微生物細(xì)胞破碎復(fù)性

微生物細(xì)胞破碎復(fù)性第1頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

幾種產(chǎn)品在發(fā)酵液中的濃度產(chǎn)品典型濃度（g/L）抗生素25

氨基酸100

酒精100

有機(jī)酸100

酶20

蛋白質(zhì)10第2頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四下游加工技術(shù)的特點(diǎn):1.發(fā)酵液的復(fù)雜性造成分離上的困難性;

2.欲提取的產(chǎn)物通常濃度低且很不穩(wěn)定;

3.多為分批操作，各批發(fā)酵液不盡相同，要求下游加工有一定彈性。第3頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四產(chǎn)物提純過程的不同決定于：

對(duì)象材料目標(biāo)產(chǎn)物特性對(duì)其純度的要求第4頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四基因工程生物制品分離純化:工程菌經(jīng)過大規(guī)模培養(yǎng)后，產(chǎn)生的有效成分含量很低，雜質(zhì)含量卻很高分離純化極其重要基因工程藥物從轉(zhuǎn)化細(xì)胞、生產(chǎn)，對(duì)產(chǎn)品的純度要求高于傳統(tǒng)產(chǎn)品。第5頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四發(fā)酵液細(xì)胞分離胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物細(xì)胞破碎固液分離包涵體細(xì)胞碎片分離變性復(fù)性濃縮初步分離高度純化制劑

產(chǎn)品

基因工程制品分離純化的一般流程第6頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四初級(jí)分離：分離細(xì)胞和培養(yǎng)液，破碎細(xì)胞釋放產(chǎn)物，溶解包含體（包涵體），復(fù)原蛋白質(zhì)，濃縮產(chǎn)物，去除大部分雜質(zhì)等過程。主要決定產(chǎn)物的得率。純化精制：初級(jí)分離基礎(chǔ)上，用各種高選擇性手段，主要是各種層析技術(shù)，將目標(biāo)產(chǎn)物和干擾雜質(zhì)盡可能分開，使產(chǎn)物的純度達(dá)到有關(guān)要求。主要決定產(chǎn)物的純度。產(chǎn)物提純過程包括兩個(gè)基本階段：第7頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四總原則：

控制時(shí)間、溫度、pH值，減少與空氣接觸的機(jī)會(huì)，設(shè)計(jì)好各組分的分離順序.第8頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四第二節(jié)細(xì)胞破碎第9頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四酶來源應(yīng)用范圍L-天冬酰氨酶EruiniaCaratovoraEscherichiaColi治療急性淋巴癌過氧化氫酶Aspergillusniger牛奶滅菌后H2O2的清除膽固醇氧化酶Nocardiahodochrous膽固醇漿液分析β-半乳糖苷酶KluyveromycesfragilisSaccharomyceslactis在牛奶/乳清中乳糖的水解作用葡萄糖氧化酶AspergillusnigerPenicilluimnotatum葡萄糖漿液分析食品中氧的清除葡萄糖-6-磷酸脫氫酶Yeast臨床分析蔗糖酶SaccharomycesCerevisiae糖果、蜜餞青霉素?；窫scherichiaColi芐青霉素的脫酰作用表1胞內(nèi)酶舉例細(xì)胞破碎的必要性第10頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四藥物名宿主用途胰島素大腸桿菌治療糖尿病人生長激素（HGH）大腸桿菌治療侏儒病α-干擾素大腸桿菌治療毛狀細(xì)胞白血病和卡波濟(jì)肉瘤表2幾種由大腸桿菌表達(dá)的胞內(nèi)重組藥物第11頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四細(xì)胞壁的組成與結(jié)構(gòu)微生物革蘭氏陽性細(xì)菌革蘭氏陰性細(xì)菌酵母菌霉菌壁厚/nm20~8010~13100~300100~250層次單層多層多層多層主要組成肽聚糖（40％～90％）、多糖、胞壁酸、蛋白質(zhì)、脂多糖（1％～4％）肽聚糖（5％～10％）脂蛋白、脂多糖（11％～22％）磷脂、蛋白質(zhì)葡聚糖（30％～40％）甘露聚糖（30％）、蛋白質(zhì)（6％～8％）、脂類（8.5％～13.5）多聚糖（80％～90％）脂類、蛋白質(zhì)第12頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

圖1革蘭氏菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)圖（a）革蘭氏陽性菌（b）革蘭氏陰性菌第13頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

圖2酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)示意圖M—甘露聚糖；P—磷酸二酯鍵；G—葡聚糖第14頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

微生物細(xì)胞壁的形狀、強(qiáng)度取決于細(xì)胞壁的組成以及它們之間相互關(guān)聯(lián)的程度。內(nèi)因：連接細(xì)胞壁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的共價(jià)鍵;外因：各類微生物的遺傳信息、培養(yǎng)條件、菌齡、外界環(huán)境等。第15頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四破碎程度的評(píng)價(jià)

破碎程度常用細(xì)胞破碎率（%）表示。

破碎率定義為被破碎細(xì)胞的數(shù)量占原始細(xì)胞數(shù)量的百分比數(shù)，即：

Y（%）=[（N0-N）/N0]*100

其中N0——原始細(xì)胞數(shù)量；

N——經(jīng)t時(shí)間操作后保留下來的未損害完整細(xì)胞數(shù)量。第16頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四N0和N的確定方法：直接計(jì)數(shù)法：通過平板計(jì)數(shù)技術(shù)或血球細(xì)胞器上用顯微鏡觀察，直接對(duì)適當(dāng)稀釋后的樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)。間接計(jì)數(shù)法：在細(xì)胞破碎后，測定懸浮液中細(xì)胞釋放出來的化合物的量（eg.可溶性蛋白、酶等）。第17頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四細(xì)胞破碎技術(shù)第18頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四其他新的細(xì)胞破碎方法：

激光破碎法冷凍-噴射法高速相向流撞擊法第19頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四細(xì)胞聲波攪拌液壓冷凍壓力動(dòng)物細(xì)胞7777革蘭氏陰性芽孢桿菌和球菌6566革蘭氏陽性芽孢桿菌5(4)54酵母3.5342.5革蘭氏陽性球菌3.5(2)32.5孢子2(1)21菌絲16(1)5表細(xì)胞對(duì)破碎的敏感度注：上述數(shù)字表示相對(duì)敏感度，括號(hào)則表示數(shù)字不確切。第20頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四常用的破壁方法珠磨法高壓勻漿法超聲波破碎法X-press法機(jī)械法非機(jī)械法酶溶法化學(xué)滲透法滲透壓法凍結(jié)融化法干燥法第21頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四1、常用的破壁方法——珠磨法圖3水平攪拌式珠麿機(jī)結(jié)構(gòu)示意圖1—細(xì)胞懸浮液2—細(xì)胞勻漿液3—珠液分離器4—冷卻液出口5—攪拌電機(jī)6—冷卻液進(jìn)口7—攪拌槳8——玻璃珠原理：細(xì)胞和極細(xì)的研磨劑在攪拌槳作用下充分混合，珠子之間及珠子與細(xì)胞之間互相剪切、碰撞，促使細(xì)胞壁破裂，釋放內(nèi)含物。第22頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四幾種常見珠磨器第23頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

破碎作用遵循一級(jí)動(dòng)力學(xué)定律：

第24頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

破碎的速率和效率是所有操作參數(shù)的函數(shù)，如：珠體的大小、珠體的裝量、細(xì)胞濃度、操作溫度、料液性質(zhì)、攪拌器轉(zhuǎn)速與構(gòu)型等。此外，與攪拌器的設(shè)計(jì)和研磨腔的結(jié)構(gòu)也有關(guān)系，如轉(zhuǎn)盤外緣速度等。第25頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

一般來說，磨珠越小，細(xì)胞破碎速度越快，但太小易于漂浮，并難以保留在研磨機(jī)的腔體中。通常實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，珠體直徑為0.2mm較好，工業(yè)規(guī)模不得小于0.4mm。

第26頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

有研究表明，減小磨珠直徑起先會(huì)提高卡樂酵母蛋白質(zhì)的釋放速度，但磨珠再小一些，蛋白質(zhì)的釋放速度反而稍有下降。

eg.從酵母細(xì)胞中提取D-葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，最好使用0.55-0.85mm大小的玻璃珠，而在提取α-D-葡萄糖苷酶時(shí)，則最好使用較大尺寸（如1mm直徑）磨珠。第27頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

在一定范圍內(nèi)，增加珠體裝填量可以提高細(xì)胞破碎率。但超過某一限度時(shí)，反不利于細(xì)胞破碎和蛋白質(zhì)的釋放。

為消除這種影響，必須提高攪拌器的功率，這樣又會(huì)增大釋放的熱量，給破碎帶來困難。

一般研磨機(jī)腔體內(nèi)的填充密度控制在80%-90%，并隨珠體大小變化。第28頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

細(xì)胞濃度對(duì)懸浮液的流變特性具有影響，最佳的細(xì)胞濃度應(yīng)用實(shí)驗(yàn)來確定。一般用Netzsch(耐池）LM20研磨機(jī)破碎時(shí)，細(xì)胞濃度控制在40%左右。第29頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四Currie等人的研究表明，操作溫度控制在5-400C范圍內(nèi)對(duì)破碎物的影響較小。常采用冷卻夾套和攪拌軸的方式來調(diào)節(jié)磨室的溫度。第30頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四2、常用的破壁方法——高壓勻漿圖5高壓勻漿機(jī)裝置圖組成：高壓泵和勻漿閥作用機(jī)理：高壓泵將電機(jī)的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)變成勻漿閥柱桿的直線運(yùn)動(dòng)，從高壓室（幾十兆帕）壓出細(xì)胞懸浮液，經(jīng)過碰撞環(huán)的撞擊后改變方向從出口管噴出，使細(xì)胞經(jīng)歷較高的流速下的剪切碰撞發(fā)生較大的變形，從而達(dá)到破碎細(xì)胞的目的。第31頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四第32頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四第33頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四高壓勻漿法動(dòng)力學(xué)方程破碎效率與勻漿閥結(jié)構(gòu)、操作壓力和破碎次數(shù)有關(guān)：Ln(Rm/(Rm-R))=KNPaR：單位生物量釋放出的產(chǎn)物量（mg/G)Rm：R的最大值；K：破碎速率常數(shù)；N：破碎次數(shù)；P：操作壓力；a:與微生物性質(zhì)有關(guān)的指數(shù)系數(shù)。第34頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

此方法中影響破碎的主要因素是壓力、溫度和通過勻漿器的次數(shù)。

有研究表明，當(dāng)懸浮液中酵母濃度在450-750kg/m3時(shí)，溫度由500C變?yōu)?00C，破碎率約提高1.5倍。

第35頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四圖7細(xì)胞濃度及壓力大小對(duì)破碎率的影響勻漿次數(shù)圖8勻漿次數(shù)對(duì)破碎效果的影響第36頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四破碎率---操作壓力----溫度控制----能耗溫度對(duì)活性物質(zhì)的失活作用提高壓力需增加能耗：3.5KW/100MPa移走熱量需付出代價(jià)高壓勻漿一般需多級(jí)操作，每次循環(huán)前往往進(jìn)行級(jí)間冷卻勻漿過程中產(chǎn)生的熱→蛋白質(zhì)和酶的失活溫控和能耗第37頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四堵塞（不適合團(tuán)塊狀或絲狀真菌），質(zhì)地堅(jiān)硬者如包含體易損傷勻漿閥，也不適用；溫度高易失活，能耗大。存在的問題第38頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四高壓勻漿法與高速珠磨法的比較項(xiàng)目高壓勻漿法高速珠磨法操作參數(shù)少多，液體損耗大連續(xù)操作時(shí)配備熱換器進(jìn)行級(jí)間冷卻兼具破碎和冷卻，減少產(chǎn)物失活達(dá)到較高破碎率需循環(huán)2-4次一次操作適用范圍團(tuán)狀、絲狀真菌、較小革蘭陽性菌不宜，包含體不宜幾乎所有的微生物細(xì)胞，包括含有包含體的基因工程菌的破壁第39頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四3、常用的破壁方法——超聲波破碎作用機(jī)理：空化現(xiàn)象

由無數(shù)細(xì)小的空化氣泡破裂而產(chǎn)生的沖擊波的現(xiàn)象。第40頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四空化現(xiàn)象：在強(qiáng)聲波作用下，引起氣泡形成，脹大和破碎的現(xiàn)象。錫箔紙測試空化強(qiáng)度與空化密度看得到的空化現(xiàn)象第41頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

超聲波振動(dòng)在液體中傳播的音波壓強(qiáng)達(dá)到1atm時(shí)，功率密度為0.35w/cm2，這時(shí)超聲波的音波壓強(qiáng)峰值可達(dá)真空或負(fù)壓，但實(shí)際上無負(fù)壓存在，因此在液體中產(chǎn)生一個(gè)很大的力，將液體分子拉裂成空洞-空化核。此空洞非常接近真空，在超聲波壓強(qiáng)方向達(dá)到最大時(shí)破裂。

第42頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四圖10USB600型微電腦控制超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)圖9超聲波細(xì)胞破碎儀的結(jié)構(gòu)示意圖第43頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四振幅細(xì)胞懸浮液的黏度表面張力被處理懸浮液的體積探頭的形狀和材料細(xì)胞懸浮液的流速影響參數(shù)第44頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

超聲破碎優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，液量損失少；存在問題：使敏感物質(zhì)變性失活，噪聲大，大容量時(shí)效率低，應(yīng)用潛力有限。第45頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

常用酶：

溶菌酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽鍵內(nèi)切酶、殼多糖酶等。

4、常用的破壁方法——酶溶法

作用機(jī)理：

利用酶分解細(xì)胞壁上特殊的化學(xué)鍵。第46頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四eg.蝸牛酶——從蝸牛的嗦囊和消化道中制備的混合酶，含有纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、蛋白酶等20多種。第47頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

在某些情況下，不加外源酶也可使某些微生物發(fā)生自溶。

eg.谷氨酸生產(chǎn)菌（如乳糖發(fā)酵短桿菌）加入pH10的緩沖液（0.028mol/LNa2CO3—0.018mol/LNaHCO3

），配3%的細(xì)胞懸浮液，加熱至700C，保溫?cái)嚢?0min，菌體即自溶。

第48頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

優(yōu)點(diǎn)：一定的選擇性；細(xì)胞外形完整，核酸釋放少，有利于進(jìn)一步分離過程。

缺點(diǎn)：（只能用于實(shí)驗(yàn)室）產(chǎn)物抑制造成效率低下；溶酶價(jià)格高；通用性差，不易確定最佳條件；第49頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

所用的化學(xué)試劑：酸、堿、表面活性劑、脂溶性有機(jī)溶劑、EDTA鰲合劑、變性劑等。5、常用的破壁方法——化學(xué)滲透法

作用機(jī)理：改變細(xì)胞壁或膜的通透性，從而使內(nèi)含物有選擇性地滲透出來。第50頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四酸、堿：用來調(diào)節(jié)溶液的pH值，改變細(xì)胞所處環(huán)境，改變蛋白質(zhì)的電荷性；有機(jī)溶劑：常用的是甲苯，被細(xì)胞壁脂質(zhì)層吸收后導(dǎo)致胞壁膨脹，造成細(xì)胞壁破裂。此外，丁醇、丙酮、氯仿等也常用到。第51頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四表面活性劑：天然的如膽酸鹽、磷酯，合成的如SDS、Tween、TritonX-100等。變性劑：如鹽酸胍，與水中氫鍵作用，消弱溶質(zhì)分子間的疏水作用。第52頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四EDTA：破壞細(xì)胞壁的外層膜；甲苯：溶解細(xì)胞膜的磷脂層；TritonX-100：溶解內(nèi)膜的雙磷脂層；鹽酸胍和脲：削弱溶質(zhì)分子間的疏水作用，使疏水性化合物溶于水溶液。第53頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四eg.1.某些動(dòng)物細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞）可采用SDS、去氧膽酸鈉等破壞細(xì)胞膜；而細(xì)胞壁較厚，采用溶菌酶處理效果較好。

2.用Triton從一種諾卡氏菌中選擇性地提取膽固醇氧化酶。第54頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

溫和化學(xué)滲透劑

溫和化學(xué)滲透劑一般是采用甘氨酸、丙氨酸等分子量較小的非極性Ｒ基氨基酸。其破碎機(jī)理可能是因?yàn)樾》肿拥母拾彼?、丙氨酸更易滲透到細(xì)胞壁中,通過氫鍵、范德華引力、靜電引力等化學(xué)親和力改變細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),從而改變細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性。第55頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四細(xì)胞類別變性劑清潔劑有機(jī)溶劑酶抗生素生物試劑鰲和劑革蘭氏陰性菌******革蘭氏陰性菌***酵母菌******植物細(xì)胞****巨噬細(xì)胞**表4不同細(xì)胞可采用的化學(xué)滲透處理方式*表示適用第56頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四優(yōu)點(diǎn)（相對(duì)機(jī)械破碎）：對(duì)產(chǎn)物釋出有一定的選擇性；細(xì)胞保持完整，碎片少，利于進(jìn)一步提??；核酸釋放量少，黏度低，便于進(jìn)一步分離。缺陷：時(shí)間長，效率低；化學(xué)試劑有毒；通用性差。第57頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四細(xì)胞破碎機(jī)理圖第58頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四機(jī)理：微波加熱導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)極性物質(zhì)，尤其是水分子吸收微波能，產(chǎn)生大量熱量，使胞內(nèi)溫度迅速上升，液態(tài)水汽化產(chǎn)生的壓力將細(xì)胞膜和細(xì)胞壁沖裂，形成微小孔洞，進(jìn)一步加熱可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部和細(xì)胞壁水分減少，細(xì)胞收縮，表面出現(xiàn)裂紋。5、常用的破壁方法——微波加熱法第59頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

優(yōu)點(diǎn)：

微波穿透性強(qiáng)，選擇性高、加熱效率高。

缺陷：一般只適合對(duì)熱穩(wěn)定物質(zhì)的分離；被處理的物料要具有良好的吸水性；不適于富含淀粉和樹膠等的天然植物。第60頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四機(jī)械破碎法與非機(jī)械破碎法的比較比較項(xiàng)目機(jī)械法非機(jī)械法破碎機(jī)理切碎細(xì)胞溶解局部壁膜碎片大小碎片細(xì)小細(xì)胞碎片較大內(nèi)含物釋放全部部分黏度高（核酸多）低（核酸少）時(shí)間，效率時(shí)間短，效率高時(shí)間長，效率低設(shè)備需專用設(shè)備不需專用設(shè)備通用性強(qiáng)差經(jīng)濟(jì)成本低成本高應(yīng)用范圍實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)范圍實(shí)驗(yàn)室范圍第61頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四細(xì)胞破壁技術(shù)注意事項(xiàng)

多種破碎方法相結(jié)合與下游過程相結(jié)合與上游過程相結(jié)合第62頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四小結(jié)：細(xì)胞破碎主要方法第63頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四思考:1、微生物細(xì)胞破碎的原理是什么？有哪些具體的方法？2、G+菌、G—菌以及酵母菌細(xì)胞壁的差別在哪里？3、請(qǐng)指出珠磨法與高壓勻漿法各自的原理及適用范圍。4、細(xì)胞破壁應(yīng)注意哪些問題？第64頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四克隆表達(dá)的產(chǎn)物基因工程細(xì)胞蛋白質(zhì)沒有活性，一級(jí)結(jié)構(gòu)正確，立體構(gòu)型錯(cuò)誤，無生物學(xué)活性！——包涵體第三節(jié)蛋白質(zhì)復(fù)性難溶于水，只有在變性劑溶液中才能溶解。第65頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四病毒在增殖的過程中，常使寄主細(xì)胞內(nèi)形成一種蛋白質(zhì)性質(zhì)的病變結(jié)構(gòu)——包涵體SEMofE.colicontaininginclusionbodiesSEMofisolatedwashedinclusionbodies第66頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

包含體形成原因：（比較復(fù)雜，目前尚不完全清楚。）缺少某些協(xié)助因子（分子伴侶？？）或者由于周圍物理環(huán)境（溫度等）不適，使其難以連續(xù)進(jìn)行次級(jí)鍵的形成，中間產(chǎn)物相互凝集而積累形成包含體。應(yīng)該考慮的事：設(shè)法減少包含體的形成！第67頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

減少包涵體形成的策略1、

降低重組菌的生長溫度

降低培養(yǎng)溫度是減少包涵體形成的最常用的方法，較低的生長溫度降低了無活性聚集體形成的速率和疏水相互作用，從而可減少包涵體的形成。第68頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四培養(yǎng)E.coli時(shí)添加高濃度的多醇類、蔗糖或非代謝糖可以阻止分泌的蛋白質(zhì)聚集反應(yīng)，在最適濃度范圍內(nèi)添加這些添加劑不會(huì)影響細(xì)胞的生長、蛋白質(zhì)的合成或運(yùn)輸；其它促重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的生長添加劑還有乙醇（誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá)）、低分子量的巰基或二硫化合物（影響細(xì)胞周質(zhì)的還原態(tài)，從而影響二硫鍵的形成）和NaCl。3、供給豐富的培養(yǎng)基，創(chuàng)造最佳培養(yǎng)條件如供氧、pH等。2、添加可促進(jìn)重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的生長添加劑第69頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四蛋白質(zhì)的復(fù)性：包含體蛋白質(zhì)溶解于變性劑溶液中，呈變性狀態(tài)，所有的氫鍵、疏水鍵全部被破壞，疏水側(cè)鏈完全暴露，但一級(jí)結(jié)構(gòu)和共價(jià)鍵不被破壞，當(dāng)除去變性劑后，一部分蛋白質(zhì)可以自動(dòng)折疊成具有活性的正確構(gòu)型，這一折疊過程稱為蛋白質(zhì)復(fù)性。如何使包涵體的構(gòu)型復(fù)原成正確狀態(tài)？第70頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四包含體的分離及溶解

分離包含體：對(duì)培養(yǎng)收集的細(xì)胞進(jìn)行破碎

(高壓勻漿結(jié)合溶菌酶處理)，然后離心(5000~20000g/r)，可使大部分包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離。洗滌：除去脂類和膜蛋白的包涵體沉淀，一般加去污劑（TritonX-100或脫氧膽酸鈉）和低濃度變性劑（2mol/L尿素或鹽酸胍等）洗滌，以避免包涵體溶解和復(fù)性的過程中重組蛋白質(zhì)的降解。第71頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四溶解：包涵體的溶解必須用很強(qiáng)的變性劑，通過離子間的相互作用破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。以異氰鹽酸胍的增溶效果最強(qiáng)，尿素稍差；去污劑（如SDS）可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白，但由于無法徹底去除而不允許用在制藥行業(yè)中；酸（如70%甲酸）可以破壞蛋白的次級(jí)鍵從而增溶蛋白，這種方法只適合少數(shù)蛋白質(zhì)。第72頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四對(duì)于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶時(shí)應(yīng)加入還原劑（如DTT、GSH、β-ME）打開蛋白質(zhì)中所有二硫鍵，對(duì)于沒有二硫鍵的目標(biāo)蛋白有時(shí)也應(yīng)使用還原劑，因?yàn)楹蜴I的雜蛋白會(huì)影響包涵體的溶解。同時(shí)還應(yīng)加入金屬螯合劑，如EDTA或EGTA，用來螯合Cu2+、Fe3+等金屬離子以防止其與還原狀態(tài)的巰基發(fā)生氧化反應(yīng)。第73頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四蛋白質(zhì)的折疊機(jī)理

目前有多種不同的假設(shè)，但很多學(xué)者認(rèn)為有一個(gè)“熔球態(tài)”的中間狀態(tài)，在“熔球態(tài)”中，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)已經(jīng)基本形成，其空間結(jié)構(gòu)也初具規(guī)模，再做一些局部調(diào)整就可形成正確的立體結(jié)構(gòu)。第74頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四蛋白質(zhì)的具體步驟可用下式描述：伸展態(tài)→中間體→后期中間體→天然態(tài)體→聚集體第75頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四核糖核酸酶的變性和復(fù)性示意圖(A)天然核糖核酸酶(B)變性失活(C)“錯(cuò)亂”核糖核酸酶第76頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四

錯(cuò)誤發(fā)生的機(jī)制①復(fù)性過程中，部分折疊中間體的疏水簇外露，分子間的疏水相互作用會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集；②伸展肽鏈折疊為天然活性結(jié)構(gòu)的過程受到周圍環(huán)境的影響，如溫度、pH值、離子強(qiáng)度、復(fù)性時(shí)間等因素的影響。第77頁，共84頁，2023年，2月20日，星期四不同條件下具體復(fù)性方式1、透析、稀釋和超濾復(fù)性法：最傳統(tǒng)、應(yīng)用最普遍，原理--使變性劑濃度降低到蛋白質(zhì)能恢復(fù)折疊的濃度。

缺點(diǎn)：復(fù)性活性回收率低，而且難與雜蛋白分離。稀釋法大大增加溶液體積，不利于后續(xù)的分離純化，且處理量太大，不利于工業(yè)放大；透析法耗時(shí)長，易形成無活性蛋白質(zhì)聚集體；超濾法在膜上聚集變性，易造成膜污染。第78頁，共84頁，2023年，