酶4公開課課件

第四章酶Enzyme

第五節(jié)酶的作用機理一、酶的活性中心二、酶作用的專一性三、酶高效性的作用機理四、酶活性的調節(jié)控制和調節(jié)酶五、同工酶一、酶的活性中心與必需基團（一）酶的活性中心酶是生物大分子，相對分子質量很大，而與酶反應的底物一般是相對分子質量較小的分子，有時即使是大分子底物時，反應也是逐步進行的，酶僅與大分子底物中的一小部分作用。與底物接觸并且發(fā)生反應的部位就稱為酶的活性中心(activecenter)。酶的活性中心往往是若干個在一級結構上相距很遠，但在空間結構上彼此靠近的氨基酸殘基集中在一起形成具有一定空間結構的區(qū)域，該區(qū)域與底物相結合并將底物轉化為產物，對于結合酶來說，輔酶或輔基往往是活性中心的組成成分。酶的結構與功能的關系（二）酶活性中心證明方法

1、切除法對小分子且結構已知的酶多用此法。用專一性的酶切除一段肽鏈后剩余的肽鏈仍有活性，說明切除的肽鏈與活性無關，反之，切除的肽鏈與活性有關。酶的活性中心根據(jù)修飾劑是否專一性結合酶的活性中心的特定基團，化學修飾可分為：修飾試劑既可與酶的活性部位的某特異基團結合，又可與酶的非活性部位的同一基團結合，稱之為非特異性共價修飾。此法適用于所修飾的基團只存在與活性部位，在非活性部位不存在或極少存在。判斷標準是：①酶活力的喪失程度與修飾劑的濃度成正比；②底物或競爭性抑制劑保護下可防止修飾劑的抑制作用。（1）非特異性共價共接修飾：酶的活性中心修飾劑專一性地結合于酶的活性部位的特定基團，使酶失活。如：DIFP（二異丙基氟磷酸，結構見P118）可專一性地結合絲氨酸蛋白酶活性部位的絲氨酸—OH而使酶失活。DIFP一般不與蛋白質反應，也不與含絲氨酸的蛋白酶原或變性的酶反應，只與活性的酶且活性部位含絲氨酸的酶結合。（2）特異性的共價修飾：酶的活性中心3、X—射線衍射法：把一純酶的X—射線晶體衍射圖譜和酶與底物反應后的X-射線圖譜相比較，即可確定酶的活性中心。4、親和標記法：根據(jù)酶與底物能特異性的結合的性質，設計合成一種含反應基團的底物類似物，作為活性部位的標記試劑，它能象底物一樣進入酶的活性部位，并以其活潑的化學基團與酶的活性基團的某些特定基團共價結合，使酶失去活性。如胰凝乳蛋白酶最適底物為：N-對甲苯磺酰-L-苯丙氨酰乙酯或甲酯，根據(jù)此結構設計的親和標記試劑為：N-對甲苯磺酰-苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK），結構見P119。其分子中的氯甲基酮部分可使酶的His57烷基化形成酶－TPCK衍生物而使酶失活。5、定點誘變法：通過基因突變的方法研究酶活性中心的必需氨基酸。酶的活性中心1、底物和酶的鄰近效應與定向效應2、底物形變和誘導契合的催化效應3、酸堿催化酸堿催化胰凝乳蛋白酶通過酸堿催化使肽鍵斷裂酶分子部分功能基團起瞬時質子供體或質子受體的作用Specificacid-basecatalysisGeneralacid-basecatalysis影響酸堿催化反應速度的兩個因素⑴酸堿強度(pK值）組氨酸咪唑基的解離常數(shù)為6，在pH6附近給出質子和結合質子能力相同，是最活潑的催化基團。⑵給出質子或結合質子的速度。咪唑基最快，半壽期小于10-10秒3、酸堿催化酶部分殘基側鏈作為親核基團或親電基團，與底物形成一個反應活性很高的共價中間物。酶親核基團：Ser-OH，Cys-SH，His-N：底物親電中心：磷?；≒=O）?；–=O）糖基（Glu-C-OH）4、共價催化金屬酶（metalloenzyme):Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co3+金屬-激活酶（metal-activatedenzyme):Na+、K+、Mg2+、Ca2+（1）通過結合底物為反應定向（2）通過自身價數(shù)的改變參加氧化還原反應（3）屏蔽底物或酶活性中心的負電荷5、活性中心金屬離子的催化作用常見酶的催化機理絲氨酸蛋白酶的作用機理

Ser195His57Asp102H–O–CH2OC–O

-=ActiveSerH–NNCCCHHCH2Ser195His57Asp102-

O–CH2OC–O–H=NN–HCCCHHCH2絲氨酸蛋白酶家族具有類似的Ser-His-Asp催化三聯(lián)體（電荷中繼網）P405組氨酸的咪唑基受pH影響大H–NNCCCHHH+pH6pH7+H–NN–HCCCHHInactive+Ser195His57Asp102H–O–CH2OC–O

-=H–NN–HCC-HCCH2HAsp102His57Ser195CatalyticTriadHHChymotrypsin順序式催化反應A1NCCN[HOOC]HOCCNCC[NH2]COChecksubstratespecificityAsp102His57Ser195HHNCCN[HOOC]HOCCNCC[NH2]COFirstTransitionStateChymotrypsin順序式催化反應A2HHNCCN[HOOC]HOCCNCC[NH2]COAcyl-EnzymeIntermediateChymotrypsin順序式催化反應A3HN-HCCN[HOOC]HOCCNCC[NH2]COHOHAcyl-EnzymeWaterIntermediateChymotrypsin順序式催化反應D1HOOCCNCC[NH2]CHSecondTransitionStateOHChymotrypsin順序式催化反應D2HOCCNCC[NH2]COOH脫酰作用DeacylationHChymotrypsin順序式催化反應D3酶可使用類似的反應基質

O-CN-

H

O-CO-PeptidebondEsterbond

OCH3–C–O––NO2NitrophenolacetateHO––NO2

OCH3–C–OHHartley&KilbyChymotrypsin+H2O硝基酚Nitrophenol醋酸鹽Acetate專一性的形成■

Trypsin一族：

chymotrypsin,elastase...

Serineprotease

→

催化機制相同專一性不同●

改變專一性結合區(qū)可改變基質專一性

[Science]

chymotrypsin(Ser189)→

trypsin(Asp189)演化Ser蛋白酶家族的專一性不同

p408COO-CAsp活性中心的底物結合部位不同，底物專一性也不同。TrypsinChymotrypsinElastase切Lys,Arg切Trp,Phe,Tyr切

Ala,GlyNon-polarpocketDeepandnegativelychargedpocketShallowandnon-polarpocket

OO–C–N–C–C–N–

C

C

C

C

NH3+

OO–C–N–C–C–N–

C

OO–C–N–C–C–N–

CH3DivergentevolutionAsp--His--SerAsp--His--SerConvergentevolution分子演化TrypsinChymotrypsinElastaseThrombinPlasmin