打扮品中7種染發(fā)劑的檢測方法起草說明及編制說明

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打扮品中7種染發(fā)劑的檢測方法

（征求看法稿）

1適用范圍

本方法規(guī)定了打扮品中酸性紫43（CAS：224-618-7，CI42510）；堿性紫14（CAS：632-99-5，CI42510）；酸性橙3（CAS：228-921-5）；堿性黃87（CAS：116844-55-4）；堿性藍(lán)26（CAS：2580-56-5，CI44045）；堿性紅51（CAS：12270-25-6）；堿性橙31（CAS：97404-02-9）7種染發(fā)劑含量的高效液相色譜測定方法。

本方法適用于染發(fā)類和燙發(fā)類打扮品中堿性紅51、堿性紫14、酸性紫43、堿性藍(lán)26、堿性橙31、酸性橙3、堿性黃87等7種染發(fā)劑含量的測定。2方法提要

試樣經(jīng)甲醇超聲提取后，過0.45μm濾膜，采用高效液相色譜系統(tǒng)分開，紫外檢測器或二極管陣列檢測器進(jìn)行檢測，外標(biāo)法定量。若取5.0g樣品，本方法對堿性紅51、堿性紫14的檢出限為0.06mg/kg；酸性紫43、堿性藍(lán)26的檢出限為0.6mg/kg；堿性橙31、酸性橙3的檢出限為1.2mg/kg；堿性黃87的檢出限為3.0mg/kg；最低定量濃度分別為：堿性紅51、堿性紫14：0.2mg/kg、酸性紫43、堿性藍(lán)26為2.0mg/kg；堿性橙31、酸性橙3為3.5mg/kg；堿性黃87為10mg/kg。3試劑和材料

除另有規(guī)定外，所用試劑均為色譜純，水為一級水。3.1甲醇。3.2四氫呋喃。3.3乙酸銨：分析純。

3.4乙酸銨溶液（0.02mol/L）：稱取1.54g乙酸銨（3.3），加水至1000mL，溶解，經(jīng)0.45μm濾膜過濾。

3.5染發(fā)劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：酸性紫43（AcidViolet43，CAS：224-618-7，CI42510）；堿性紫14（BasicViolet14，CAS：632-99-5，CI42510）；酸性橙3（AcidOrange3，CAS：228-921-5）；堿性黃87（Basicyellow87，CAS：116844-55-4）；堿性藍(lán)26（BasicBlue26，CAS：2580-56-5，CI44045）；堿性紅51（Basicred51，CAS：12270-25-6）；堿

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性橙31（Basicorange31，CAS：97404-02-9）；純度均≥90%。

3.6染發(fā)劑混合標(biāo)準(zhǔn)儲存液（1.0mg/mL）：分別稱取7種染發(fā)劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（3.5）0.1g（確切至0.1mg）于100mL容量瓶中，甲醇（3.1）稀釋定容。

3.7染發(fā)劑混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：分別移取一定量的2種染發(fā)劑（酸性紫43；堿性紫14）標(biāo)準(zhǔn)儲存液（3.6），用甲醇配制成濃度為5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液；分別移取一定量的5種染發(fā)劑（酸性橙3；堿性黃87；堿性藍(lán)26；堿性紅51；堿性橙31）標(biāo)準(zhǔn)儲存液（3.6），用甲醇配制成濃度為1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。4儀器與設(shè)備

4.1高效液相色譜儀：配紫外檢測器或二極管陣列檢測器。4.2分析天平：感量分別為0.1mg和1.0mg。4.3超聲波清洗器。4.4渦旋混勻器。

4.5有機(jī)微孔濾膜：0.45μm。5分析步驟5.1樣品預(yù)處理

確鑿稱取試樣5.0g（確切至1mg）于25ml比色管中，參與1.0ml四氫呋喃（3.2），再參與20ml甲醇（3.1），渦旋振蕩2min，在超聲提取30min后，放置至室溫，用甲醇（3.1）定容，搖勻，過0.45μm濾膜，待測。5.2色譜參考條件

色譜柱：C18柱，250mm×4.6mm（內(nèi)徑），5μm；或相當(dāng)者。

滾動相：A相（甲醇）+B相（0.02mol/L乙酸銨（pH=4.0）），梯度洗脫程序見表1。

流速：1.0mL/min柱溫：30℃進(jìn)樣量：10μL

檢測器：紫外檢測器或二極管陣列檢測器

檢測波長：堿性藍(lán)26為616nm；堿性紅51、堿性紫14、酸性紫43為520nm；堿性橙31、堿性黃87、酸性橙3為480nm。

表1梯度洗脫程序

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時間，min

0102535

5.3測定

滾動相A（%）

5308080

滾動相B（%）

95702020

本方法采用外標(biāo)校準(zhǔn)曲線法定量測定。以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程，以試樣的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定量。6計(jì)算

試樣中染發(fā)劑的含量（μg/g），按式（1）計(jì)算：

w?C?V…….……………(1)m式中：w—試樣中染發(fā)劑的含量，μg/g；

C—試樣溶液中染發(fā)劑的含量，μg/mL；V—提取溶液體積，mL；m—樣品質(zhì)量，g。

7回收率和縝密度

多家試驗(yàn)室驗(yàn)證的平均回收率為85.2%～109.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于6%（n=6）。8色譜圖

圖1在616nm下測得堿性藍(lán)26標(biāo)準(zhǔn)高效液相色譜圖

堿性藍(lán)26標(biāo)準(zhǔn)出峰時間為30.389min

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圖2在520nm下測得堿性紅51、堿性紫14、酸性紫43標(biāo)準(zhǔn)高效液相色譜圖標(biāo)準(zhǔn)出峰時間：堿性紅51為22.383min；堿性紫14為25.654min；酸性紫43為30.269

min

圖3在480nm下測得堿性橙31、堿性黃87、酸性橙3標(biāo)準(zhǔn)高效液相色譜圖標(biāo)準(zhǔn)出峰時間：酸性橙31為13.186min；堿性黃87為22.101min；酸性橙3為

29.437min

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打扮品中7種染發(fā)劑的檢測方法起草說明

為更好地服務(wù)打扮品安全監(jiān)管，規(guī)范打扮品中禁限用物質(zhì)檢測技術(shù)要求，確保打扮品質(zhì)量安全，2023年6月，國家食品藥品監(jiān)視管理局委托XX省保健食品打扮品協(xié)會開展《打扮品中7種染發(fā)劑的測定高效液相色譜法》方法建立和驗(yàn)證工作，現(xiàn)就起草工作有關(guān)狀況說明如下：

一、起草的必要性

染發(fā)劑類化合物主要作用是增加打扮品的色澤，在染發(fā)劑等各類打扮品中最常使用的一類物質(zhì)。根據(jù)《打扮品衛(wèi)生規(guī)范》2023版，染發(fā)劑屬于限用物質(zhì)或暫時允許使用染發(fā)劑目錄，具體限量水平參見規(guī)范。

根據(jù)國內(nèi)外報(bào)道，為了提升產(chǎn)品感官性能，部分企業(yè)超量使用染發(fā)劑，存在較大風(fēng)險(xiǎn)。但是，當(dāng)前僅有苯二胺等染發(fā)劑組分的檢測技術(shù)要求，與現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)實(shí)際使用種類相差較多，也不能涵蓋當(dāng)前現(xiàn)實(shí)使用的在規(guī)范目錄以外的品種，成為行政監(jiān)管的瓶頸問題，本技術(shù)要求的開發(fā)具有緊迫性和現(xiàn)實(shí)意義。為此，需要建立有一種快速有效地檢測打扮品中多種染發(fā)劑的方法。本標(biāo)準(zhǔn)的制定宗旨在為打扮品中7種染發(fā)劑的測定提供更為確鑿的試驗(yàn)方法，有力的支撐未來市場打扮品的監(jiān)管，同時也能夠表達(dá)我國打扮品檢測的水平和對打扮品監(jiān)管的力度。

二、起草依據(jù)及文獻(xiàn)

（一）《打扮品衛(wèi)生規(guī)范》2023版.

（二）打扮品及其原料中禁限用物質(zhì)檢測方法驗(yàn)證技術(shù)規(guī)范.

（三）ThecosmeticDirectiveofCouncilEuropeanCommunities,76/768/EEC.

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（四）《中國藥典》2023版，其次部.

（五）李英、張琛.粉狀打扮品中9種有機(jī)染發(fā)劑的高效液相色譜法測定，香精

香料打扮品，2023,12（6）：29-33.

（六）孫小穎、李英.高效液相色譜法同時測定打扮品中的9種水溶性染發(fā)劑，

色譜，2023,27（6）：852-855.

（七）郭桂媛、林維宣.高效液相色譜法同時測定打扮品中的4種禁用染發(fā)劑，

日用化學(xué)工業(yè)，2023，41（3）：229-231.

（八）RastogISC,BaiwickVJ.Identificationoforganiccolorantsincosmeticsby

HPLC-Diodearraydetection.Chromatographic,1997,(45):215-228.三、起草原則

本檢測方法兼具先進(jìn)性、確鑿性以及可操作性強(qiáng)的特點(diǎn)，采用目前一般檢測試驗(yàn)室普遍具備的分析技術(shù)，選擇適合、可行、便于實(shí)際操作的分析條件，保證檢測方法的確切性和重現(xiàn)性。

四、起草過程

依據(jù)國家食品藥品監(jiān)視管理局檢驗(yàn)方法起草的有關(guān)要求，參考國家標(biāo)準(zhǔn)起草規(guī)范，該方法起草共分六個階段：1、任務(wù)下達(dá)。2023年6月，正式獲批開展《打扮品中7種染發(fā)劑的測定高效液相色譜法》方法建立和驗(yàn)證工作，項(xiàng)目組查閱了國內(nèi)外相關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)資料，調(diào)研了國內(nèi)主要省區(qū)的行業(yè)狀況；2、方法開發(fā)。2023年5月，完成了該方法的建立工作；3、專家論證。2023年6月，邀請食品、打扮品、質(zhì)監(jiān)等相關(guān)行業(yè)專家，對方法的可行性和實(shí)用性等技術(shù)指標(biāo)以及資料完整性等進(jìn)行了論證，專家一致認(rèn)為該方法確鑿、簡捷、可行，適用于作為標(biāo)準(zhǔn)化的檢驗(yàn)方法；4、方法驗(yàn)證。2023年7月，組織了方法驗(yàn)證單位（XX省藥包材所、XX省疾控中心、XX出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心）的相關(guān)負(fù)責(zé)人和行業(yè)專家，召開了驗(yàn)證研討會，介紹了檢測方法建立過程、詳細(xì)闡述了該方法的使用范圍、原理、試劑材料、儀器設(shè)備、測定步驟等內(nèi)容，并當(dāng)場交接了驗(yàn)證技術(shù)資料、驗(yàn)證用標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。三家驗(yàn)證單位依照簽訂的驗(yàn)證協(xié)議書要求，于8月底不斷將驗(yàn)證材料報(bào)送，將多家試驗(yàn)室方法驗(yàn)證材料進(jìn)行總結(jié)和分析；5、審定會。2023年9月向國家食藥監(jiān)局上報(bào)全部項(xiàng)目材料，召開項(xiàng)目審定會，論證該方法的技術(shù)指標(biāo)和文本材料等；6、修改報(bào)批。根據(jù)審定會專家看法，對材料進(jìn)一步補(bǔ)測完善，形成最終報(bào)批稿材料上報(bào)國家食藥監(jiān)局。

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五、重點(diǎn)說明的問題

（一）關(guān)于體例。本檢測方法的體例主要參照現(xiàn)行2023版《打扮品衛(wèi)生規(guī)范》的衛(wèi)生化學(xué)檢驗(yàn)方法的體例，便于打扮品檢驗(yàn)領(lǐng)域相關(guān)檢驗(yàn)人員的閱讀和實(shí)際操作。（二）關(guān)于7種染發(fā)劑。見附頁。

（三）關(guān)于檢測方法的建立和驗(yàn)證。經(jīng)過對打扮品中7種染發(fā)劑樣品前處理方法的選擇，分析條件的優(yōu)化，最終建立了打扮品中7種染發(fā)劑的液相色譜檢測方法。

圖1在616nm下測得堿性藍(lán)26標(biāo)準(zhǔn)高效液相色譜圖

圖2在520nm下測得堿性紅51、堿性紫14、酸性紫43標(biāo)準(zhǔn)高效液相色譜圖

圖3在480nm下測得堿性橙31、堿性黃87、酸性橙3標(biāo)準(zhǔn)高效液相色譜圖

表17種染發(fā)劑的出峰時間表

染發(fā)劑名稱出峰時間（min）堿性紅5122.383堿性紫1425.654酸性紫4330.269堿性橙3113.186堿性黃8722.101堿性橙329.437堿性藍(lán)2630.389-7-

方法驗(yàn)證說明，本方法中各種染發(fā)劑在一定線性范圍內(nèi)均有較好的線性相關(guān)系數(shù)（＞0.999），具體見表2，7種染發(fā)劑的方法檢出限見表3，在5.0mg/kg，50.0mg/kg兩個添加水平日，提取回收率在85.5～104.3%之間，方法回收在84.2～99.5%之間。日內(nèi)縝密度在0.83～4.33%之間（n=6），日間縝密度在1.78～5.39%之間（n=3）；日內(nèi)（24h）和日間（5天）穩(wěn)定性符合要求。上述結(jié)果證明，本方法可以滿足打扮品中7種染發(fā)劑的檢測要求，并最終確定采用外標(biāo)法計(jì)算樣本中7種染發(fā)劑的含量。

三家試驗(yàn)室驗(yàn)證結(jié)果說明，回收率、縝密度、標(biāo)準(zhǔn)曲線均符合要求，證明所建立方法可作為打扮品中7種染發(fā)劑的檢測方法.

表2標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

目標(biāo)物質(zhì)堿性藍(lán)26酸性橙3堿性黃87堿性橙31酸性紫43堿性紫14堿性紅51線性范圍5～100mg/L5～100mg/L5～100mg/L5～100mg/L5～50mg/L5～50mg/L5～100mg/L線性方程Y=26000X-3500Y=1240X+304Y=1030X+208Y=18400X-1920Y=2890X-938Y=23900X-14500Y=21000X-7080線性相關(guān)系數(shù)R=0.9998R=0.9989R=0.9982R=0.9998R=0.9998R=0.9999R=0.9999表37種染發(fā)劑的檢出限和定量限

染發(fā)劑名稱檢出限（mg/kg）定量限（mg/kg）

六、專家看法與反饋（會議時間：2023年9月）

根據(jù)國家食品藥品監(jiān)視管理局保化司（以下稱?；荆┯嘘P(guān)打扮品中禁限用物質(zhì)檢測方法委托工作的要求，XX省保健食品打扮品協(xié)會組織完成了打扮品中馬來酸二乙酯、環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷、17種著色劑的檢測方法研究。并于2023年9月20日，就上述檢測方法，組織召開專家論證會。

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堿性紅510.060.2堿性紫140.060.2酸性堿性橙紫43310.62.01.23.5堿性黃873.010酸性橙31.23.5堿性藍(lán)260.62.0與會專家認(rèn)真聽取了項(xiàng)目承受單位關(guān)于檢測方法、編制說明、驗(yàn)證報(bào)告的匯報(bào)，審閱了檢測方法，并進(jìn)行了探討，一致認(rèn)為：

一、XX省保健食品打扮品協(xié)會建立的打扮品中馬來酸二乙酯、環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷、17種著色劑的檢測方法，基本滿足現(xiàn)階段打扮品中上述禁限用物質(zhì)的檢測要求。

二、檢測方法的書寫較規(guī)范、內(nèi)容較全面。與會專家對上述檢測方法分別提出了具體修改建議。

建議項(xiàng)目承受單位依照本次會議看法，對打扮品中馬來酸二乙酯、環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷、17種著色劑的檢測方法，進(jìn)行修改完善后報(bào)國家食品藥品監(jiān)視管理局保化司。

七、國家食藥監(jiān)局?；窘M織專家論證會（2023年11月16日）專家建議進(jìn)一步補(bǔ)充完善后，提交國家食藥監(jiān)局?；?。

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打扮品中7種染發(fā)劑的檢測方法編制說明

第一部分基本信息

1簡介

染發(fā)劑由于其功能性的作用，被廣泛的應(yīng)用于打扮品特別是染發(fā)劑和燙發(fā)劑。打扮品中使用的染發(fā)劑多數(shù)是化學(xué)合成，長期或過量使用都會對人體健康產(chǎn)生潛在的危害，有的染發(fā)劑會引起人的過敏反應(yīng)，有的染發(fā)劑會引起皮膚發(fā)炎，還有的會透過皮膚被人體吸收，有明顯的致突變作用，長期使用此類產(chǎn)品甚至可以誘發(fā)癌癥。為了安全起見，世界上好多國家對打扮品用染發(fā)劑做了法律性規(guī)定。我國《打扮品衛(wèi)生規(guī)范》中對打扮品用染發(fā)劑品種、使用范圍和限制條件也都作了明確的規(guī)定。目前對打扮品中常用染發(fā)劑的檢測尚未形成完整和成熟的方法，十分不利于對打扮品市場的監(jiān)管和管理。本項(xiàng)旨在借助高效液相色譜法，建立打扮品中可能添加的染發(fā)劑類物質(zhì)的檢測方法。同時為了保障打扮品質(zhì)量安全，也為了打扮品中禁用物質(zhì)行政監(jiān)管和企業(yè)自檢控制提供技術(shù)依據(jù)，特制定該批標(biāo)準(zhǔn)。2屬性信息2.1堿性橙31

2.1.1中文名：堿性橙31

2.1.2英文名稱：BASICORANGE312.1.3INCI名稱：BASICORANGE312.1.4分子式：C11H14ClN52.1.5分子量：251.715362.1.6CAS號：97404-02-92.1.7結(jié)構(gòu)式：2.1.8限定標(biāo)準(zhǔn)

《打扮品衛(wèi)生規(guī)范》2023年版規(guī)定打扮品染發(fā)劑中最大允許使用濃度0.2%。當(dāng)與氧化乳混合使用時,最大使用濃度應(yīng)為0.1%。

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2.2堿性黃87

2.2.1中文名：堿性黃872.2.2英文名稱：BasicYellow872.2.3INCI名稱：Basicyellow872.2.4分子式：C15H19N3O4S2.2.5分子量：337.394062.2.6CAS號：116844-55-42.2.7結(jié)構(gòu)式：2.2.8限定標(biāo)準(zhǔn)

《打扮品衛(wèi)生規(guī)范》2023年版規(guī)定打扮品中最大允許使用濃度：0.2%。當(dāng)與氧化乳混合使用時,最大使用濃度應(yīng)為0.1%。2.3堿性紅51

2.3.1中文名：堿性紅512.3.2英文名稱：BASICRED51;2.3.3INCI名稱：Basicred512.3.4分子式：C14H18CIN52.3.5分子量：279.772.3.6CAS號：12270-25-62.3.7結(jié)構(gòu)式：2.3.8限定標(biāo)準(zhǔn)

《打扮品衛(wèi)生規(guī)范》2023年版規(guī)定打扮品中最大允許使用濃度：0.2%。當(dāng)與氧化乳混合使用時,最大使用濃度應(yīng)為0.1%。2.4堿性紫14

2.4.1中文名：堿性紫14，堿性品紅2.4.2英文名稱：FUCHSINBASIC2.4.3INCI名稱：BasicViolet142.4.4分子式：C20H20ClN32.4.5分子量：337.852.4.6CAS號：632-99-52.4.7CI號：CI42510

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2.4.8結(jié)構(gòu)式：2.4.9限定標(biāo)準(zhǔn)

《打扮品衛(wèi)生規(guī)范》2023年版規(guī)定打扮品中最大允許使用濃度：0.3%。當(dāng)與氧化乳混合使用時,最大使用濃度應(yīng)為0.15%。2.4.10理化特性

黃綠色閃光結(jié)晶塊狀或砂狀物。溶于冷、熱水中呈紅紫色，極易溶于酒精中呈紅色。遇濃硫酸呈黃棕色，稀釋后幾乎無色。其水溶液加氫氧化鈉液呈帶有紅色沉淀的幾乎無色液體。2.5酸性紫43

2.5.1中文名：酸性紫43

2.5.2英文名稱：JAROCOLVIOLET432.5.3INCI名稱：AcidViolet432.5.4分子式：C21H14NNaO6S2.5.5分子量：431.392.5.6CAS號：224-618-72.5.7CI號：CI607302.5.8結(jié)構(gòu)式：2.5.9限定標(biāo)準(zhǔn)

《打扮品衛(wèi)生規(guī)范》2023年版規(guī)定打扮品中最大允許使用濃度：1.0%。當(dāng)所用染發(fā)劑純度不得<80%,其雜質(zhì)含量必需符合以下要求:揮發(fā)性成分(135℃)及氯化物和硫酸鹽(以鈉鹽計(jì))小于18%,水不溶物不得小于0.4%,1-羥基-9,10-蒽二酮(1-hydroxy-9,10-anthracenedione)小于0.2%,p-甲苯胺(p-toluidine)小于0.1%,p-甲苯胺磺酸鈉(p-tolluidinesulfonicacids,sodiumsalts)小于0.2%,其它染發(fā)劑(subsidiarycolors)小于1%,鉛小于20mg/kg,砷小于3mg/kg,汞小于1mg/kg。2.5.10理化特性

溶于乙醇。于濃硫酸中呈藍(lán)色，稀釋后呈橄欖棕色，并伴有紫色沉淀產(chǎn)生。2.6酸性橙3

2.6.1中文名：酸性橙3

2.6.2英文名稱：ACIDORANGE32.6.3INCI名稱：AcidOrange3

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2.6.4分子式：C18H13N4NaO7S2.6.5分子量：452.37319

2.6.6CAS號：228-921-52.6.7結(jié)構(gòu)式：2.6.8限定標(biāo)準(zhǔn)

《打扮品衛(wèi)生規(guī)范》2023年版規(guī)定在打扮品中最大允許使用量：0.2%。2.6.9理化特性

橙黃色粉末。極易溶于冷水和熱水中，在水中溶解度為50g/L(90℃)，水溶液呈黃色。易溶于乙醇，呈橙棕色。于濃硫酸中呈黃色，稀釋后轉(zhuǎn)呈暗黃色，有沉淀產(chǎn)生。

2.7堿性藍(lán)26

2.7.1中文名：堿性藍(lán)262.7.2英文名稱：BasicBlue262.7.3INCI名稱：BasicBlue262.7.4分子式：C33H32ClN32.7.5分子量：506.092.7.6CAS號：2580-56-52.7.7CI號：CI440452.7.8結(jié)構(gòu)式：2.7.9限定標(biāo)準(zhǔn)

《打扮品衛(wèi)生規(guī)范》2023年版規(guī)定打扮品中最大允許使用濃度：0.5%。當(dāng)與氧化乳混合使用時,最大使用濃度應(yīng)為0.25%。。2.7.10理化特性

深紫色(或灰綠色閃光)粉末。溶于冷水、熱水均呈藍(lán)色。溶于乙醇呈藍(lán)色。于濃硫酸中呈紅光棕色，稀釋后由黃變綠再變?yōu)樗{(lán)色。于濃硝酸中呈橄欖綠色。其水溶液參與氫氧化鈉產(chǎn)生暗紅棕色沉淀；參與鹽酸產(chǎn)生藍(lán)色沉淀。

-13-

其次部分方法選擇與優(yōu)化

1分析方法及其條件的選擇與優(yōu)化1.1分析方法的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道打扮品中染發(fā)劑適用于高效液相色譜分開與檢測。2023版《打扮品衛(wèi)生規(guī)范》中只是規(guī)定了“打扮品組分中暫時允許使用的染發(fā)劑〞的種類，并未對其方法進(jìn)行限定。目前國內(nèi)外的檢測方法有高效液相色譜-紫外可見檢測法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法及高效液相色譜-二極管陣列檢測法等，本方法表37種染發(fā)劑的紫外吸收光譜圖

序號1染發(fā)劑名稱堿性橙31最大吸收波長4882堿性黃87412.83堿性紅51525.84堿性紫14550.35酸性紫43569.86酸性橙3370.67堿性藍(lán)26616.3光譜圖-16-

第三部分方法學(xué)驗(yàn)證

1試驗(yàn)室內(nèi)部檢測方法驗(yàn)證1.1方法特異性

在燙發(fā)劑空白樣品中參與染發(fā)劑的混標(biāo)溶液，濃度為5μg/mL按前處理方法處理空白樣品和加標(biāo)基質(zhì)后，條件進(jìn)行測試將標(biāo)準(zhǔn)溶液參與到空白樣品中，按前處理方法處理空白樣品和加標(biāo)基質(zhì)后，觀測所得色譜圖(圖1-8)，通過試驗(yàn)說明，空白中不存在干擾狀況。

圖2在616nm下測得堿性藍(lán)26的空白樣品圖譜

圖3在480nm下測得堿性橙31、堿性黃87、酸性橙3的空白樣品圖譜

圖4在520nm下測得堿性紅51、堿性紫14、酸性紫43的空白樣品圖譜

-17-

圖5616nm下測得堿性藍(lán)26（1號峰）的空白加標(biāo)色譜圖

圖6在520nm下測得堿性紅51（1號峰）、堿性紫14（2號峰）、酸性紫43（3

號峰）的空白加標(biāo)色譜圖

圖7在480nm下測得堿性橙31（1號峰）、堿性黃87（2號峰）、酸性橙3（3

號峰）的空白加標(biāo)色譜圖

1.2線性及線性范圍1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別配制染發(fā)劑混標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其中2種染發(fā)劑（酸性紫43；堿性紫14）濃度分別為5.0、10.0、20.0、30、40、50.0μg/mL，5種染發(fā)劑（酸性橙3；堿性黃87；堿性藍(lán)26；堿性紅51；堿性橙31；）濃度分別為1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μg/mL，移取10μL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，注入高效液相色譜儀中進(jìn)行測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，

-18-

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.2.2基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

稱取空白基質(zhì)5.0g置于25mL比色管中，分別參與相應(yīng)的儲存液，然后經(jīng)過確定的前處理方法，漩渦、超聲、定容，使其中2種染發(fā)劑（酸性紫43；堿性紫14）濃度分別為5.0、10.0、20.0、30、40、50.0μg/mL，5種染發(fā)劑（酸性橙3；堿性黃87；堿性藍(lán)26；堿性紅51；堿性橙31；）濃度分別為1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μg/mL。

每種濃度以10?L注入高效液相色譜儀中進(jìn)行測定，以目標(biāo)色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)、基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，建立基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。1.2.2線性范圍

通過試驗(yàn)說明繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系良好，符合標(biāo)準(zhǔn)定量要求（R≥0.998）.其線性方程見表5。

表4標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

目標(biāo)物質(zhì)堿性藍(lán)26酸性橙3堿性黃87堿性橙31酸性紫43堿性紫14堿性紅51線性范圍5～100mg/L5～100mg/L5～100mg/L5～100mg/L5～50mg/L5～50mg/L5～100mg/L線性方程Y=26000X-3500Y=1240X+304Y=1030X+208Y=18400X-1920Y=2890X-938Y=23900X-14500Y=21000X-7080

表5基質(zhì)（染發(fā)、燙發(fā)劑類）標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

目標(biāo)物質(zhì)堿性藍(lán)26酸性橙3堿性橙31酸性紫43線性范圍5～100mg/L5～100mg/L5～100mg/L5～100mg/L線性方程Y=24382X-3256Y=1080X+222Y=15544X-1450Y=2119X-636線性相關(guān)系數(shù)R=0.9991R=0.9990R=0.9992R=0.9993線性相關(guān)系數(shù)R=0.9998R=0.9989R=0.9982R=0.9998R=0.9998R=0.9999R=0.9999-19-

堿性紫14堿性紅51酸性紅875～50mg/L5～50mg/L5～100mg/LY=19783X-7820Y=17890X-4590Y=19870X-2133R=0.9995R=0.9999R=0.99991.3方法檢出限和定量下限

向不含染發(fā)劑的基質(zhì)中定量添加染發(fā)劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，按前處理方法處理后，測定峰高信噪比為10:1時添加的染發(fā)劑量確定為方法的最低定量濃度（表6）；測定峰高信噪比為3:1時添加的染發(fā)劑確定為本方法的檢出濃度（表6）。

表67種染發(fā)劑的檢出限和定量限

染發(fā)劑名稱檢出限（mg/kg）定量限（mg/kg）1.4縝密度1.4.1日內(nèi)縝密度

在一日內(nèi)進(jìn)行如下操作：向空白樣品中分別參與高低兩種濃度的染發(fā)劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，每種濃度平行配置6份，經(jīng)過已確定的預(yù)處理方法處理，通過HPLC分析檢測，所得數(shù)據(jù)（峰面積）帶入標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出相應(yīng)的濃度測量值，再利用這些測量值計(jì)算不同濃度、不同基質(zhì)的RSD值，所得RSD值如下表所示。

表7標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)溶液日內(nèi)縝密度表

名稱濃度（μg/mL）550550550550縝密度RSD(%)2.311.851.671.061.621.582.050.83堿性紅510.060.2堿性紫140.060.2酸性堿性橙紫43310.62.01.23.5堿性黃873.010酸性橙31.23.5堿性藍(lán)260.62.0堿性藍(lán)26堿性紅51堿性紫14酸性紫43-20-

染發(fā)劑3染發(fā)劑4染發(fā)劑5染發(fā)劑6染發(fā)劑7染發(fā)劑8染發(fā)劑9染發(fā)劑10染發(fā)劑11染發(fā)劑12染發(fā)劑13染發(fā)劑14染發(fā)劑15染發(fā)劑16染發(fā)劑17染發(fā)劑18染發(fā)劑19染發(fā)劑20染發(fā)劑21染發(fā)劑22燙發(fā)劑1燙發(fā)劑2燙發(fā)劑3燙發(fā)劑4燙發(fā)劑5燙發(fā)劑6燙發(fā)劑7燙發(fā)劑8燙發(fā)劑9燙發(fā)劑10燙發(fā)劑11燙發(fā)劑12燙發(fā)劑13燙發(fā)劑14燙發(fā)劑15燙發(fā)劑16燙發(fā)劑17燙發(fā)劑18燙發(fā)劑19燙發(fā)劑20燙發(fā)劑21未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出103未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出211未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出105.6未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出98.6未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出2、試驗(yàn)室間方法比對驗(yàn)證2.1檢測單位

-26-

⑴XX省疾病預(yù)防控制中心，簡稱省疾控。

⑵XX省醫(yī)療器械與藥品包裝材料檢驗(yàn)所，簡稱包材所。⑶XX出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，簡稱出入境。2.2檢驗(yàn)內(nèi)容

表16不同試驗(yàn)室對染發(fā)劑的驗(yàn)證線性曲線及線性范圍

染發(fā)劑堿性藍(lán)26驗(yàn)證單位省疾控包材所出入境省疾控包材所出入境省疾控包材所出入境省疾控包材所出入境省疾控包材所出入境省疾控包材所出入境省疾控包材所出入境線性方程Y=25264X-4120Y=23756X-1240Y=25425X+2085Y=1060X+410Y=1130X+350Y=1220X+320Y=1070X+1030Y=920X+720Y=1230X-511Y=19100X-1070Y=19040X-1750Y=17060X-1820Y=2750X-958Y=2560X-962Y=2770X-977Y=22450X-9500Y=23020X-7500Y=24270X-7700Y=20300X-7080Y=22050X-7090Y=22070X-6850線性范圍5～100mg/L5～100mg/L5～100mg/L5～100mg/L5～100mg/L5～100mg/L5～100mg/L5～100mg/L5～100mg/L5～100mg/L5～100mg/L5～100mg/L5～50mg/L5～50mg/L5～50mg/L5～50mg/L5～50mg/L5～50mg/L5～100mg/L5～100mg/L5～100mg/L線性相關(guān)系數(shù)R=0.9986R=0.9991R=0.9987R=0.9992R=0.9993R=0.9987R=0.9983R=0.9983R=0.9985R=0.9992R=0.9993R=0.9982R=0.9982R=0.9982R=0.9992R=0.9983R=0.9983R=0.9992R=0.9990R=0.9986R=0.9991酸性橙3堿性黃87堿性橙31酸性紫43堿性紫14堿性紅51表17試驗(yàn)室間驗(yàn)證縝密度

堿性藍(lán)26酸性橙3堿性黃87堿性橙31標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（μg/mL）10.050.010.050.010.050.010.050.0-27-

RSD（%）省疾控2.254.924.073.144.662.724.552.19包材所2.72.492.544.223.614.72.364.68出入境4.012.523.773.794.714.492.232.83酸性紫43堿性紫14堿性紅5110.050.010.050.010.050.04.933.673.174.914.213.383.484.163.942.983.474.042.424.823.523.173.484.86表18試驗(yàn)室間驗(yàn)證加標(biāo)回收率

驗(yàn)證單位標(biāo)物名稱堿性藍(lán)26酸性橙3堿性黃87省疾控堿性橙31酸性紫43堿性紫14堿性紅51堿性藍(lán)26酸性橙3堿性黃87包材所堿性橙31酸性紫43堿性紫14堿性紅51堿性藍(lán)26出入境酸性橙3堿性黃87加標(biāo)量（mg/kg）5.050.05.050.010.050.05.050.05.050.05.050.05.050.05.050.05.050.010.050.05.050.05.050.05.050.05.050.05.050.05.050.010.0-28-

加標(biāo)回收率（%）85.995.385.299.487.495.686.797.486.6104.988.697.491.594.988.698.093.988.289.8109.296.6100.490.599.385.5103.185.7100.185.898.687.992.088.0RSD（%）3.682.223.963.064.643.221.681.784.643.781.962.723.604.264.162.044.842.745.585.123.363.384.061.405.464.844.843.482.092.705.422.723.52堿性橙31酸性紫43堿性紫14堿性紅5150.05.050.05.050.05.050.05.050.093.988.297.189.295.985.395.289.499.42.384.324.084.604.163.183.625.542.84表19不同試驗(yàn)室驗(yàn)證樣品的檢測

驗(yàn)證單位標(biāo)物名稱堿性藍(lán)26酸性橙3堿性黃87省疾控堿性橙31酸性紫43堿性紫14堿性紅51堿性藍(lán)26酸性橙3堿性黃87包材所堿性橙31酸性紫43堿性紫14堿性紅51出入境堿性藍(lán)26酸性橙3含量（mg/kg）染發(fā)劑1染發(fā)劑2未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出109未檢出113未檢出110未檢出103未檢出未檢出215未檢出204未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出102未檢出108未檢出119未檢出112未檢出未檢出200未檢出212未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出-29-

燙發(fā)劑未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出堿性黃87堿性橙31酸性紫43堿性紫14堿性紅51

未檢出未檢出未檢出95.710010397.6未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出199192未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出

-30-

堿性橙31550550550表8基質(zhì)（染發(fā)燙發(fā)劑類）日內(nèi)縝密度表

濃度（μg/mL）5505505505505505505501.401.602.131.941.060.96堿性黃87酸性橙3名稱縝密度RSD(%)4.022.983.763.042.932.663.482.183.653.014.333.563.863.62堿性藍(lán)26堿性紅51堿性紫14酸性紫43堿性橙31堿性黃87酸性橙31.4.2日間縝密度

分別向空白基質(zhì)樣品中分別參與高低兩種濃度的染發(fā)劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，每種濃度各配置1份，經(jīng)過已確定的預(yù)處理方法處理，通過HPLC分析檢測，所得數(shù)據(jù)（峰面積）帶入標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出相應(yīng)的濃度測量值。每日重復(fù)上述操作，并連續(xù)重復(fù)進(jìn)行3天，利用這3天的測量值計(jì)算不同濃度、不同基質(zhì)的RSD值，所得RSD值如下表所示。

表9標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)溶液日間縝密度表

名稱濃度（μg/mL）550-21-

縝密度RSD(%)2.672.03堿性藍(lán)26堿性紅51550550550550550550表10基質(zhì)（染發(fā)燙發(fā)劑類）日間縝密度表

濃度（μg/mL）5505505505505505505502.662.342.111.782.661.983.342.093.682.452.682.17堿性紫14酸性紫43堿性橙31堿性黃87酸性橙3名稱縝密度RSD(%)4.934.065.393.724.483.494.13.514.834.384.463.634.293.38堿性藍(lán)26堿性紅51堿性紫14酸性紫43堿性橙31堿性黃87酸性橙31.6回收率

分別向空白基質(zhì)樣品中分別參與高低兩種濃度的染發(fā)劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，每種加標(biāo)量平行配置6份，經(jīng)過已確定的預(yù)處理方法處理，通過HPLC分析檢測，所得數(shù)據(jù)（峰面積）分別帶入溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線和方法標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出相應(yīng)的百分含量，再利用這

-22-

些測量值計(jì)算不同濃度、不同基質(zhì)的RSD值，所得RSD值如下表所示。

表11（染發(fā)劑）回收率統(tǒng)計(jì)表

待測物堿性橙31堿性黃87堿性紅51堿性紫14酸性紫43酸性橙3堿性藍(lán)26添加量（mg/kg）5.05010.0505.05010.05010.0505.0505.050RSD（%）2.403.062.741.942.622.983.901.225.101.555.344.933.143.40

表12（燙發(fā)劑）回收率統(tǒng)計(jì)表

待測物堿性橙31堿性黃87堿性紅51堿性紫14酸性紫43酸性橙3堿性藍(lán)261.7穩(wěn)定性

添加量（mg/kg）5.05010.0505.05010.05010.0505.0505.050RSD（%）2.492.833.714.682.983.232.282.912.601.841.164.851.474.91方法回收率（%）87.894.587.094.086.789.586.491.585.989.089.489.487.385.2提取回收率（%）91.498.489.092.3104.392.587.292.788.494.694.798.594.586.7方法回收率（%）84.796.384.293.786.199.585.394.187.691.989.798.985.094.2提取回收率（%）85.597.686.799