微生物的生長與純培養(yǎng)

微生物的生長與純培養(yǎng)第1頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四微生物個體重量的增加和體積增大的現(xiàn)象生長：微生物數(shù)量增多的現(xiàn)象

繁殖：第2頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四一個微生物細胞合適的外界條件，吸收營養(yǎng)物質(zhì)，進行代謝。個體的生長原生質(zhì)的總量（重量、體積、大?。┚筒粩嘣黾尤绻骷毎M分是按恰當?shù)谋壤鲩L時，則達到一定程度后就會發(fā)生繁殖，引起個體數(shù)目的增加。群體內(nèi)各個個體的進一步生長群體的生長第3頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四一、微生物生長的測定微生物特別是單細胞微生物，體積很小，個體的生長很難測定，而且也沒有什么實際應(yīng)用價值。因此，在微生物學(xué)的研究和應(yīng)用中，通常是測定群體的增加量，即群體的生長。測定不同種類、不同生長狀態(tài)微生物的生長情況，需要選用不同的指標。通常對單細胞微生物來說，既可測定細胞數(shù)目，又可測定細胞的質(zhì)量；而對多細胞微生物(尤其是絲狀真菌)，則常以菌絲生長的長度和質(zhì)量等作為生長指標。第4頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四直接計數(shù)法間接計數(shù)法第5頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四（一）直接計數(shù)法1、顯微計數(shù)法

采用血球計數(shù)板置于顯微鏡下進行計數(shù)，將一定稀釋度的細胞懸液加到計數(shù)室中，在顯微鏡下進行計算細胞個數(shù)，每個小室內(nèi)4—5個細胞為宜該方法操作簡便、快速，適用于單細胞的微生物測定，通過染色，可以鑒別活菌和死菌第6頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四血

球

計

數(shù)

法****#####第7頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四2、比濁法

原理：當光線通過微生物菌懸液時，菌體的散射及吸收作用使光線的透過量降低。利用濁度計或比色計測定,得到OD值，與細胞數(shù)量成正比，還可進行平板計數(shù)，對比一定渾濁度所含活菌數(shù)作曲線。適用于菌體分散良好的非菌絲體的單細胞微生物的測定。該方法簡便、快捷、可以連續(xù)測定，適用于發(fā)酵生產(chǎn)過程的監(jiān)測菌體生長情況，被廣泛利用。第8頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四3、平板菌落計數(shù)法是一種常用的活菌計數(shù)法。將被測菌體稀釋到一定濃度，取一定量的稀釋液接種到平板上，培養(yǎng)后可形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落則代表一個細胞，計算菌落數(shù)。根據(jù)稀釋倍數(shù)與吸樣量可推算出細胞數(shù)目。第9頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四一般用9cm的培養(yǎng)皿，每個稀釋度作3個平皿培養(yǎng)，取平均值，通常每個平板長30～300個菌落為宜。平板計數(shù)法可分為兩種：涂布法和傾注法。該方法多用于教學(xué)、科研、食品檢驗，在測定水、土壤、食品、化妝品及其他材料的活菌測定。第10頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四159第11頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四4、干重測定法可用離心法或過濾法測定，一般干重為濕重的10～20%，將待測培養(yǎng)液離心或過濾后，用清水離心洗滌1～5次，進行干燥，然后稱干重。干燥溫度可采用100～105℃烘干或置于真空干燥箱中60～80℃，也可在紅外線烘干，恒重后稱重。注：培養(yǎng)物中除菌體外無其它固體顆粒。若是固體培養(yǎng)物，則可先將其溶化再過濾或離心出菌體。對單、多細胞均適用，是測定菌絲體的常用方法。第12頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四

主要對絲狀真菌生長長度的測定，一般在固體培養(yǎng)基上進行，有兩種方法。將真菌接種在平皿的中央，定時測定菌落的直徑或面積，直到菌落覆蓋整個平皿為止，繪制生長曲線。缺點：不能反映菌絲的縱向生長。5、菌絲長度測定法第13頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四6、液體稀釋法

是一種常用的活菌計數(shù)法。對被測樣品做連續(xù)的10倍系列稀釋。根據(jù)估計數(shù)，從最適宜的3個連續(xù)的10倍稀釋液中各取5ml試樣，接種到3組共15支裝有培養(yǎng)液的度管中（每管接1ml）。經(jīng)培養(yǎng)后，記錄每個稀釋度出現(xiàn)生長的試管數(shù)，然后查最大概率表（MPN），再根據(jù)稀釋倍數(shù)計算出活菌含量。第14頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四

1、測定細胞組分的含量進行估算每種微生物細胞中核酸及蛋白質(zhì)的含量較為恒定，另外ATP的含量也較為穩(wěn)定，所以一般采取以下方法進行間接測定。測定DNA的含量測定蛋白質(zhì)的含量測定ATP的含量（二）間接測定法第15頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四2、從培養(yǎng)基中某營養(yǎng)物的消耗量來估算營養(yǎng)物質(zhì)不能是合成代謝的產(chǎn)物，如磷酸鹽。3、從菌體代謝產(chǎn)物來估算4、從發(fā)酵液的黏度來估算5、從發(fā)酵的放熱量來估算6、從發(fā)酵液的酸堿度來估算在發(fā)酵過程中，微生物的生長及代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，會使體系的PH值發(fā)生一定的變化。第16頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四第17頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四微生物的特點：個體微小肉眼看到或接觸到的微生物是成千上萬個單個的微生物組成的群體。微生物接種是群體接種，接種后的生長是微生物群體繁殖生長。對細菌群體生長規(guī)律的了解是對其進行研究與利用的基礎(chǔ)二、微生物群體的生長規(guī)律第18頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四二、單細胞微生物的生長曲線

多數(shù)細菌的繁殖速度很快。大腸桿菌在適宜的條件下繁殖48h，其子代總重可達2.2×1031g，這是一個巨大的數(shù)字。然而，實際情況是不可能的。那么，細菌的群體生長規(guī)律到底怎樣呢?

第19頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四

將少量單細胞細菌純培養(yǎng)物接種到一恒定容積的新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜的條件下培養(yǎng)，定時取樣測定細胞含量，可以看到以下現(xiàn)象：開始有一短暫時間，細胞數(shù)量并不增加，隨之細胞數(shù)目增加很快，繼而細胞數(shù)又趨穩(wěn)定，最后逐漸下降。

如果以培養(yǎng)時間為橫坐標，以細菌細胞數(shù)目的對數(shù)或生長速度為縱坐標作圖，可以得到一條曲線，稱為生長曲線。第20頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四微生物典型生長曲線總菌數(shù)活菌數(shù)培養(yǎng)時間/h

Ⅱ.對數(shù)期Ⅲ.穩(wěn)定期Ⅳ.衰亡期Ⅰ.延遲期細菌數(shù)目（個/ml）對數(shù)ⅡⅢⅣⅠ

根據(jù)該生長曲線的變化規(guī)律，可將生長曲線大致分為四個時期：

第21頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四（一）延遲期延遲期出現(xiàn)的原因把少數(shù)單細胞微生物接種到新鮮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，細胞并不立即進行分裂繁殖，微生物的增殖數(shù)為０，這時細胞需要合成多種酶，輔酶和某些中間代謝產(chǎn)物，因此要經(jīng)歷一個調(diào)整和適應(yīng)過程。第22頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四

延遲期的特點1、生長速率常數(shù)為零；2、細胞形態(tài)變大或增長；3、細胞內(nèi)的RNA含量增高4、合成代謝十分活躍；5、對外界不良環(huán)境反應(yīng)敏感。影響延遲期長短的因素1.菌種特性；2.接種齡；3.接種量；4.培養(yǎng)基成分第23頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四（二）對數(shù)生長期對數(shù)期的特點

1、活菌數(shù)和總菌數(shù)接近

2、生長速率常數(shù)最大，代時（G）最短

3、細胞進行平衡生長，細胞的化學(xué)組成及形態(tài)，生理特性比較一致

4、酶系活躍，代謝旺盛

該期的微生物生產(chǎn)中多被用做種子和科學(xué)試驗材料第24頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四N2N1t2t1細胞數(shù)/mlnt2-t1

代時:G

=由于二分裂，經(jīng)過n次分裂后，t2時刻的菌N2=N1×2n,即:

lgN2=lgN1+nlg2lg2lgN2-lgN1繁殖代數(shù):n=t2-t1n生長速率常數(shù):R=第25頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四生長速率常數(shù)R：單位時間內(nèi)的繁殖的代數(shù)。代時G:細胞每分裂一次所需的時間。R=1/G第26頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四影響對數(shù)期微生物代時長短的因素菌種營養(yǎng)成分營養(yǎng)物濃度培養(yǎng)溫度第27頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四（三）穩(wěn)定期

穩(wěn)定期的特點

1、生長速率常數(shù)R等于零，活菌數(shù)達到最高峰，并保持相對穩(wěn)定。

2、微生物細胞內(nèi)代謝物積累達到最高峰。

3、芽孢桿菌這時開始形成芽孢。

4、這是產(chǎn)物（菌體或與菌體生長相平行的代謝產(chǎn)物）的最佳收獲時期。

第28頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四穩(wěn)定期到來的原因

1、營養(yǎng)物尤其是生長限制因子的耗盡

2、營養(yǎng)物的比例失調(diào)

3、有害代謝產(chǎn)物的積累

4、pH值等理化條件不適宜生長限制因子:凡處于較低濃度范圍內(nèi)可影響生長速率和菌體產(chǎn)量的某營養(yǎng)物。第29頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四x—為穩(wěn)定時期細胞干重（g/ml培養(yǎng)液）

x0—為剛接種時的細胞干重（g/ml培養(yǎng)液）

c0—為限制性營養(yǎng)物的最初濃度（g/ml）

c—為穩(wěn)定時期限制性營養(yǎng)物的濃度

例：實驗計算產(chǎn)黃青霉的值為1：2.56

表示每2.56克葡萄糖可合成1克菌絲體（干重）在穩(wěn)定期，菌體產(chǎn)量與營養(yǎng)物質(zhì)的消耗之間具一定比例關(guān)系，這一關(guān)系就是生長產(chǎn)量常數(shù)Y（或生長得率）Y=x-x0c0-c=x-x0c0第30頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四（四）衰亡期

衰亡期的特點

1、微生物死亡數(shù)大于增殖數(shù)，活菌數(shù)大大減少，群體衰落

2、細胞出現(xiàn)多形態(tài),大小不等畸形,變成衰退型

3、細胞死亡,出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。

4、有的微生物在此期合成或釋放次生代謝物。

5、芽孢桿菌在此期釋放芽孢。第31頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四衰亡期來臨的原因是外界條件越來越不利于菌體的生長繁殖，從而引起細胞內(nèi)的分解代謝大大超過合成代謝，繼而導(dǎo)致菌體死亡。第32頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四酵母的生長情況與細菌類似菌絲狀微生物（放線菌、霉菌）一般經(jīng)過三個階段：生長停滯期、迅速生長期、衰退期

沒有明顯的對數(shù)生長期第33頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四

三、微生物生長規(guī)律對

工業(yè)生產(chǎn)的指導(dǎo)意義縮短延遲期把握對數(shù)期延長穩(wěn)定期監(jiān)控衰亡期第34頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四縮短延遲期延遲期的存在使發(fā)酵周期延長，生產(chǎn)中為降低成本，提高設(shè)備利用率，需縮短延遲期。酵母菌和細菌延遲期較短，一般需幾小時，霉菌較慢，需十幾小時，而放線菌的延遲期最長?？s短延滯期的方法

1、接種對數(shù)生長期的菌種，采用最適菌齡；

2、加大接種量；

3、在種子培養(yǎng)基中加入某些發(fā)酵培養(yǎng)基的成分。第35頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四

把握對數(shù)期

在需要獲得菌體的發(fā)酵生產(chǎn)中（如酵母菌、單細胞蛋白），則需連續(xù)流加或補加發(fā)酵原料，此時菌體隨營養(yǎng)濃度增加而生長速率上升，從而獲得大量的菌體。第36頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四

延長穩(wěn)定期若獲得初級代謝產(chǎn)物，如氨基酸、乙醇等，這些產(chǎn)物的形成與微生物細胞的形成過程同步，因此在穩(wěn)定期為最佳收獲期。因此必須連續(xù)流加碳源和氮源，移走代謝產(chǎn)物，從而提高產(chǎn)量。若獲得次級代謝產(chǎn)物，如抗生素、維生素、色素等發(fā)酵來說，這些產(chǎn)物的形成與微生物細胞生長過程不同步，形成產(chǎn)物的高峰多在穩(wěn)定期的后期或衰亡期。該類型發(fā)酵同樣需流加營養(yǎng)物質(zhì)，并把握好收獲時間。第37頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四

第38頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四

微生物的分離和純培養(yǎng)第39頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四一、無菌技術(shù)二、微生物的分離方法三、微生物的培養(yǎng)第40頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四一、無菌技術(shù)對微生物進行研究與應(yīng)用時，必須防止被其他微生物污染。無菌技術(shù)：將微生物分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)時防止被其他微生物污染的技術(shù)。1、對使用的器具及培養(yǎng)基的滅菌2、創(chuàng)造無菌環(huán)境

第41頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四二、微生物的分離方法微生物在自然界中不僅分布很廣，而且都是混雜地生活在一起。要想研究或利用某一微生物，必須把混雜的微生物類群分離開來，以得到只含一種微生物的培養(yǎng)。純培養(yǎng)：微生物學(xué)中將在實驗室條件下從一個細胞或一種細胞群繁殖得到的后代稱純培養(yǎng)。純培養(yǎng)的分離，是研究和利用微生物的第一步，是微生物工作中最重要的環(huán)節(jié)之一。第42頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四

獲得純培養(yǎng)最常用的分離方法有：

稀釋分離法平皿劃線法單細胞挑取法

利用選擇培養(yǎng)基法等。第43頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四平皿劃線法將已滅菌的培養(yǎng)基倒入無菌平皿，冷卻凝固后，用接種環(huán)沾取少許待分離的菌，在培養(yǎng)基表面進行平行劃線、扇形劃線、方格劃線或連續(xù)劃線等，微生物將隨著劃線次數(shù)的增加而分散，經(jīng)保溫培養(yǎng)形成菌落。劃線開始的部分細菌分散度小，形成的菌落往往連在一起。由于連續(xù)劃線，微生物逐漸減少，劃到最后，?？尚纬蓡蝹€孤立的菌落。這種單個菌落可能由一個細胞繁殖而來，故可獲得純培養(yǎng)。用其他工具如L形玻璃代替接種環(huán)，在培養(yǎng)基表面涂布，亦可得到同樣結(jié)果。此法較為簡便。第44頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四稀釋分離法液體稀釋法

將待分離的微生物接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后,計數(shù),再將其稀釋到一定程度,使一定體積液體大約只含一個細胞,則取該菌液接種到盛有液體培養(yǎng)基的試管中,靜置,觀察,如果管底只出現(xiàn)一個菌落,則可達到分離目的.

該方法適用于細胞較大的微生物.第45頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四

稀釋倒平板法

這是最常用的純種分離法.

先將待分離的菌體作一系列的稀釋(如1：10、1：100、1：1000、1：10，000……)，然后分別取不同稀釋液少許，與已熔化并冷卻至50℃的瓊脂培養(yǎng)基相混合，搖勻后傾入滅過菌的培養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后，保溫培養(yǎng)一定時間即可出現(xiàn)菌落。如果稀釋得當，平皿上就可出現(xiàn)分散的單個菌落，這個菌落可能就是由一個細胞繁殖形成的。隨后挑取該單個菌落，或重復(fù)以上操作數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)。涂布平板法:

對于某些熱敏感菌、好氧菌來說,采用該方法。把上述已稀釋的樣品滴加入平板表面，用無菌玻璃棒將菌液均勻涂抹于整個平板上，經(jīng)培養(yǎng)后，長出單菌落，獲得純培養(yǎng)。第46頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四第47頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四單細胞挑取法

這種方法是從待分離的材料中挑取一個細胞來培養(yǎng)，從而獲得純培養(yǎng)。具體方法是將顯微挑取器裝置在顯微鏡上，把一滴菌懸液置于載玻片上，用安裝在顯微鏡挑取器上的極細的毛細吸管或顯微針，在顯微鏡下對準某一個單獨的細胞挑取，再接種到培養(yǎng)基上培養(yǎng)。此法需要非常熟練的操作人員，多限于高度專業(yè)化的科學(xué)研究中采用。第48頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四利用選擇培養(yǎng)基法不同微生物需要不同的營養(yǎng)物質(zhì)。主要根據(jù)待分離微生物的特點選擇不同的培養(yǎng)條件.例如在從土壤中篩選蛋白酶產(chǎn)生菌時，可以在培養(yǎng)基中添加牛奶或酪素制備培養(yǎng)基平板，微生物生長時若產(chǎn)生蛋白酶則會水解牛奶或酪素，在平板上形成透明的蛋白質(zhì)水解圈。第49頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四微生物純培養(yǎng)分離方法的比較

稀釋分離法

既可定性，又可定量，用途廣泛

平板劃線法

方法簡便，多用于分離細菌

單細胞挑取法

局限于高度專業(yè)化的科學(xué)研究利用選擇培養(yǎng)基法

適用于分離某些生理類型較特殊的微生物第50頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四三、微生物的培養(yǎng)

（一）好氧培養(yǎng)與厭氧培養(yǎng)1、好氧培養(yǎng)好氧培養(yǎng)一般以空氣作為氧的來源。好氧培養(yǎng)法好氧菌液體培養(yǎng)法好氧菌固體培養(yǎng)法試管斜面、平板茄子瓶搖瓶培養(yǎng)、三角瓶淺層培養(yǎng)臺式發(fā)酵罐實驗室生產(chǎn)實踐好氧菌固體培養(yǎng)法——曲法培養(yǎng)好氧菌液體培養(yǎng)法－－深層液體通風(fēng)培養(yǎng)淺盤液體培養(yǎng)第51頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四2、厭氧培養(yǎng)厭氧培養(yǎng)法厭氧菌固體培養(yǎng)法厭氧菌液體培養(yǎng)法高層瓊脂柱法厭氧培養(yǎng)皿法厭氧罐厭氧手套箱技術(shù)亨蓋特滾管技術(shù)

實驗室生產(chǎn)實踐厭氧菌固體培養(yǎng)法－－堆積培養(yǎng)厭氧菌液體培養(yǎng)法－－液體靜置培養(yǎng)第52頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四通用式發(fā)酵罐構(gòu)造第53頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四臺式發(fā)酵罐第54頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四第55頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四第56頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四第57頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四第58頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四（二）分批培養(yǎng)與連續(xù)培養(yǎng)1、分批培養(yǎng)

將微生物置于一定容積的培養(yǎng)基中，經(jīng)過培養(yǎng)生長，最后一次收獲，此稱分批培養(yǎng)。通過對細菌純培養(yǎng)的生長曲線的分析可知，在分批培養(yǎng)中，培養(yǎng)基一次加入，不予補充，細菌的對數(shù)生長期不可能長時間維持。第59頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四2、連續(xù)培養(yǎng)

如果在培養(yǎng)器中不斷補充新鮮營養(yǎng)物質(zhì)，并及時不斷地以同樣速度排出培養(yǎng)物(包括菌體及代謝產(chǎn)物)，理論上講，對數(shù)生長期就可無限延長。這種方法就叫連續(xù)培養(yǎng)法。連續(xù)培養(yǎng)已成為當前發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展方向。第60頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四2、連續(xù)培養(yǎng)優(yōu)點：縮短發(fā)酵周期；便于自動控制；產(chǎn)物質(zhì)量均一缺點：菌種易退化；易染雜菌第61頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四2、連續(xù)培養(yǎng)(一)恒濁連續(xù)培養(yǎng)

不斷調(diào)節(jié)發(fā)酵液的流入和已發(fā)酵液的流出的流速,而使菌體培養(yǎng)液濁度保持恒定的連續(xù)培養(yǎng)方法叫恒濁連續(xù)培養(yǎng)。在恒濁連續(xù)培養(yǎng)中裝有濁度計，借光電池檢測培養(yǎng)室中的濁度(即菌液濃度)，并由光電效應(yīng)產(chǎn)生的電信號強弱變化，來自動調(diào)節(jié)新鮮培養(yǎng)基流入和培養(yǎng)物流出的流速。

第62頁，共70頁，2023年，2月20日，星期四

當培養(yǎng)基的流速低于微生物生長速度時,菌體密度增高,這時通過光電控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié),可