季節(jié)：大多數植物應該在生長開始的時候采集；器官的生理狀態(tài)和發(fā)育年齡：幼年組織比老年組織具有較高的形態(tài)發(fā)生能力；外植體大?。呵o尖培養(yǎng)中，外植體越小成活率越低?，F在是9頁\一共有33頁\編輯于星期二外植體的滅菌方法:植物材料必須經嚴格的表面滅菌處理，再經無菌操作手續(xù)接到培養(yǎng)基上，這一過程叫做接種。接種的植物材料叫做外植體。首先，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細洗干凈，如用適當的刷子等刷洗，硬的材料用刮刀刮。第二步是對材料的表面浸潤滅菌。第三步是用滅菌劑處理。最后一步是用無菌水涮洗，涮洗要每次3分鐘左右，視采用的消毒液種類，涮洗3～10次左右?，F在是10頁\一共有33頁\編輯于星期二常用的消毒劑：既要考慮具有良好的消毒、殺菌作用，同時又易被蒸餾水沖洗掉或分解掉；應當正確選擇消毒液的濃度和處理時間，應盡量減少組織的死亡；一些表面消毒劑的消毒效果不相同。滅菌劑使用濃度持續(xù)時間(min)去除的難易效果次氯酸鈣90-100g/l5～30易很好次氯酸鈉5-20g/l5～30易很好漂白粉飽和溶液5～30易很好氯化汞0.1-10g/l2-10較難最好乙醇700-750ml/l0.2-2易好過氧化氫100-120ml/l5-15最易好溴水10-20ml/l2-10易很好抗菌素4～50mg/L30～60中較好現在是11頁\一共有33頁\編輯于星期二接種接種是將已消毒好的根、莖、葉等離體器官，經切割或剪裁成小段或小塊，放入培養(yǎng)基的過程?，F在是12頁\一共有33頁\編輯于星期二接種前后的程序：A：接種室消毒：用酒精擦拭臺面，接種工具擺放好后用紫外燈照射表面滅菌15-20分鐘，然后通風20分鐘；B：手要洗凈，用75%酒精擦手，在操作過程中要經常用酒精擦手；C：將初步洗滌及切割的材料放入燒杯（燒杯用75%酒精擦杯壁），帶入超凈臺上，用消毒劑滅菌，再用無菌水沖洗．最后瀝去水分，取出放置在滅過菌的４層紗布上或濾紙上。D：材料吸干后，一手拿鑷子，一手拿剪子或解剖刀，對材料進行適當的切割。E：用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基上。

現在是13頁\一共有33頁\編輯于星期二培養(yǎng)培養(yǎng)：指把培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)室（有光照、溫度條件）里，使之生長，分裂、分化形成愈傷組織或進一步分化成再生植株的過程?，F在是14頁\一共有33頁\編輯于星期二（一）培養(yǎng)方法1．固體培養(yǎng)法即用瓊脂固化培養(yǎng)基來培養(yǎng)植物材料的方法。是現在最常用的方法。該法設備簡單，易行。但養(yǎng)分分布不均，生長速度不均衡。并常有褐化中毒現象發(fā)生。2．液體培養(yǎng)法即用不加固化劑的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)植物材料的方法。由于液體中氧氣含量較少，常需要通過攪動或振動培養(yǎng)液的方法以確保氧氣的供給，采用往復式搖床或旋轉式搖床進行培養(yǎng)，其速度一般為50～100轉／分，這種定期浸沒的方法，既能使培養(yǎng)基均一，又能保證氧氣的供給。靜止培養(yǎng)：濾紙橋培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)：磁力攪拌器、搖床、自旋式培養(yǎng)架現在是15頁\一共有33頁\編輯于星期二(二）培養(yǎng)步驟：1．初代培養(yǎng)：即接種某種外植體后，最初的幾代培養(yǎng)。初代培養(yǎng)旨在獲得無菌材料和無性繁殖系。初代培養(yǎng)時，常用誘導或分化培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基中含有較多的細胞分裂素和少量的生長素。初代培養(yǎng)建立的無性繁殖系包括莖梢、芽叢、胚狀體和原球莖等?，F在是16頁\一共有33頁\編輯于星期二（1）頂芽和腋芽的發(fā)育采用外源的細胞分裂素，可促使具有頂芽或沒有腋芽的休眠側芽啟動生長。適宜這種再生繁殖的植物，在采樣時，只能采用頂芽、側芽或帶有芽的莖切段，其它如種子萌發(fā)后取枝條也可以。（2）不定芽的發(fā)育在培養(yǎng)中由外植體產生不定芽,通常首先要經脫分化過程,形成愈傷組織的細胞。多數情況下它先形成芽，后形成根。另一種方式是從器官中直接產生不定芽，如矮牽牛、福祿考、懸鉤子等。許多常規(guī)方法不能無性繁殖的種類，在試管條件下卻能較容易地產生不定芽而再生，如柏科，松科，銀杏等一些植物。許多單子葉植物儲藏器官能強烈地發(fā)生不定芽，用百合鱗片的切塊就可大量形成不定鱗莖。在不定芽培養(yǎng)時，也常用誘導或分化培養(yǎng)基，如非洲菊、草莓等。（3）體細胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育現在是17頁\一共有33頁\編輯于星期二現在是18頁\一共有33頁\編輯于星期二2．繼代培養(yǎng)：在初代培養(yǎng)的基礎上所獲得的芽、苗、胚狀體和原球莖等,數量都還不多，它們需要進一步增殖，使之越來越多，從而發(fā)揮快速繁殖的優(yōu)勢?，F在是19頁\一共有33頁\編輯于星期二繼代培養(yǎng)是繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數代的擴繁培養(yǎng)過程。旨在繁出相當數量的無根苗，最后能達到邊繁邊生根的目的。繼代培養(yǎng)的后代是按幾何級數增加的過程。在快速繁殖中初代培養(yǎng)只是一個必經的過程，而繼代培養(yǎng)則是經常性不停的進行過程。但在達到相當的數量之后，則應考慮使其中一部分轉入生根階段。從某種意義上講，增殖只是貯備母株，而生根才是增殖材料的分流，生產出成品?，F在是20頁\一共有33頁\編輯于星期二3．生根培養(yǎng)：生根培養(yǎng)是使無根苗生根的過程。最后要使生出的不定根濃密而粗壯。生根可采用1/2或者1／4培養(yǎng)基，全部去掉或用低濃度的細胞分裂素，并加入適量的生長素(NAA、IAA等)?，F在是21頁\一共有33頁\編輯于星期二當新梢高達3cm以上時切除基部的愈傷組織。用下列方法誘導生根（1）將新梢基部浸入50或100ppmIBA溶液中處理4～8小時。（2）在含有生長素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6天。（3）直接移入含有生長素的生根培養(yǎng)基中。上述三種方法均能誘導新梢生根。但前二種方法對新生根的生長發(fā)育更有利。而第三種對幼根的生長有抑制作用。因為當根原始體形成后較高濃度生長素的繼續(xù)存在，則不利于幼根的生長發(fā)育。試管內生根壯苗的階段，目的是為了成功地移植到試管外的環(huán)境中，使試管苗適應外界的環(huán)境因子。不同植物的適宜馴化溫度不同。如菊花，以18～20０℃為宜。溫度過高牽涉到蒸騰加強。以及菌類易滋生等問題。溫度過低使幼苗生長遲緩，或不易成活．春季低溫時苗床可加設電熱線使基質溫度略高于氣溫20～3０℃，這利于生根和促進根系發(fā)達，有利于提前成活。光強應比以前培養(yǎng)有所提高。以強度較高的漫射光為好，約4000Lx左右為宜，以維持光合作用所需光強。但光線過強刺激蒸騰加強，使水分平衡的矛盾更尖銳?，F在是22頁\一共有33頁\編輯于星期二現在是23頁\一共有33頁\編輯于星期二培養(yǎng)物污染原因和預防措施1、污染：是指在組織培養(yǎng)過程中由于真菌、細菌等微生物的侵染，在培養(yǎng)容器內滋生大量的菌斑，使培養(yǎng)材料不能正常生長和發(fā)育的現象。污染物的長期存在會引起試管苗生活力下降，葉片缺綠，甚至死亡。2、原因：培養(yǎng)基及各種使用器具消毒不徹底，外植體滅菌時不徹底，操作時人為因素帶入，工作區(qū)域污染等。3、控制：器具在高溫滅菌后，在使用過程中需要不斷地在酒精燈上進行灼燒消毒；所使用的外植體在常規(guī)的消毒后，可能還帶有一定量的菌，可以先在培養(yǎng)基上進行幾天的預培養(yǎng)，再轉到分化培養(yǎng)基上，另外也可以通過在培養(yǎng)基中添加抗生素來抑菌?，F在是24頁\一共有33頁\編輯于星期二初代培養(yǎng)外植體的褐變

外植體褐變是指在誘導脫分化或再分化過程中，自身組織從表面向培養(yǎng)基釋放褐色物質，以至培養(yǎng)基逐漸變成褐色，外植體有變褐色而死亡的現象。原因：很多植物都含有較多的酚類化合物，其在完整的組織和細胞中與多酚氧化酶分隔存在，因而比較穩(wěn)定。在細胞受到傷害時，分隔效應被打破，酚類化合物外溢，與多酚氧化酶接觸而氧化成褐色的醌類物質和水。醌類物質在酶的作用下，與外植體中的蛋白質聚合，從而使其它酶失活，組織代謝活動紊亂，生長停滯。現在是25頁\一共有33頁\編輯于星期二影響因素1、植物種類和基因型：木本植物、單寧或色素含量高的植物易發(fā)生褐變；2、外植體的來源和生理狀況：幼齡材料一般比成齡材料褐變輕（含酚類物質少）；同一植物冬春季取材褐變死亡率最低，其它季節(jié)不同程度增加；3、外植體的大?。盒〔牧细缀肿?，大材料切口越大，酚類氧化面越大，易褐變；消毒的化學試劑也會引起褐化；4、培養(yǎng)基：濃度過高的無機鹽會使某些觀賞植物的褐變程度增加，此外，細胞分裂素的水平過高也會刺激某些花卉外植體的多酚氧化酶的活性，從而使褐變現象加深。5、培養(yǎng)條件不當：例如光照過強、溫度過高、培養(yǎng)時間過長等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速被培養(yǎng)的外植體的褐變程度?，F在是26頁\一共有33頁\編輯于星期二控制褐變的措施1、外植體和培養(yǎng)材料進行20-40天的遮光處理或暗培養(yǎng)，可減輕部分種類的褐化程度；2、在接種前用無菌水反復清洗外植體并對外植體進行冷藏處理，洗盡切口處滲出的酚類物質，可起到減輕褐化作用；3、控制溫度和光照，在不影響正常生長和分化的前提下，盡量降低溫度，減少光照；4、在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的褐變現象。在培養(yǎng)基中加入0.5-1%左右的活性炭，用以吸附褐變產生的有害物質，減輕褐變影響；5、連續(xù)轉移：對容易褐變的材料可間隔12～24小時的培養(yǎng)后，再轉移到新的培養(yǎng)基上，這樣經過連續(xù)處理7～10天后，褐變現象便會得到控制或大為減輕?，F在是27頁\一共有33頁\編輯于星期二繼代培養(yǎng)時材料的玻璃化

定義：當植物材料不斷地進行離體繁殖時，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會呈半透明狀，呈水跡狀，這種現象通常稱為玻璃化。玻璃化為試管苗的生理失調癥。玻璃苗的特點：葉、嫩梢呈水晶透明或半透明，植株矮小腫脹，失綠，葉片皺縮成縱向卷曲；葉表缺少角質層蠟質，沒有功能性氣孔；體內含水量高，但干物質葉綠素、蛋白質、纖維素和木質素含量低?，F在是28頁\一共有33頁\編輯于星期二誘因（P40）1、激素濃度：當培養(yǎng)基上細胞分裂素水平較高時，容易出現玻璃化現象；2、溫度3、濕度4、培養(yǎng)基的硬度5、光照時間6、培養(yǎng)基成分C/N現在是29頁\一共有33頁\編輯于星期二解決的方法

（1）增加瓊脂濃度，提高蔗糖含量，可增加培養(yǎng)基中的溶質水平，以降低培養(yǎng)基的水勢；（2）減少培養(yǎng)基中含氮化合物的用量；（3）增加光照；（4）增加容器通風，降低培養(yǎng)容器內部環(huán)境的相對濕度；（5）降低培養(yǎng)溫度，進行晝夜變溫交替培養(yǎng)，有助于減輕試管苗玻璃化的現象發(fā)生；（6）降低培養(yǎng)基中細胞分裂素和赤霉素的含量，可以考慮加入適量脫落酸?，F在是30頁\一共有33頁\編輯于星期二試管苗移栽馴化試管苗移栽是組織培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)，這個工作環(huán)節(jié)做不好，就會造成前功盡棄。為了做好試管苗的移栽，應該選擇適用合適的基質，并配合以相應的管理措施，才能確保整個工作有條不紊地進行。