第5章細(xì)胞融合與單克隆抗體

引言細(xì)胞融合(cellfusion)一、概念又稱體細(xì)胞雜交（somatichybridiazation）、細(xì)胞雜交(cellhybridiazation），在離體條件下用人工的方法把不同類型的細(xì)胞通過無性方式融合成一個(gè)雜合細(xì)胞的技術(shù)。現(xiàn)在是1頁\一共有114頁\編輯于星期四二、細(xì)胞融合的發(fā)展歷史(一)“自發(fā)”細(xì)胞融合現(xiàn)象1838年Muller多核的腫瘤細(xì)胞1858年Virchow正常組織、發(fā)炎組織及腫瘤組織——多核細(xì)胞1873年Luginbuhl天花病人——多核體血細(xì)胞1875年Lange蛙類血液細(xì)胞發(fā)生合并細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是2頁\一共有114頁\編輯于星期四細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是3頁\一共有114頁\編輯于星期四細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是4頁\一共有114頁\編輯于星期四(二)

重要事件1962年,(日)岡田善雄仙臺病毒促細(xì)胞融合70年代,(華裔加籍)高國楠PEG促植物原生質(zhì)體的融合80年代，電融合細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是5頁\一共有114頁\編輯于星期四(三)植物細(xì)胞融合1972年（美）P.S.Carlson——雜種煙草現(xiàn)代植物細(xì)胞融合的開始1978年（德）梅歇爾斯——“pomoto”細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是6頁\一共有114頁\編輯于星期四植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與細(xì)胞融合

(ProtoplastandCellfusion)植物原生質(zhì)體培養(yǎng)植物細(xì)胞融合

細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是7頁\一共有114頁\編輯于星期四(四)

動(dòng)物細(xì)胞融合

動(dòng)物細(xì)胞融合是研究細(xì)胞遺傳信息轉(zhuǎn)移，基因在染色體上的定位以及創(chuàng)造新細(xì)胞株的有效途徑。細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是8頁\一共有114頁\編輯于星期四腫瘤細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞的融合細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是9頁\一共有114頁\編輯于星期四人纖維肉瘤細(xì)胞與小鼠畸胎瘤細(xì)胞融合1978年(瑞士)埃勒門斯(美國)柯路斯細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是10頁\一共有114頁\編輯于星期四人—鼠細(xì)胞融合現(xiàn)在是11頁\一共有114頁\編輯于星期四(五)細(xì)胞融合的誘導(dǎo)誘導(dǎo)融合的方法:物理法:電場刺激、激光、顯微操作化學(xué)法:聚乙二醇(PEG)結(jié)合高pH、高鈣離子法生物法:仙臺病毒細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是12頁\一共有114頁\編輯于星期四不同細(xì)胞融合的條件及其主要應(yīng)用來源前處理融合方法主要應(yīng)用動(dòng)物細(xì)胞不需仙臺病毒、PEG、電融合生產(chǎn)單克隆抗體植物細(xì)胞脫壁PEG、電融合創(chuàng)造植物新品種微生物細(xì)胞脫壁PEG高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新菌種細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是13頁\一共有114頁\編輯于星期四1、仙臺病毒誘導(dǎo)仙臺病毒(Sendalvirus)也稱日本血凝病毒HVJ，屬粘病毒副流感類群，是RNA病毒，多型顆粒狀，易在小鼠中蔓延。細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是14頁\一共有114頁\編輯于星期四融合的可能機(jī)制：

病毒被膜含有糖蛋白，其表面還分布有許多具有神經(jīng)氨酸酶和凝血活性的突起，神經(jīng)氨酸酶可降解細(xì)胞膜上的糖蛋白，使細(xì)胞膜局部凝集，再通過膜上蛋白質(zhì)分子的重新分布，使膜中的脂類分子重排，而打開質(zhì)膜，導(dǎo)致細(xì)胞融合。細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是15頁\一共有114頁\編輯于星期四融合過程：1.病毒顆粒附著細(xì)胞膜上起搭橋作用，使細(xì)胞粘著成堆，在4℃冰浴中細(xì)胞緊密靠近，但不發(fā)生融合。2.37℃溫浴后，粘結(jié)部位的細(xì)胞膜破壞，形成通道，細(xì)胞質(zhì)流通、融匯。3.病毒顆粒進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，此時(shí)兩個(gè)細(xì)胞合并、變圓，完成融合，全過程約15～30分鐘。4.細(xì)胞核也相互合并,完成細(xì)胞融合細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是16頁\一共有114頁\編輯于星期四2、PEG誘導(dǎo)PEG——聚乙二醇(polyethyleneglycol)商品名：卡波蠟(carbowax)多聚化合物，分子式H(OCH2·CH2)nOH實(shí)驗(yàn)室用PEG平均分子量在200－20,000一般：<1,000——液體

>1,000——固體常用分子量：4000—6000細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是17頁\一共有114頁\編輯于星期四聚乙二醇（PEG）法細(xì)胞融合過程現(xiàn)在是18頁\一共有114頁\編輯于星期四融合的可能機(jī)制？脫水作用能使細(xì)胞凝聚，并使膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化？改變膜表面電荷或膜電位，而導(dǎo)致膜上蛋白質(zhì)顆粒聚集及膜脂分子隨之發(fā)生重排之故。

？細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是19頁\一共有114頁\編輯于星期四★融合機(jī)制種種1）“脂無序”模型Lucy，1970-19752）Ca2+誘導(dǎo)的側(cè)向“相分離”模型Papahadjopoulos19783）六角形HII構(gòu)象與膜融合CullisandHope19784）Ca2+誘導(dǎo)局部脫水與膜融合WilschutandHoekstra19845）滲透模型與膜融合Lucy19866）質(zhì)子泵驅(qū)動(dòng)膜融合劉樹森1986

膜融合過程大體概括為兩大階段：首先是兩膜脂相互聚合和接觸，其次是接觸部位的局部脫水，形成不穩(wěn)定中間結(jié)構(gòu)，使膜脂發(fā)生混合而最終導(dǎo)致膜的融合?，F(xiàn)在是20頁\一共有114頁\編輯于星期四顯微鏡下細(xì)胞融合過程現(xiàn)在是21頁\一共有114頁\編輯于星期四細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是22頁\一共有114頁\編輯于星期四初步分析

可能是由于帶有大量負(fù)電荷的PEG分子和原生質(zhì)體表面的負(fù)電荷間，在鈣離子的連接下形成靜電鍵，促使異源的原生質(zhì)體間的粘著和結(jié)合，在高pH、高鈣離子溶液的作用下，將鈣離子和與質(zhì)膜結(jié)合的PEG分子洗脫，導(dǎo)致電荷平衡失調(diào)并重新分配，使兩種原生質(zhì)體上的正負(fù)電荷連接起來，進(jìn)而形成具有共同質(zhì)膜的融合體。細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是23頁\一共有114頁\編輯于星期四PEG誘導(dǎo)過程注意事項(xiàng)：

控制與分子量、濃度和處理時(shí)間懸浮法：將細(xì)胞懸于40～50％的PEG4000進(jìn)行融合，處理1～2分鐘為宜。離心法：先將細(xì)胞混合物懸于30～40％的PEG4000，再離心進(jìn)行融合，則可適當(dāng)延長融合時(shí)間，以5～8分鐘為宜。細(xì)胞融合(cellfusion)pH值以pH7.4～8.0為宜，或略偏堿性pH8.0～8.2。

輔以5～15％的DMSO或在融合前用PHA處理一下，效

果更好?，F(xiàn)在是24頁\一共有114頁\編輯于星期四PEG融合法優(yōu)點(diǎn)

效率高材料方便，操作簡易效果穩(wěn)定PEG融合法缺點(diǎn)

對細(xì)胞有毒性細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是25頁\一共有114頁\編輯于星期四3、物理電融合誘導(dǎo)機(jī)制在直流電脈沖的誘導(dǎo)下,原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位變化,使原生質(zhì)體粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂,進(jìn)而質(zhì)膜開始連接,直到閉合成完整的細(xì)胞融合體細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是26頁\一共有114頁\編輯于星期四電融合誘導(dǎo)法原理示意圖細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是27頁\一共有114頁\編輯于星期四電融合優(yōu)點(diǎn)：融合效率高，可達(dá)50～80％產(chǎn)生雜交細(xì)胞的頻率高，是PEG法的100倍。

操作簡便、穩(wěn)定，但需設(shè)備。對細(xì)胞無毒害作用?？稍陲@微鏡下觀察操作。細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是28頁\一共有114頁\編輯于星期四融合率融合細(xì)胞的細(xì)胞核總數(shù)視野內(nèi)全部細(xì)胞的細(xì)胞核總數(shù)

×100％融合率=細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是29頁\一共有114頁\編輯于星期四4、植物細(xì)胞融合基本過程去除細(xì)胞壁以獲得大量的原生質(zhì)體誘導(dǎo)細(xì)胞融合形成雜種細(xì)胞細(xì)胞相互靠近形成細(xì)胞橋–最關(guān)鍵的一步胞質(zhì)滲透細(xì)胞核融合篩選,培養(yǎng),促進(jìn)細(xì)胞分裂,分化,從細(xì)胞團(tuán),愈傷組織到最后成株細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是30頁\一共有114頁\編輯于星期四5、動(dòng)物細(xì)胞融合基本過程動(dòng)物單個(gè)細(xì)胞的獲得組織的獲得組織的消化誘導(dǎo)細(xì)胞融合形成雜種細(xì)胞篩選，培養(yǎng)細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是31頁\一共有114頁\編輯于星期四細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是32頁\一共有114頁\編輯于星期四植物體細(xì)胞雜交和動(dòng)物細(xì)胞融合的比較比較項(xiàng)目植物體細(xì)胞雜交動(dòng)物細(xì)胞融合細(xì)胞融合的原理細(xì)胞膜的流動(dòng)性、植物細(xì)胞全能性細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞融合的方法去處細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合誘導(dǎo)方法物理（顯微操作、電融合）化學(xué)（聚乙二醇）物理、化學(xué)方法（同左）滅活的病毒用途獲得雜種植株制備單克隆抗體細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是33頁\一共有114頁\編輯于星期四6、影響細(xì)胞融合的因素親本細(xì)胞表面性質(zhì)，表面覆蓋絨毛而不規(guī)則者較易融合；表面光滑者較難融合。(2)細(xì)胞種類不同，融合效果不同，如腹水癌及株化細(xì)胞較易

融合，而淋巴細(xì)胞或血球細(xì)胞幾乎不融合。(3)細(xì)胞融合時(shí)需要適宜溫度和運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。如仙臺病毒誘導(dǎo)歐

利希氏腹水癌細(xì)胞融合時(shí)，于37℃振搖時(shí)易于融合，且

融合效率與病毒量呈正比。但在34℃振搖則融合率下降。

在37℃時(shí)不振搖則幾乎不融合。細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是34頁\一共有114頁\編輯于星期四(4)細(xì)胞融合過程中，通常耗氧量較大．缺氧時(shí)經(jīng)常不融合?？諝庵泻趿看笥?0％時(shí)有一定融合率，但有些細(xì)胞在無氧條件下也可融合。(5)有些細(xì)胞融合時(shí)需要Ca2+，否則不融合，細(xì)胞蛋白質(zhì)亦發(fā)生

變化。實(shí)驗(yàn)表明Sr2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+等離子可代替Ca2+．但有效濃度較Ca2+大的多。融合時(shí)最適合的離子強(qiáng)度

一般為0.1mol/L(6)最適合的pH為7．4—7．8之間，在此范圍之外，融合率均較

低。細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是35頁\一共有114頁\編輯于星期四7、融合細(xì)胞的特征及其意義染色體組不穩(wěn)定，尤其種間雜交細(xì)胞,培養(yǎng)過程中染色體會(huì)逐漸丟失 細(xì)胞融合(cellfusion)理論研究——基因定位和繪制基因圖工作中十分有用應(yīng)用價(jià)值——單克隆抗體、植物育種現(xiàn)在是36頁\一共有114頁\編輯于星期四細(xì)胞融合(cellfusion)1進(jìn)行基因定位，繪制人類基因圖

家系分析法、細(xì)胞融合法、基因劑量效應(yīng)法、重組DNA法、分子雜交法、限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)、脈沖電泳法（PEGE）2誘導(dǎo)PC染色體3體細(xì)胞雜種的致瘤性分析4遺傳缺陷的基因互補(bǔ)5分化功能表達(dá)調(diào)控的研究6淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體7植物細(xì)胞的原生質(zhì)體融合培育雜種植株8核質(zhì)相互作用關(guān)系9基因治療10疾病診斷現(xiàn)在是37頁\一共有114頁\編輯于星期四8、融合細(xì)胞類型同核體（homokaryon）異核體(heterokaryon）多核體（polykaryon）異胞質(zhì)體(heterocybrid)細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是38頁\一共有114頁\編輯于星期四

同核體(homokaryon)同源細(xì)胞的融合體。由于是同源細(xì)胞，它們的基因型及表現(xiàn)型完全一樣。細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是39頁\一共有114頁\編輯于星期四異核體(heterokaryon)

非同源細(xì)胞的融合體。一般是親源關(guān)系較近的細(xì)胞，這種親和雜種細(xì)胞含有雙親全部細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)，其發(fā)育的個(gè)體也是可育的，如煙草屬種間的細(xì)胞雜種。細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是40頁\一共有114頁\編輯于星期四多核體(polykaryon)

含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體。親源關(guān)系較遠(yuǎn)的細(xì)胞間融合，融合體以一個(gè)細(xì)胞的核物質(zhì)為主，只加入另一細(xì)胞少量遺傳物質(zhì)，如胡蘿卜與羊角芹形成部分親和的雜種細(xì)胞。細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是41頁\一共有114頁\編輯于星期四異胞質(zhì)體(heterocybrid)

不同胞質(zhì)來源。用射線或細(xì)胞松弛素B處理一親本細(xì)胞，使其選擇性地丟失核基因形成一個(gè)無核的亞原生質(zhì)體，再與一個(gè)有核的原生質(zhì)體融合，獲得一個(gè)完整的原生質(zhì)體與另一親本的細(xì)胞質(zhì)融和的異胞質(zhì)體。細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是42頁\一共有114頁\編輯于星期四9、雜種細(xì)胞篩選方法（1）遺傳互補(bǔ)篩選法（2）抗性互補(bǔ)篩選法（3）生長特性篩選法（4）物理特性篩選法細(xì)胞融合(cellfusion)現(xiàn)在是43頁\一共有114頁\編輯于星期四5.1.1雜交瘤單克隆抗體技術(shù)的原理5.1.2雜交瘤制備過程5.1.3單克隆抗體的大量制備5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是44頁\一共有114頁\編輯于星期四免疫系統(tǒng)

由淋巴器官、組織、細(xì)胞共同構(gòu)成。免疫器官：中樞免疫器官：骨髓、胸腺、（鳥、禽）法氏囊外周免疫器官：淋巴結(jié)、脾、扁桃體等免疫細(xì)胞：造血干細(xì)胞、淋巴細(xì)胞（T、B、NK）、白細(xì)胞等。免疫分子：抗體、補(bǔ)體、細(xì)胞因子、干擾素等。5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是45頁\一共有114頁\編輯于星期四胸腺骨髓中樞淋巴器官外周淋巴器官扁桃體，淋巴結(jié)淋巴結(jié)脾淋巴管腸系膜淋巴結(jié)現(xiàn)在是46頁\一共有114頁\編輯于星期四T細(xì)胞和B細(xì)胞的分化5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是47頁\一共有114頁\編輯于星期四T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答一、抗原的識別與遞呈（感應(yīng)階段）二、反應(yīng)階段三、效應(yīng)階段四、細(xì)胞免疫的生物學(xué)效應(yīng)5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是48頁\一共有114頁\編輯于星期四一、抗原的識別與遞呈（感應(yīng)階段）（一）APC對抗原的遞呈（二）T細(xì)胞的雙識別5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是49頁\一共有114頁\編輯于星期四抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presentingcell)一種特殊類型的細(xì)胞，攜帶細(xì)胞表面MHC（主要組織相容性復(fù)合體）II類分子，涉及抗原的加工和呈遞給輔助T細(xì)胞。

5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是50頁\一共有114頁\編輯于星期四5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是51頁\一共有114頁\編輯于星期四T細(xì)胞活化的第一信號二、反應(yīng)階段由TCR識別并結(jié)合抗原性多肽傳遞抗原信號；CD4、CD8分子分別識別MHC-II類和MHC-I類分子。5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是52頁\一共有114頁\編輯于星期四T細(xì)胞活化的第二信號又稱協(xié)同刺激信號，由眾多協(xié)同刺激分子與相應(yīng)受/配體結(jié)合介導(dǎo)，主要是B7/CD28分子對之間的作用。5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是53頁\一共有114頁\編輯于星期四T細(xì)胞在雙信號的激發(fā)下，表達(dá)細(xì)胞因子及相應(yīng)受體，進(jìn)一步促進(jìn)T細(xì)胞活化、增殖。若TCR特異性識別并結(jié)合抗原肽的過程中缺乏協(xié)同刺激信號，則T細(xì)胞被誘導(dǎo)呈不應(yīng)答。5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是54頁\一共有114頁\編輯于星期四（三）T細(xì)胞的增殖和分化CD4+TH分化為：

TH1CD8+CTL（TC)分化為：有殺傷效應(yīng)的CTL（TC)5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是55頁\一共有114頁\編輯于星期四Tc殺傷細(xì)胞5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是56頁\一共有114頁\編輯于星期四細(xì)胞免疫應(yīng)答5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是57頁\一共有114頁\編輯于星期四體液免疫應(yīng)答

5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是58頁\一共有114頁\編輯于星期四抗原：一類能夠刺激動(dòng)物機(jī)體的免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)發(fā)生免疫

應(yīng)答，產(chǎn)生體液免疫的抗體和（或）細(xì)胞免疫的效

應(yīng)淋巴細(xì)胞，并在體內(nèi)外與之反應(yīng)的物質(zhì)。

5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是59頁\一共有114頁\編輯于星期四能起抗原作用的各類物質(zhì)必須具備如下特性：(1)外源性機(jī)體以往從未接觸過的外源異物或異體；(2)結(jié)構(gòu)性分子量在10，000以上的大小，分子表面有穩(wěn)定

的環(huán)狀結(jié)構(gòu)基團(tuán)(而非線狀基團(tuán))作為識別點(diǎn)；(3)特異性由于抗原有不同的決定簇，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體與

抗原間的反應(yīng)是特異性的。5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是60頁\一共有114頁\編輯于星期四抗體：在對抗原刺激的免疫應(yīng)答中，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一

類糖蛋白,能與相應(yīng)抗原特異的結(jié)合，產(chǎn)生各種

免疫效應(yīng)（生理效應(yīng)）的球蛋白。5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是61頁\一共有114頁\編輯于星期四抗體(Ig):（Immunoglobulin)抗體分類：

IgG、

IgA、

IgM、

IgD、

IgE抗體結(jié)構(gòu)5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是62頁\一共有114頁\編輯于星期四人體內(nèi)的五種抗體現(xiàn)在是63頁\一共有114頁\編輯于星期四

抗體作用的機(jī)理中和反應(yīng)聚集反應(yīng)沉淀反應(yīng)補(bǔ)體活化5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是64頁\一共有114頁\編輯于星期四

每個(gè)B淋巴細(xì)胞只能產(chǎn)生一種針對它能夠識別的特異性抗原決定簇的抗體，而由這一個(gè)細(xì)胞通過有絲分裂繁殖形成的細(xì)胞群稱為“克隆”，由這一個(gè)克隆系產(chǎn)生的抗體稱為單克隆抗體(monoclonalantibody)。5.1單克隆抗體技術(shù)一種抗原通常具有多個(gè)不同的抗原決定族，因此能刺激多個(gè)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的單克隆抗體，因此血清中的抗體是針對不同抗原決定族的單克隆抗體混合物，稱為多克隆抗體。

現(xiàn)在是65頁\一共有114頁\編輯于星期四單克隆抗體技術(shù)的基本原理

Kohler和Milstein于1975年將正常淋巴細(xì)胞（如小鼠脾細(xì)胞）、瘤細(xì)胞（如骨髓瘤）兩種細(xì)胞雜交而創(chuàng)立了單克隆抗體技術(shù)，獲1984年諾貝爾獎(jiǎng)。5.1單克隆抗體技術(shù)GeorgesJ.F.Kohler

CésarMilstein利用細(xì)胞融合技術(shù)，將已免疫過的B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，在由此形成的單個(gè)雜種細(xì)胞中，B細(xì)胞提供產(chǎn)生單一型抗體的遺傳信息，瘤細(xì)胞提供連續(xù)增殖的遺傳信息。因此這種雜種細(xì)胞既能產(chǎn)生抗體又能無限繁殖?，F(xiàn)在是66頁\一共有114頁\編輯于星期四1.單克隆抗體技術(shù)優(yōu)勢隨著在研究上應(yīng)用日益廣泛，對抗體的數(shù)量和質(zhì)量（專一性）要求越來越高數(shù)量多:傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物馬,兔等免疫不方便質(zhì)量高:大動(dòng)物免疫難以做到單克隆用細(xì)胞融合技術(shù)獲得單克隆抗體綜合了兩方面優(yōu)勢：淋巴細(xì)胞腫瘤:能不斷增殖，沒有產(chǎn)生專一抗體能力。從脾臟得到淋巴細(xì)胞:能產(chǎn)生專一抗體，不能不斷增殖。5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是67頁\一共有114頁\編輯于星期四

高度均一性：純度很高的均一性抗體

高度專一性：只對抗原分子上某一抗原決定簇起反應(yīng)

大量產(chǎn)生及穩(wěn)定性：雜交瘤細(xì)胞能在體內(nèi)外無限繁殖之傳代

2單克隆抗體的特性5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是68頁\一共有114頁\編輯于星期四5.1單克隆抗體技術(shù)單克隆抗體(monoclonalantibody，簡稱McAb)：將能夠產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞和具有無限增殖力的骨髓瘤細(xì)胞融合在一起，形成雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞既能在體外快速生長，又能持續(xù)分泌成分單一的特異性抗體。這種單一類型的只針對某一特定抗原決定簇的抗體分子，就是單克隆抗體?，F(xiàn)在是69頁\一共有114頁\編輯于星期四3親本細(xì)胞的選擇

骨髓瘤細(xì)胞：1.本身不能分泌抗體2.選擇次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷型（HGPRT-）或者胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）的骨髓瘤細(xì)胞5.1單克隆抗體技術(shù)

B淋巴細(xì)胞：1.經(jīng)特定抗原免疫能產(chǎn)生目的抗體的動(dòng)物淋巴細(xì)胞2.免疫動(dòng)物種系要與骨髓瘤細(xì)胞系一致或有相近親源關(guān)系現(xiàn)在是70頁\一共有114頁\編輯于星期四4融合細(xì)胞的選擇原理1964年Litterlefield——HAT培養(yǎng)基

H—Hypoanthine次黃嘌呤

A—Aminopterin氨基喋呤

T—Thymidine胸腺嘧啶脫氧核苷5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是71頁\一共有114頁\編輯于星期四原理：

正常及普通癌細(xì)胞不但具有利用培養(yǎng)液中的谷氨酰胺和尿核苷單磷酸合成DNA的能力，而且當(dāng)這條主要途徑被氨基喋呤（A）阻斷時(shí)，還具有利用培養(yǎng)液中現(xiàn)成的次黃嘌呤（H）和胸腺嘧啶脫氧核苷（T）在次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）的作用下，借此應(yīng)急通路來合成DNA的能力。5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是72頁\一共有114頁\編輯于星期四嘌呤合成通路的阻斷現(xiàn)在是73頁\一共有114頁\編輯于星期四細(xì)胞內(nèi)DNA的生物合成途徑主要生物合成途徑應(yīng)急補(bǔ)救途徑氨基喋呤A次黃嘌呤次黃嘌呤核苷酸HGPRT+TK+胸腺嘧啶胸腺嘧啶脫氧核苷酸DNA5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是74頁\一共有114頁\編輯于星期四5.1.2雜交瘤技術(shù)過程免疫動(dòng)物融合細(xì)胞的制備兩種細(xì)胞雜交融合分裝培養(yǎng)、篩選抗體檢測雜交瘤細(xì)胞的克隆凍存及單克隆的大量生產(chǎn)5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是75頁\一共有114頁\編輯于星期四一、免疫動(dòng)物目的：在細(xì)胞融合后獲得盡可能多的分泌針對于該目標(biāo)抗原的特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞.特定目標(biāo)抗原動(dòng)物免疫脾臟中B淋巴細(xì)胞B淋巴細(xì)胞大量增殖刺激能分泌針對于該抗原的特異性抗體5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是76頁\一共有114頁\編輯于星期四常規(guī)免疫法脾內(nèi)一次性免疫法短程免疫法體外免疫法常用免疫方法：穩(wěn)妥；優(yōu)勢克隆省時(shí)；省抗原省時(shí)操作繁瑣5.1單克隆抗體技術(shù)體外法：直接提取大、小鼠淋巴細(xì)胞，調(diào)整為107個(gè)/ml，加適當(dāng)濃度抗原，3－4天后，收集被刺激的淋巴細(xì)胞。體內(nèi)法：對細(xì)胞或微生物抗原可直接注射如小鼠體內(nèi)，可溶性蛋白抗原可與等量的福氏完全佐劑混合乳化后，注入到動(dòng)物體內(nèi)。3－4天后，在無菌條件下可以取出脾或淋巴結(jié)制成懸液，存活率在95％以上的可以用于融合?，F(xiàn)在是77頁\一共有114頁\編輯于星期四常規(guī)免疫法：第1次免疫：抗原+弗氏完全佐劑第2次免疫：抗原+弗氏不完全佐劑第3次免疫：抗原不加佐劑第4次免疫：抗原不加佐劑(皮下注射或靜脈注射)(皮下注射)(皮下注射)(靜脈注射)5.1單克隆抗體技術(shù)皮下注射腹腔注射靜脈注射免疫途徑：現(xiàn)在是78頁\一共有114頁\編輯于星期四二.融合細(xì)胞的制備

脾淋巴細(xì)胞的制備：

1.放血致死免疫的小鼠，無菌操作取脾臟，去胞膜；

2.用RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)液清洗后，放在盛10ml培養(yǎng)液的

平皿的雙層銅網(wǎng)上；

3.用注射器內(nèi)玻璃管將脾淋巴細(xì)胞輕輕擠壓到培養(yǎng)液中；

4.計(jì)數(shù)后將細(xì)胞液裝入加蓋離心管置冰箱備用5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是79頁\一共有114頁\編輯于星期四骨髓瘤細(xì)胞的制備：多用BALB/C小鼠的骨髓瘤細(xì)胞。現(xiàn)在是80頁\一共有114頁\編輯于星期四骨髓瘤細(xì)胞的制備制備過程：1.主要源于P3-Nsl-Ag4等骨髓瘤細(xì)胞系2.選擇形態(tài)好的骨髓瘤細(xì)胞，0.2%臺盼藍(lán)染液，計(jì)數(shù)3.1500rpm離心，棄上清液，加培養(yǎng)液清洗后再次離心注：在準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞。保證骨髓瘤細(xì)胞處于對數(shù)生長期，良好的形態(tài)，

活細(xì)胞計(jì)數(shù)高于95%，也是決定細(xì)胞融合的關(guān)鍵5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是81頁\一共有114頁\編輯于星期四三.兩種細(xì)胞雜交融合1.按4:1-10:1的比例將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞混勻于同一個(gè)離心管中；2.離心，棄上清液.3.置于是37℃水浴中，搖動(dòng)離心管逐滴加入的50%PEG，1分鐘內(nèi)完成，水浴中繼續(xù)搖動(dòng)1-2分鐘；4.沿管壁加入10ml培養(yǎng)液，混勻稀釋PEG，終止其誘導(dǎo)作用；1000rpm

迅速離心1分鐘，棄上清液。5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是82頁\一共有114頁\編輯于星期四四.分裝培養(yǎng)：HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞1.離心后的混合細(xì)胞中加入HAT培養(yǎng)液，使?jié)舛冗_(dá)到2*105個(gè)

細(xì)胞/0.1ml培養(yǎng)液2.按每孔0.1ml細(xì)胞稀釋液加入96孔培養(yǎng)板中，加蓋密封后置5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)3.次日檢查有無污染，若正常，換液（HAT培養(yǎng)液），以后隔

日一換4.兩周后改用HT培養(yǎng)液，換3-5次后改用D-15培養(yǎng)液培養(yǎng)未融

合的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞5-6天后逐漸死亡5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是83頁\一共有114頁\編輯于星期四通過選擇性培養(yǎng)后生長的雜交瘤細(xì)胞，僅有部分是分泌預(yù)定特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞?？扇∩锨逡?，根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體類型及所需靈敏度等具體情況來加以選擇。可溶性抗原可采用放射免疫、免疫酶標(biāo)測定、間接血凝等方法測定。細(xì)胞抗原可采用免疫熒光、51Cr釋放試驗(yàn)、溶血空斑測定、補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒等方法直接測定針對這些抗原的抗體。五.雜交瘤細(xì)胞的篩選和克隆化5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是84頁\一共有114頁\編輯于星期四融合后細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中存活情況脾細(xì)胞（HGPRT+,TK+,不能長期生長）骨髓瘤細(xì)胞（HGPRT-,TK-，不能生長）雜交瘤細(xì)胞（HGPRT+,TK+

，能夠生長）5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是85頁\一共有114頁\編輯于星期四細(xì)胞融合的選擇示意圖現(xiàn)在是86頁\一共有114頁\編輯于星期四抗體檢測抗原結(jié)合法用125I放射性元素標(biāo)記的抗原第二抗體法-酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）熒光活化細(xì)胞分類器法5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是87頁\一共有114頁\編輯于星期四利用培養(yǎng)基對單抗進(jìn)行鑒定的過程現(xiàn)在是88頁\一共有114頁\編輯于星期四酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)抗原第1抗體酶第2抗體待檢雜交瘤培養(yǎng)上清液底物有色產(chǎn)物酶標(biāo)儀檢測技術(shù)原理：5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是89頁\一共有114頁\編輯于星期四單克隆抗體的純化硫酸銨沉淀法離子交換層析

A蛋白-Sepharose親和層析5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是90頁\一共有114頁\編輯于星期四利用單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)選育出遺傳穩(wěn)定的分泌特異抗體的細(xì)胞系。在培養(yǎng)過程中，一般要加能釋放某些生長因子促進(jìn)雜交瘤生長的飼養(yǎng)細(xì)胞，如小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞或胸腺細(xì)胞等。方法有有限稀釋法、軟瓊脂培養(yǎng)法、顯微操作法、應(yīng)用熒光激活分選儀等。培養(yǎng)上清中X抗體的檢測克隆化培養(yǎng)單克隆雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中X抗體的檢測雜交瘤細(xì)胞可持續(xù)分泌單克隆抗體規(guī)?；囵B(yǎng)獲得大量單克隆抗體5.1單克隆抗體技術(shù)六、雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)現(xiàn)在是91頁\一共有114頁\編輯于星期四有限稀釋法通過適當(dāng)?shù)南♂屵_(dá)到分離單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的目的1）取出陽性孔內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)2）用培液將其稀釋到例如每毫升內(nèi)10個(gè)細(xì)胞。3）如果在96孔板內(nèi)每孔加0.1ml，其機(jī)率將為每孔內(nèi)落入一個(gè)細(xì)胞。4）加入一定數(shù)量的飼養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)過8~12天后，可觀察到有集落生長的孔。5）根據(jù)檢測的陽性結(jié)果再次進(jìn)行克隆化?，F(xiàn)在是92頁\一共有114頁\編輯于星期四軟瓊脂培養(yǎng)法在加入飼養(yǎng)細(xì)胞的無菌平皿內(nèi)鋪上一層0.5％的瓊脂，待凝固后再鋪上一層混有雜交瘤細(xì)胞的0.25％的軟瓊脂。待細(xì)胞長成集落后，用毛細(xì)管吸出移種于含飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板內(nèi)?，F(xiàn)在是93頁\一共有114頁\編輯于星期四體內(nèi)：BALB/c小鼠體內(nèi)誘發(fā)含有單抗的腹水

體外：無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)等七、凍存及單克隆的大量生產(chǎn)現(xiàn)在是94頁\一共有114頁\編輯于星期四單克隆抗體的規(guī)?；a(chǎn)

雜交瘤細(xì)胞直接植入動(dòng)物體內(nèi)：1.將106-107的單克隆雜交瘤細(xì)胞，由皮下植入同系或組織相容正常的小鼠的體內(nèi)，約過兩周后，在小鼠的皮下形成相應(yīng)的移植性腫瘤，用這些腫瘤再去接種更多的小鼠。2.在腫瘤出現(xiàn)后的一段時(shí)期，通過多次采血得到含單克隆抗體的血清，每ml血清內(nèi)約含1-10ml的抗體，但取血量有限。3.因此，可將相同數(shù)量的單克隆抗體細(xì)胞植入在3-10天前經(jīng)腹腔注射0.5ml異十八烷或其它礦物油的初次致敏的小鼠腹腔內(nèi)。在接種后的二周左右的時(shí)間內(nèi)，經(jīng)穿刺而得到5-10ml的腹水，內(nèi)含單克隆抗體的濃度5-20mg/ml5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是95頁\一共有114頁\編輯于星期四單抗的大規(guī)模生產(chǎn)1）誘生腹水將穩(wěn)定分泌單抗的細(xì)胞株，通過擴(kuò)大培養(yǎng)，接種于Balb/c小鼠腹腔內(nèi)，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔內(nèi)增殖，從而得到大量含單抗的腹水。方法是將降植烷或石蠟油注入Balb/c小鼠腹腔，0.5ml/只，7天后腹腔接種3~5×106

雜交瘤細(xì)胞。10~20天后即可抽取腹水，每毫升腹水中約含1~10mg單抗。2）利用微載體、微囊、旋轉(zhuǎn)瓶、中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)等進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。3）生物反應(yīng)器培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)單抗現(xiàn)在是96頁\一共有114頁\編輯于星期四

生產(chǎn)技術(shù)現(xiàn)狀：現(xiàn)在的生物技術(shù)公司一般采用生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)的方法生產(chǎn)單克隆抗體。由于雜交瘤細(xì)胞的高密度生長，使得抗體效價(jià)可達(dá)到10~100mg/ml。美國Damon公司的專利方法是將細(xì)胞培養(yǎng)在一種中空的微球體內(nèi)，這種被稱之為微囊的微球體外面由多孔膜包裹，使內(nèi)部生長的雜交瘤細(xì)胞受到多層保護(hù)而不受環(huán)境影響。此種微囊技術(shù)生產(chǎn)的抗體可達(dá)0.1-1g/L?？贵w的生產(chǎn)達(dá)到一定的規(guī)模。5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是97頁\一共有114頁\編輯于星期四動(dòng)物免疫細(xì)胞融合混合細(xì)胞的HAT篩選)分泌X抗體B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞X抗原B淋巴細(xì)胞瘤的突變株培養(yǎng)數(shù)天后細(xì)胞死亡無限生長細(xì)胞分泌X抗體只有雜交瘤細(xì)胞可長期存活下來BALB/c培養(yǎng)上清中X抗體的檢測克隆化培養(yǎng)單克隆雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中X抗體的檢測雜交瘤細(xì)胞可持續(xù)分泌單克隆抗體規(guī)?；囵B(yǎng)獲得大量單克隆抗體雜交瘤技術(shù)操作流程圖解現(xiàn)在是98頁\一共有114頁\編輯于星期四影響因素分析（一）污染（二）融合后雜交瘤不生長

PEG有毒性或作用時(shí)間過長 牛血清的質(zhì)量差，用前未嚴(yán)格篩選 骨髓瘤細(xì)胞污染了支原體

HAT有問題（A過高或HT含量不足）5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是99頁\一共有114頁\編輯于星期四（三）雜交瘤細(xì)胞不分泌抗體或停止分泌抗體

HAT中A失效或骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生突變，變成A

抵抗細(xì)胞所致 有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好 細(xì)胞支原體污染，或非抗體分泌細(xì)胞克隆競爭性生長，從而抑制了抗體分泌細(xì)胞的生長；也可能發(fā)生染色體丟失。5.1單克隆抗體技術(shù)現(xiàn)在是100頁\一共有114頁\編輯于星期四5.2.1EB病毒轉(zhuǎn)化技術(shù)5.2.2細(xì)胞工程單克隆抗體技術(shù)5.2.3人單抗制備技術(shù)的發(fā)展5.2人源性單克隆抗體制備現(xiàn)在是101頁\一共有114頁\編輯于星期四5.2人源性單克隆抗體制備主要困難（1）缺乏合適的人骨髓瘤細(xì)胞株作為融合親本?，F(xiàn)有的細(xì)胞株大多是融合率不高，雜交瘤抗體產(chǎn)生水平低，而且細(xì)胞不穩(wěn)定，易喪失抗體分泌能力；（2）獲得抗原特異的人B淋巴細(xì)胞十分困難，因?yàn)閷θ藖碚f，高度免疫獲得抗原特異的B淋巴細(xì)胞的方法顯然是不可行的；（3）大量繁殖雜交瘤細(xì)胞以獲得所需量的抗體，鼠類雜交瘤可通過小鼠腹腔接種雜交瘤細(xì)胞誘生腹水達(dá)到這一目的，但是人雜交瘤細(xì)胞在鼠類中誘生腹水是很困難的?，F(xiàn)在是102頁\一共有114頁\編輯于星期四現(xiàn)在是103頁\一共有114頁\編輯于星期四5.2.1EB病毒轉(zhuǎn)化技術(shù)Steinitz(1977）首先報(bào)道利用EB病毒在體外直接感染人外周血淋巴細(xì)胞，建立了能分泌半抗原抗體的人B淋巴細(xì)胞系。EB病毒（epstein-barrvirus,EBv）是epstein和barr于1964年首次成功地將burkitt非洲兒童淋巴瘤細(xì)胞通過體外懸浮培養(yǎng)而建株，并在建株細(xì)胞涂片中用電鏡觀察到皰疹病毒顆粒，故名。

5.2人源性單克隆抗體制備現(xiàn)在是104頁\一共有114頁\編輯于星期四1.EBv特征含雙鏈DNA，基因大小為170kb,含各不相同的重復(fù)序列。EB病毒僅能在B淋巴細(xì)胞中增殖，長