植物基因工程08級優(yōu)秀課件

第七章植物基因工程一、植物基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀二、植物基因工程方法三、轉(zhuǎn)化子細胞的篩選四、轉(zhuǎn)化體的鑒定與證實五、植物基因工程研究的應(yīng)用和展望一、植物基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀1、植物的遺傳改良方法傳統(tǒng)的育種方法

以基因突變體為種質(zhì)基礎(chǔ)，以有性雜交為基因?qū)胧侄?，以選擇優(yōu)良基因型重組體為目的的植物性狀的改良過程。植物基因工程以植物為受體的一種基因操作，即以分子生物學為理論基礎(chǔ)，采用基因克隆、遺傳轉(zhuǎn)化，以及細胞、組織培養(yǎng)技術(shù)將外源基因轉(zhuǎn)移并整合到受體植物的基因組中，并使其在后代植株中得以正確表達和穩(wěn)定遺傳，從而使受體獲得新性狀的技術(shù)體系。2、植物基因工程的應(yīng)用前景改變植物的遺傳性狀。獲得抗病、抗蟲、抗除草劑等抗逆性狀；改良農(nóng)作物農(nóng)藝性狀，提高產(chǎn)品質(zhì)量；改變植物的育性和不親合性。作為一種生物反應(yīng)器。藥用蛋白和植物次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)；生產(chǎn)某些有機化合物。植物基因功能研究。轉(zhuǎn)基因番茄

1994年，美國政府批準了他們研制成功抗干旱、早熟、保鮮的轉(zhuǎn)基因番茄商品化之后，我國也相繼成功培育出優(yōu)良品種的轉(zhuǎn)基因番茄，以滿足人們的需求。轉(zhuǎn)基因甜椒

甜椒在栽培的過程中，容易受病毒的感染。我國科學工作者，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，培育出抗病毒的甜椒。轉(zhuǎn)基因玉米玉米是主要糧食之一，又可以提煉油脂，也可以用作食品和工業(yè)的原料以及作飼料，渾身是寶。人們稱它是含金的植物。如今培育出轉(zhuǎn)基因玉米，品質(zhì)更好，產(chǎn)量更高。轉(zhuǎn)基因油菜

油菜是人們食用油的主要來源之一。一般油菜籽的含油量約為40％左右。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，培育出來的油菜籽，可以大大地提高它的出油率。而且油的純度質(zhì)量更好轉(zhuǎn)基因小麥

從植物體中分離出合成賴氨酸的基因，把這基因轉(zhuǎn)入小麥植株中，培育出轉(zhuǎn)基因小麥。用這種轉(zhuǎn)基因小麥制造出來的面粉，更適合用來烤面包，而且面粉中賴氨酸含量高，這種面包的營養(yǎng)價值高。

二、植物基因轉(zhuǎn)化的方法原生質(zhì)體介導法基因槍法根癌農(nóng)桿菌介導法種質(zhì)系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)移（花粉管導入法）PEG介導的基因轉(zhuǎn)化利用化學試劑，如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、多聚-L-鳥氨酸(pLO)和磷酸鈣等，誘導原生質(zhì)體攝取外源DNA分子，進入原生質(zhì)體的外源DNA分子就有可能通過某種機制整合到基因組中，完成遺傳轉(zhuǎn)化過程。第一例成功的轉(zhuǎn)基因煙草就使用該轉(zhuǎn)化方法獲得的。

脂質(zhì)體介導基因轉(zhuǎn)化

利用脂類化學物質(zhì)包裹外源DNA成球體，通過植物原生質(zhì)體的吞噬或融合作用把包含外源DNA的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入受體細胞。特點：轉(zhuǎn)化率高；操作繁瑣；技術(shù)性更高。電激法介導基因轉(zhuǎn)化

利用高壓電脈沖作用，在原生質(zhì)體膜上“電激穿孔”，形成可逆的瞬間通道,從而促進外源DNA進入原生質(zhì)體。特點：轉(zhuǎn)化率高；操作簡便；特別適于瞬時表達的研究；容易造成原生質(zhì)體損傷。顯微注射介導的基因轉(zhuǎn)化

利用顯微注射儀將外源DNA直接注入受體的細胞質(zhì)或細胞核，從而實現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)移。特點：方法簡單、轉(zhuǎn)化率高；適用于各種植物和材料，無局限性；對受體細胞無毒害。激光微束介導的基因轉(zhuǎn)化

將激光引入光學顯微鏡聚焦成微米級的微束照射培養(yǎng)細胞，在細胞膜上形成能自我愈合的小孔，使加入細胞培養(yǎng)基里的外源DNA流入細胞，實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。優(yōu)點：操作簡便；工作效率高；適應(yīng)于各種動植物；受體的類型廣泛；用于細胞器的基因轉(zhuǎn)化。PDS-1000/He系統(tǒng)基因槍的操作步驟DNA微彈的制備：金粉或鎢粉50~100mg、DNA、CaCl2、PEG4000和亞精胺靶外植體材料準備DNA微彈轟擊轟擊后外植體的培養(yǎng)轉(zhuǎn)化率及其影響因素金屬微粒的影響DNA沉淀輔助劑的影響DNA的純度及濃度對轉(zhuǎn)化率的影響微彈速度的影響植物材料的內(nèi)在因素的影響Ti質(zhì)粒(Tumorinducingplasmid)Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙股共價閉合環(huán)狀DNA分子，其分子量為95～156×106D，約有200kb。Ti質(zhì)粒的類型：根據(jù)冠癭瘤合成的冠癭堿種類不同分為：章魚堿型(octopine)胭脂堿型(nopaline)農(nóng)桿堿型(agropine)Ti質(zhì)粒的基因結(jié)構(gòu)：T-DNA區(qū)、Vir區(qū)、Con區(qū)和Ori區(qū)共4個區(qū)段。

Ti質(zhì)粒的遺傳特性T-DNA區(qū)(transferDNAregion)

Ti質(zhì)粒中的一部分DNA片段，進入寄主細胞并插入基因組中，能夠利用植物的酶系統(tǒng)進行轉(zhuǎn)錄和翻譯，其表達產(chǎn)物可誘發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤。T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)特征：左右兩端邊界各有一個25bp長的正向重復序列(Lb和Rb)，具有高度保守性。右邊界突變和缺失導致轉(zhuǎn)移能力降低或喪失。T-DNA以單拷貝或多拷貝的形式隨機整合到植物染色體DNA上。胭脂堿T-DNA(23kb)pTiC58章魚堿T-DNA(13.6kb)pTiAch5NOS：胭脂堿合成酶基因ocs：章魚堿合成酶基因；tmr：根性腫瘤基因tms：芽性腫瘤基因；tml：大腫瘤基因取代型Ti質(zhì)?？寺≥d體用E.coli質(zhì)?？寺≥d體取代野生型Ti質(zhì)粒的全部或部分T-DNA核苷酸序列，構(gòu)建的載體。

onc-Ti質(zhì)?？寺≥d體

T-DNA上Onc基因被取代；保留T-DNA的兩端邊界序列和nos基因。

onc+Ti質(zhì)?？寺≥d體

T-DNA上的部分序列被pBR322所取代，仍保留Onc基因。進入植物細胞后，可誘發(fā)冠癭瘤，如pGV3850和pMPG1。pGV3850從胭脂堿Ti質(zhì)粒pTiC58衍生而來含有T-DNA邊緣區(qū)，以及除T-DNA以外全部的DNA序列臨近右側(cè)邊緣區(qū)(RB)編碼胭脂堿合成酶的nos基因，供作鑒定轉(zhuǎn)化細胞的記號缺失的T-DNA核心區(qū)由pBR322序列取代共整合克隆載體系統(tǒng)雙元Ti載體系統(tǒng)根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導的基因轉(zhuǎn)化的分子機理農(nóng)桿菌對受體的識別農(nóng)桿菌附著到植物受體細胞誘導啟動毒性區(qū)基因表達類似接合孔復合體的合成和裝配T-DNA的加工和轉(zhuǎn)運T-DNA的整合三、轉(zhuǎn)化子細胞的篩選1、選擇基因：一類編碼可使抗生素或除草劑失活的蛋白酶基因。新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neomycinePT,NPTⅡ)基因

含卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上，攜帶NPTⅡ基因的轉(zhuǎn)化細胞存活；非轉(zhuǎn)化細胞致死。強選擇標記，應(yīng)用廣泛，但假陽性率高。潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hygromycinPT,HPT)基因在含潮霉素的選擇培養(yǎng)基上，攜帶HPT基因的轉(zhuǎn)化細胞具有抗潮霉素的能力，能夠存活；非轉(zhuǎn)化細胞致死。慶大霉素抗性基因(gentr)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(bar)2、報告基因：是指其編碼產(chǎn)物能夠被快速測定、常用于判斷外源基因是否成功的導入受體細胞，是否啟動表達的一類特殊用途的基因。β_葡萄糖苷酸酶基因(gus)GUS是一種水解酶，能催化某些特殊反應(yīng)進行，通過對反應(yīng)產(chǎn)物的檢測即可確定Gus基因的表達。熒光素酶(luciferase,LUC)基因

LUC是一種源于螢火蟲的動物蛋白基因產(chǎn)物，能夠催化生物發(fā)光反應(yīng)。四、轉(zhuǎn)化體的鑒定與證實PCR檢測外源基因的整合Southern雜交檢測外源基因的整合RT-PCR檢測外源基因的表達Northern雜交檢測外源基因的表達Western雜交檢測外源基因表達的產(chǎn)物五、植物基因工程研究的應(yīng)用和展望1、抗逆基因工程---第一代植物基因工程抗蟲基因工程：毒素蛋白基因、蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因、植物外源凝聚素類基因抗除草劑基因工程：修飾改造的除草劑作用靶蛋白基因；除草劑解毒基因?？共』蚬こ蹋嚎共』?、解毒酶類基因、抗菌肽及抗菌蛋白類基因、病程相關(guān)蛋白類基因、植保素類基因抗逆基因工程：逆境誘導的植物蛋白激酶基因、編