HIV感染和AIDS的實驗診斷課件

HIV感染和AIDS的實驗診斷

HIV感染及AIDS的實驗診斷揭開AIDS歷史的第一頁MMWR

JUNE5,1981/VOL.30/NO.21MORBIDITYANDMORTALITYWEEKLYREPORT1.發(fā)展簡史

1983年,法國巴斯德研究所分離到一種新的逆轉錄病毒，命名為LAV。1984年美國國立癌腫研究所分離出命名為HTLV-Ⅲ的病毒。同年，美國加州大學分離出AIDS相關病毒（AIDSRelatedVirus,ARV）.1986年，非洲西部發(fā)現(xiàn)了另一種病毒．國際微生物學會及病毒分類學會統(tǒng)一命名為HIV。一）生物學特征2.HIV的結構與蛋白質(zhì)功能HIV呈球形或卵形，直徑為100-120nm，雙層結構。核心由兩個相同拷貝的RNA及蛋白質(zhì)、反轉錄酶、核糖核酸酶及整合酶組成，核心外為病毒衣殼，20面體立體對稱，有蛋白質(zhì)（P17/P18、P24/P25）。最外層是膜蛋白。包膜上有刺突，含糖蛋白gp120，在雙層脂質(zhì)中有gp41

。一）生物學特征HIV病毒顆粒及其結構蛋白和其他毒粒蛋白HIV基因編碼的產(chǎn)物及其功能HIV結構蛋白包括:核心蛋白(gag),包膜蛋白(env)聚合蛋白(pol)。核心蛋白包括:P17位于核蛋白與殼層之間的基質(zhì)上，包被于包膜蛋白的內(nèi)部。P24和P15包被于內(nèi)部核酸外圍核衣殼主要為P24。包膜蛋白為糖蛋白:gp160是前體分子，在感染初期產(chǎn)生，然后分解成gp120和gp41。聚合酶蛋白包括:P66、P51和P31，聚合酶抗原位于病毒的核區(qū)內(nèi)，與病毒核酸緊密相關。其功能為轉錄RNA為DNA；整合病毒DNA到宿主細胞的DNA上和切割前體分子使之成為有活性的小分子。HIV的結構蛋白HIV-1分為M、O、N三組，M組包括A、B、C、D、E、F、G、H、I、J共10個亞型，加上O、N型共12個亞型。HIV-2至少有A、B、C、D、E、F等6個亞型。3.HIV的病原特異性：HIV-1亞型全球分布B,a,c,d,f,oA,O,d,g,hB,a,d,e,oBBBBB,f,cB,eBCA,D,eC,a,dC,a,b,eC,E,bE,bB,e,cB,eB,a,c,d,g,hB,iUNAIDSDec.1996非洲及亞洲部分地區(qū)有重組株病毒。HIV的亞型特點有相對優(yōu)勢亞型同一亞型差異很大亞型內(nèi)的變異水平估算存在時間不同亞型傳播途徑和致病性不一不同亞型對抗-HIV藥物引起耐藥不同亞型重組屬于逆轉錄病毒，復制速度快可感染人體各種細胞，造成多器官損傷破壞具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能T4淋巴細胞在血液、淋巴液、精液、陰道分泌液和乳汁中其抗體無保護作用對外界抵抗力弱（低于乙肝病毒）人類免疫缺陷病毒全球愛滋病感染人數(shù)及感染途徑

根據(jù)聯(lián)合國愛滋病委員會和世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球每年新感染愛滋病帶毒者410萬。(24h全球增加16000感染者)

因HIV死亡的人數(shù)超過了280萬,已超過了肺結核(病死率200萬)和瘧疾(100萬).1.西方國家HAART的使用，患病率和病死率在下降，而發(fā)展中國家AIDS形勢嚴峻；2.以注射吸毒和性傳播(以異性間的傳播為主)；3.不潔的血液采集;4.女性病例上升；母嬰傳播5.兒童病例增加（<15歲）。近年AIDS流行特點：AIDS的流行情況蘇州市自92年起共發(fā)現(xiàn)艾滋病例600多例,而去年一年的新感染者達190余例,這些統(tǒng)計數(shù)字充分表明了我國目前真可謂艾滋病病毒感染的迅速增長期。(體檢發(fā)現(xiàn))

聯(lián)合國艾滋病中國專題組在北京以《中國艾滋?。何ｋU的泰坦尼克號》為題發(fā)布了2001年中國艾滋病形勢的最新報告。報告警告說，中國正處在艾滋病災難的邊緣，一艘巨輪正在沖向冰山。1.HIV借助CD4受體結合到靶細胞表面，通過靶細胞的內(nèi)吞作用和gp41的融合作用，其細胞膜被穿透，病毒進入細胞質(zhì)；2.在RT作用下，第一條RNA轉錄為DNA，繼之以第一條DNA為模板，形成前病毒；3.在整合酶作用下，形成的雙股DNA整合到宿主細胞中，感染持續(xù)存在；4.前病毒成為潛伏狀態(tài)；5.前病毒DNA復制，具有新一代病毒的遺傳物質(zhì)；6.復制好的新病毒顆粒，再感染別的細胞，而原感染的細胞死亡三）致病機制2.HIV的感染過程1.“窗口期”:感染HIV到相應抗體產(chǎn)生.2.“急性感染期”

:一般在一月后產(chǎn)生抗體，平均45天。在急性感染期病毒復制明顯，血中?？沙霈F(xiàn)P24抗原和HIVRNA，也可培養(yǎng)到HIV。3.“潛伏期”:可持續(xù)數(shù)月至17年以上。此時僅能檢出抗體，但有低濃度HIV復制。4.AIDS臨床階段。急性HIV感染誘導的宿主免疫應答的進程HIV的感染過程HIV的感染過程4.HIV感染后的T細胞變化CD4+T持續(xù)不斷下降，及Th1,Th2亞群失調(diào)．對抗原反應性減低．細胞因子如IFN-r,TNF-a水平升高，產(chǎn)生細胞因子的功能受損，如IL1,IL2能力下降；CD8+T早期有較明顯上升，發(fā)病前1-2年明顯下降，CTL功能下降，但如加IL-2處理可恢復活性。CD3+T在早期下降不明顯，在AIDS發(fā)病前1-2年出現(xiàn)明顯下降。CD4+淋巴細胞的格局HIV的病毒培養(yǎng)與分離；HIV的毒株分析；HIV核酸測定；（AbbottLCxHIV-RNA）P24抗原的測定；第四代酶免試劑HIV抗體測定：常分為初篩和確認兩步。初篩實驗室和常用初篩方法有：

HIV病毒抗體金標快速法（InstantCHEK-HIV1+2）愛滋病毒抗體篩選酶免試劑（MUREXHIV）DetermineHIV1+2+0亞型試紙（Abbott）雙抗原夾心酶免試劑

確認試驗主要是免疫印跡技術（WesternBlot,WB）四）HIV的實驗診斷1.HIV抗體檢測試劑盒1985.3HIV-11990.6HIV-21992.4HIV-1/2敏感度和特異度不斷提高．三代ELISA均達99%以上.1998.三代ELISA檢測ＨIV1/HIV2(P24Ab).2008.四代ELISA(ＨIV1/HIV2(P24Ag))

快速診斷試劑(膠體金標記)EIA實際試劑盒進展代次抗原方法檢測時間1全病毒間接>2個月2重組或多肽間接42-45d3重組+多肽夾心

22d4抗原+抗體夾心

16d(抗原5pg)5基因擴增法，基因芯片

6-11.5dHIV抗體篩查試劑1.MurexHIV1.2.O：

第三代抗體試劑的雙抗原夾心法模式兩步法酶標法測試，可以用來檢測HIV抗體I型，II型和O亞型。手工/自動化酶標儀檢測，用血清/血漿樣本。MurexHIV-1.2.O.夾心模式板底樣本結合物抗原包被（1）辣根過氧化物酶標記抗原（2）模式：雙抗原夾心法。MurexHIV-1.2.O抗原HIV-1envHIV-1envHIV-1envHIV-1envHIV-1envHIV-2envHIV-1envHIV-1p24

HIV-1envPODPOD

PODHIV-O

HIV-OHIV-2多肽抗原重組抗原板結合物CDSDPODHIV-1envHIV-1p24HIV-1p24P41/p36前帶/后帶效應的機制兩步?jīng)_洗法---可避免此效應低濃度的結合物高濃度的結合物

HOOK效應的機制Ag變構是二步夾心酶免出現(xiàn)鉤狀HOOK的原因．被測抗原如具有多重決定族與親和性高于包被抗體的酶標抗體發(fā)生交叉重疊結合，由于立體效應和互相擠壓，Ag分子發(fā)生構象改變而從包被抗體上脫落，造成反應信號下降．2.POCT在艾滋病毒檢測中的應用快速DetermineHIV1/2O抗體檢測第三代抗體試劑的雙抗原夾心法模式可以用來檢測HIV抗體I型，II型和O亞型?？捎檬种?靜脈血，15分鐘出結果，可用血清/血漿/全血樣本結果可密封保存?？焖僭噭┭兄频谋尘熬偷貦z測（POCT）概念：

急診----手術，緊急輸血，事故緊急檢測。（醫(yī)護人員和病人的保護）篩查概念： 母嬰篩查，就職，移民，性及吸毒犯罪人員體檢等----簡單易用。日常檢測： 大，中，小型實驗室，及極少量HIV樣本實驗室，偏遠地區(qū)，實驗室條件或設備不齊，外出檢測----方便攜帶，使用。結果可保存。

靈敏度排名及分數(shù)產(chǎn)品排名分數(shù)GenscreenHIV1/21237MurexHIV1.2.O2235ImxHIV?III3231OrthoHIV1/23231AbbottHIV?Beads4229Murex1/25227OrganonUniII..x5..214-225InnotestHI1/2Last1783.第四代試劑及抗原有關的試劑HIV抗原/抗體聯(lián)合試劑：MurexHIVAg/Ab：第四代試劑

大大提高靈敏度的篩查試劑，進一步縮短了檢測“窗口期”。RIADeltaHIVAg/Ab：放免HIV抗原/抗體聯(lián)合試劑。

HIV抗原試劑：MurexHIV抗原單克隆試劑： 臨床上只用于HIV抗原檢測以早期檢測樣本，或觀察HIV疾病進程。MurexHIV抗原確認試劑,確認抗原試劑陽性樣本。HIV–標記物CDCgroupICDCgroupII/IIICDCgroupIVHIVAg/RNAIgMIgG(env)IgG(p24)HIVAg/RNA第一代第二代第三代第四代抗原補充4.HIV特殊試劑HIV抗體WB確認試劑： 為唯一一種經(jīng)典和全球公認的抗體確認試劑，2..2版本包含有極早期血清轉換片段，便于早期樣本的確認。LCxHIV核酸物質(zhì)定性/定量分析：（LCR和PCR技術） 用于HIV病人遺傳物質(zhì)檢測，可用于部分確認，和病人治療監(jiān)測。結構蛋白HIV-1HIV-2envgp160前體gp140gp120外部gp105/125gp41跨膜gp36/41polP66逆轉錄酶p68P51逆轉錄酶p53P31內(nèi)切酶p31/34gagp55前體p56p24核心p26p17基質(zhì)p16

WesternBlot分析HIV蛋白

Westernblot原理HIV病毒核酸分析和血清學免疫測定比較血清學免疫測定核酸分析感染后天數(shù)天血清HIV抗體核酸分析5.自身紅細胞凝集試驗原理雙功能試劑：抗RBC,gp120簡單，快速，微量，不需分離血清有假陽性6.HIV亞型分析；

HIV變異的識別；7.細胞因子的測定；8.PCR追蹤HIV自然感染史。HIV的實驗診斷

世界愛滋病日1988年１月將每年的１２月１日定為世界愛滋病日，號召世界各國和國際組織在這一天舉辦相關活動，宣傳和普及預防愛滋病的知識．在