《生物化學(xué)》實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書

/《生物化學(xué)》實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書適用專業(yè)：生物技術(shù)、生物工程、食品科學(xué)與工程生物與食品工程學(xué)院生物科學(xué)系

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)則為了保證生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行,培養(yǎng)同學(xué)們掌握良好、規(guī)范的生物化學(xué)基本實(shí)驗(yàn)技能,特制定以下實(shí)驗(yàn)細(xì)則，請同學(xué)們嚴(yán)格遵守.實(shí)驗(yàn)前應(yīng)提前預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書并復(fù)習(xí)相關(guān)知識。嚴(yán)格按照生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)分組，分批進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，不得遲到。非本實(shí)驗(yàn)組的同學(xué)不準(zhǔn)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室。進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室必須穿實(shí)驗(yàn)服。各位同學(xué)進(jìn)入各自實(shí)驗(yàn)小組實(shí)驗(yàn)臺后，保持安靜,不得大聲喧嘩和嬉戲，不得無故離開本實(shí)驗(yàn)臺隨便走動。絕對禁止用實(shí)驗(yàn)儀器或藥物開玩笑。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)保持實(shí)驗(yàn)臺的整潔，廢液倒入廢液桶中,用過的濾紙放入垃圾桶中,禁止直接倒入水槽中或隨地亂丟.實(shí)驗(yàn)中要注意節(jié)約藥品與試劑,愛護(hù)儀器,使用前應(yīng)了解使用方法，使用時(shí)要嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，不得擅自移動實(shí)驗(yàn)儀器。否則，因非實(shí)驗(yàn)性損壞,由損壞者賠還。使用水、火、電時(shí)，要做到人在使用，人走關(guān)水、斷電、熄火。做完實(shí)驗(yàn)要清洗儀器、器皿，并放回原位，擦凈桌面。實(shí)驗(yàn)后,要及時(shí)完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。2006年１月目錄生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)則···································1目錄··············································2實(shí)驗(yàn)1蛋白質(zhì)的沉淀、變性反應(yīng)······················3實(shí)驗(yàn)2醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白·············6實(shí)驗(yàn)3SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量···11實(shí)驗(yàn)4凝膠過濾層析法測定蛋白質(zhì)分子量·············16實(shí)驗(yàn)５ＤNA的瓊脂糖凝膠電泳······················２0實(shí)驗(yàn)６唾液淀粉酶的性質(zhì)和活力測定·················24實(shí)驗(yàn)７生物氧化與電子傳遞·························２5實(shí)驗(yàn)８植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)氨基作用·······················27實(shí)驗(yàn)1?蛋白質(zhì)的沉淀、變性反應(yīng)(3學(xué)時(shí))目的要求１．加深對蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的認(rèn)識。２.了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其實(shí)用意義.３。了解蛋白質(zhì)變性與沉淀的關(guān)系。原理在水溶液中，蛋白質(zhì)分子表面形成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的膠體顆粒,所以蛋白質(zhì)溶液和其他親水膠體溶液相類似。但是，蛋白質(zhì)膠體顆粒的穩(wěn)定性是有條件的，相對的。在一定的物理化學(xué)因素影響下，蛋白質(zhì)顆粒失去電荷,脫水,甚至變性，則以固態(tài)形式從溶液中析出，這個過程稱為蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng).這種反應(yīng)可分為以下兩種類型:1．可逆沉淀反應(yīng)在發(fā)生沉淀反應(yīng)時(shí),蛋白質(zhì)雖已沉淀析出，但它的分子內(nèi)部、空間結(jié)構(gòu)并未發(fā)生顯著變化，基本上保持原有的性質(zhì)，沉淀因素除去后，能再溶于原來的溶劑中。這種作用稱為可逆沉淀反應(yīng)。如大多數(shù)蛋白質(zhì)的鹽析作用或在低溫下用乙醇（或丙酮）短時(shí)間作用于蛋白質(zhì)以及利用等電點(diǎn)的沉淀，提純蛋白質(zhì)時(shí),常利用此類反應(yīng)。２.不可逆沉淀反應(yīng)在發(fā)生沉淀反應(yīng)時(shí),蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)、空間構(gòu)象遭到破壞,失去原來的天然性質(zhì),這時(shí)蛋白質(zhì)已發(fā)生變性。這種變性蛋白質(zhì)的沉淀不能再溶解于原來溶劑中的作用稱為不可逆沉淀反應(yīng)。重金屬鹽、生物堿試劑,強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、加熱、震蕩、超聲波、有機(jī)溶劑等都能使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆沉淀反應(yīng)。蛋白質(zhì)變性后,有時(shí)由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在（如電荷）并不析出，因此，變性蛋白質(zhì)不一定都表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已變性。試劑和器材一、試劑1。蛋白質(zhì)溶液：10ml／組取5ml雞或鴨蛋清，用蒸餾水稀釋至１０0mｌ，攪拌均勻后用4—8層紗布過濾，新鮮配置。２.蛋白質(zhì)氯化鈉溶液：３ｍｌ/組取20ml蛋清，加蒸餾水20０ml和飽和氯化鈉溶液１00ｍl，充分?jǐn)噭蚝?以紗布濾去不溶物（加入氯化鈉的目的是溶解球蛋白）。3。其余試劑：硫酸銨粉末（10克/組），飽和硫酸銨溶液（150ｍl），3%硝酸銀（280ｍl），0.５%乙酸鉛（２00mｌ），濃硫酸（5ｍl／組),5％磺基水楊酸（1０0ml）,0。1％硫酸銅（1０0ml)，飽和硫酸銅溶液（4００mｌ）,0．１％乙酸(50０mｌ),10％乙酸（5０0ｍl）,飽和氯化鈉溶液（25ｍl)，１０%氫氧化鈉溶液（50０mｌ）。二、器材試管（15支/組)，過濾漏斗（1個），試管架1個／組，玻璃棒1支／組，沸水浴4臺,量筒（總需要20ml×1,200ml×1）,燒杯(總需要100ml×2，4００×2）,試劑瓶（12個／組，附膠頭滴管10支/組)，移液管（5ml×６/組,１ml×３/組)，濾紙１盒,洗瓶1個/組，廢液缸1個/組,藥匙1個/組，移液管架1個/組操作方法一、蛋白質(zhì)的可逆沉淀反應(yīng)—蛋白質(zhì)的鹽析作用(分級鹽析）二、蛋白質(zhì)的不可逆沉淀反應(yīng)1.重金屬沉淀蛋白質(zhì)２。酸沉淀蛋白質(zhì)1)2）3.加熱沉淀蛋白質(zhì)取5支試管，編號,按下表加入有關(guān)試劑（單位/滴）。試劑試劑管號蛋白質(zhì)溶液0.1％乙酸10%乙酸飽和氯化鈉10％氫氧化鈉蒸餾水１2３4510１01０１0１０-5————-55-———2—-———2722—5將各管混勻,觀察記錄各管現(xiàn)象后，放入沸水浴中加熱1０miｎ,比較各管的沉淀情況.思考題1。名詞解釋：水化層;雙電層；蛋白質(zhì)變性；鹽溶與鹽析；蛋白質(zhì)等電點(diǎn)沉淀。2。將實(shí)驗(yàn)結(jié)果寫在實(shí)驗(yàn)報(bào)告中操作方法的對應(yīng)位置上并就實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象作簡要解釋。3。根據(jù)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象,討論下列問題:蛋白質(zhì)可逆沉淀與不可逆沉淀的本質(zhì)區(qū)別是什么？簡述蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)、變性作用和凝固作用的相互關(guān)系。4.作為殺菌劑,氯化汞是怎樣起作用的?

實(shí)驗(yàn)2 醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白（4學(xué)時(shí))目的要求學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)電泳的一般原理及方法。掌握用醋酸纖維素薄膜電泳分離蛋白質(zhì)的操作技術(shù)。原理帶電顆粒在電場的作用下，向著與其電性相反的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳。帶電顆粒之所以能在電場中向一定的方向移動，并具有一定的遷移速度，是取決于帶電顆粒本身性質(zhì)的影響,以及電場強(qiáng)度、溶液的pH值、離子強(qiáng)度及電滲等因素的影響。蛋白質(zhì)具有兩性性質(zhì),在溶液中可解離的基團(tuán)除肽鏈末端的α—氨基和α—羧基外，還有很多側(cè)鏈基團(tuán)在一定的ｐH條件下能解離而使蛋白質(zhì)帶電。當(dāng)溶液的pＨ>pI（等電點(diǎn)）時(shí),蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷,在電場中向正極移動，而的ｐH〈pI時(shí),則帶正電荷，電泳時(shí)向負(fù)極移動。由于蛋白質(zhì)分子在溶液中解離成帶電的顆粒，所以在電場中除等電點(diǎn)外均能定向泳動，其電泳的方向和速度主要決定于所帶電荷的性質(zhì)，以及所帶電荷數(shù)量、顆粒大小和形狀。不同的帶電顆粒在同一電場中泳動速度不同,常用遷移率來表示.遷移率的定義是指帶電顆粒在單位電場強(qiáng)度下的泳動速度。其計(jì)算公式如下：式中：ｍ為遷移率(cm２/V·s）；v為顆粒的泳動速度（cm/s）；E為電場強(qiáng)度（V／cm）；d為顆粒泳動的距離（ｃm）；ｌ為支持物的有效長度(ｃm)；V為實(shí)際電壓（Ｖ)；t為電泳時(shí)間（ｓ）.各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、分子量及顆粒大小各不相同,在某一指定的pＨ值溶液中，各種蛋白質(zhì)所帶的電荷不同，因而在電場中遷移的方向和速度不同。根據(jù)這個原理，就可以從蛋白質(zhì)混合物中將各種蛋白質(zhì)分離出來。因此，電泳技術(shù)在生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究中被廣泛用于生物大分子或小分子（如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸等）的分離純化與分析鑒定等。同時(shí)此項(xiàng)技術(shù)也普遍用于臨床診斷和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中,并已發(fā)展成為這些部門的重要分析分離手段。醋酸纖維素薄膜電泳是以醋酸纖維素薄膜為支持物的一種區(qū)帶電泳。這種薄膜具有均一的泡沫狀結(jié)構(gòu)，厚度為120m，滲透性強(qiáng)，對樣品無吸附作用，用它作支持物進(jìn)行電泳，電泳效果比紙電泳好，具有樣品用量少，分離速度快,電泳圖譜更為清晰，靈敏度也較高（5以上）等優(yōu)點(diǎn)。目前已廣泛應(yīng)用于血清蛋白、血紅蛋白、脂蛋白、同工酶的分離和測定等方面。本實(shí)驗(yàn)以醋酸纖維素薄膜為電泳支持物，分離各種血清蛋白。血清中含有清蛋白、α—球蛋白、β-球蛋白、γ—球蛋白和各種脂蛋白等。各種蛋白質(zhì)由于氨基酸組分、立體構(gòu)象、分子量、等電點(diǎn)及形狀不同(如圖2－１),在電場中遷移速度不同。分子量小、等電點(diǎn)低、在相同堿性pH緩沖體系中、帶負(fù)電荷多的蛋白質(zhì)顆粒在電場中遷移速度快.例如，正常人血清在pH８.6的緩沖體系中電泳1h左右，染色后可顯示５條區(qū)帶。清蛋白泳動最快，其余依次為α1，α2,β—及γ—球蛋白（如圖２—2）。這些區(qū)帶經(jīng)洗脫后可用分光光度法定量,也可直接進(jìn)行光吸收掃描自動繪出區(qū)帶吸收峰及相對百分比。臨床醫(yī)學(xué)常利用它們間相對百分比的改變或異常區(qū)帶的出現(xiàn)作為臨床鑒別診斷的依據(jù)。蛋白質(zhì)名稱等電點(diǎn)（pI)分子量清蛋白α－球蛋白β-球蛋白γ—球蛋白４.88５．０65。126。85——7.5０69000α1—２00000α2-300000９00０0——15000０15６000--300０0０圖2－1人血清中5種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)及分子量圖2-2正常人血清醋酸纖維素薄膜電泳示意圖1為清蛋白（或稱為白蛋白）,2、3、4、５分別為α1-、α2-、β-及γ—球蛋白，6為點(diǎn)樣原點(diǎn)試劑和器材一、測試材料未溶血的人或動物血清.二、試劑１．巴比妥—巴比妥鈉緩沖液（PＨ8。6，0。07ｍol/Ｌ,離子強(qiáng)度０.0６）：稱取1.６６g巴比妥（AＲ）和1２.76g巴比妥鈉(AR)，置于三角燒瓶中，加蒸餾水約600mｌ，稍加熱溶解，冷卻后用蒸餾水定容至1000ｍl.置4℃2．染色液（０.5％氨基黑1０B）：稱取0．5g氨基黑10B,加蒸餾水40ml,甲醇(AR)５0ｍl,冰乙酸(AR)１0ｍl，混勻溶解后置具塞試劑瓶內(nèi)貯存。漂洗液：?。?％乙醇(AR）45mｌ,冰乙酸（ＡＲ）5ml和蒸餾水５0ml,混勻置具塞試劑瓶內(nèi)貯存。4．透明液：臨用前制備.甲液:取冰乙酸(AR)15ml,無水乙醇(AR）85ml，混勻置試劑瓶內(nèi),塞緊瓶塞,備用。乙液：取冰乙酸（AR）2５mｌ,無水乙醇（AＲ）75ml，混勻置試劑瓶內(nèi)，塞緊瓶塞，備用。5。保存液：液體石蠟.６．定量洗脫液(０.4mｏｌ／ＬN(yùn)ａOＨ溶液）：稱取1６g氫氧化鈉(AR）用少量蒸餾水溶解后定容至１000ｍl。三、器材醋酸纖維素薄膜(2×8cm），培養(yǎng)皿(直徑9—10cm）,解剖鑷子，點(diǎn)樣器，直尺和鉛筆，電泳儀及電泳槽,玻璃板(１2×12ｃｍ）,試管及試管架,吸量管（2ｍｌ，5ｍｌ），吹風(fēng)機(jī)，普通濾紙。操作方法一、薄膜與儀器的準(zhǔn)備１．醋酸纖維素薄膜的潤濕與選擇用鑷子取一片薄膜,小心地平放在盛有緩沖液的平皿中.若漂浮于液面的薄膜在15—30s內(nèi)迅速潤濕，整條薄膜色澤深淺一致，則此膜均勻可用于電泳；若薄膜潤濕緩慢,色澤深淺不一或有條紋及斑點(diǎn)等，則表示薄膜不均勻應(yīng)棄去,以免影響電泳結(jié)果。將選好的薄膜用鑷子輕壓，使其完全浸泡于緩沖液中約30miｎ后,方可用于電泳。電泳槽的準(zhǔn)備根據(jù)電泳槽膜支架的寬度,裁剪尺寸合適的濾紙條。在兩個電極槽中,各倒入等體積的電極緩沖液，在電泳槽的兩各膜支架上,各放兩層濾紙條，使濾紙一端的長邊與支架前沿對齊，另一端侵入電極緩沖液內(nèi)。當(dāng)濾紙條全部潤濕后,用玻璃棒輕輕擠壓在膜支架上的濾紙以驅(qū)趕氣泡，使濾紙的一端能緊貼在膜支架上。濾紙條是兩個電極槽聯(lián)系醋酸纖維素薄膜的橋梁,因而稱為濾紙橋。電極槽的平衡用平衡裝置（或自制平衡管）連接兩個電泳槽，使兩個電極槽內(nèi)的緩沖液彼此處于同一水平狀態(tài),一般需平衡１５-20miｎ，注意,取出平衡裝置時(shí)應(yīng)將活塞關(guān)緊.點(diǎn)樣制備點(diǎn)樣模板取一張干凈濾紙（１0×10cm),在距紙邊1．5cｍ處用鉛筆劃一平行線，此線為點(diǎn)樣標(biāo)志區(qū).點(diǎn)樣用鑷子取出浸透的薄膜，夾在兩層濾紙間輕輕按壓,吸去多余的緩沖液。無光澤面向上平放在點(diǎn)樣模板上，使其底邊與模板底邊對齊。點(diǎn)樣區(qū)距陰極端１.5cm處。點(diǎn)樣時(shí)，先用玻片一端截面沾取一定量的血清，然后將沾有樣品的玻片截面垂直地與纖維素薄膜點(diǎn)樣區(qū)處輕輕接觸,樣品即呈一條線“印”在薄膜上,(如圖2-3）使血清完全滲透至薄膜內(nèi)，形成細(xì)窄而均勻的直線。此步是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵,點(diǎn)樣前應(yīng)在濾紙上反復(fù)練習(xí)，掌握點(diǎn)樣技術(shù)后再正式點(diǎn)樣.圖２-3醋酸纖維素薄膜規(guī)格及點(diǎn)樣位置示意圖虛線處為點(diǎn)樣位置電泳用鑷子將點(diǎn)樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點(diǎn)樣面朝下)，另一端平貼在陽極端支架上，如圖所示.要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂。如一電泳槽中同時(shí)安放幾張薄膜,則薄膜之間應(yīng)相隔幾毫米。蓋上電泳槽蓋，使薄膜平衡10mｉn.圖２－４電泳裝置剖視示意圖1．濾紙橋２.電泳槽３。醋酸纖維素薄膜4．電泳槽支架５。電極室中央隔板用導(dǎo)線將電泳槽的正、負(fù)極分別連接，注意不要接錯。在室溫下電泳，打開電源開關(guān),用電泳儀上細(xì)調(diào)節(jié)旋扭調(diào)到每厘米膜寬電流強(qiáng)度為０。3mＡ（8片薄膜則為4。8mA）。通電10-15min后，將電流調(diào)節(jié)到每厘米膜寬電流強(qiáng)度為0。5mA（8片共8mＡ),電泳時(shí)間約5０—80min。電泳后調(diào)節(jié)旋扭使電流為零，關(guān)閉電泳儀切斷電源。染色與漂洗血清蛋白染色與漂洗脫色用解剖鑷子取出電泳后的薄膜,放在含0.5％氨基黑1０B染色液的培養(yǎng)皿中，浸染5min。取出后再用漂洗液浸洗、脫色，每隔１０ｍiｎ換漂洗液一次，連續(xù)數(shù)次，直至背景藍(lán)色脫盡.取出薄膜放在濾紙上,用吹風(fēng)機(jī)的冷風(fēng)將薄膜吹干。五、透明將脫色吹干后的薄膜浸入透明甲液中２min，立即放入透明乙液中浸泡1mｉn,取出后立即緊貼于干凈玻璃板上，兩者間不能有氣泡。約2—3min薄膜完全透明。若透明太慢可用滴管取透明乙液少許在薄膜表面淋洗一次,垂直放置待其自然干燥,或用吹風(fēng)機(jī)冷風(fēng)吹干且無酸味。再將玻璃板放在流動的自來水下沖洗,當(dāng)薄膜完全潤濕后用單面刀片撬開薄膜的一角，用手輕輕將透明的薄膜取下,用濾紙吸干所有的水分，最后將薄膜置液體石蠟中浸泡3miｎ，再用濾紙吸干液體石蠟，壓平。此薄膜透明，區(qū)帶著色清晰,可用于光吸收計(jì)掃描。長期保存不褪色。注意事項(xiàng)醋酸纖維素薄膜的預(yù)處理市售醋酸纖維素薄膜均為干膜片，薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的重要關(guān)鍵之一。將干膜片漂浮于電極緩沖液表面，其目的是選擇膜片厚薄均勻，如漂?。保怠?0s時(shí)，膜片吸水不均勻，則有白色斑點(diǎn)或條紋，這提示膜片厚薄不均勻，應(yīng)棄去不用,以免造成電泳后區(qū)帶扭曲,界限不清，背景脫色困難,結(jié)果難以重復(fù)。由于醋酸纖維素薄膜親水性比紙小,浸泡30ｍin以上是保證膜片上有一定量的緩沖液,并使其恢復(fù)到原來多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。最好是讓漂浮于緩沖液的薄膜吸滿緩沖液后自然下沉,這樣可將膜片上聚集的小氣泡趕走。點(diǎn)樣時(shí)，應(yīng)將膜片表面多余的緩沖液用濾紙吸去，以免緩沖液太多引起樣品擴(kuò)散.但也不能吸得太干,太干則樣品不易進(jìn)入薄膜的網(wǎng)孔內(nèi)，而造成電泳起始點(diǎn)參差不齊，影響分離效果。吸干的程度以不干不濕為宜。為防止指紋污染，取膜時(shí)，應(yīng)戴指套或用夾子.緩沖液的選擇醋酸纖維素薄膜電泳常選用pH8.6巴比妥緩沖液，其濃度為0.0５-0。09mol/Ｌ。選擇何種濃度與樣品及薄膜的厚薄有關(guān)。在選擇時(shí)，先初步定下某一濃度,如電泳槽電極之間的膜長度為8—１0cｍ，則需電壓２5Ｖ/cm膜長,電流強(qiáng)度為0。４-０。5ｍA/ｃm膜寬.當(dāng)電泳時(shí)達(dá)不到或超過這個值時(shí)，則應(yīng)增加緩沖液濃度或進(jìn)行稀釋。緩沖液濃度過低，則區(qū)帶泳動速度快,并由于擴(kuò)散變寬;緩沖液濃度過高，則區(qū)帶泳動速度慢，區(qū)帶分布過于集中，不易分辨.3.加樣量加樣量的多少與電泳條件、樣品的性質(zhì)、染色方法與檢測手段靈敏度密切相關(guān)。作為一般原則，檢測方法越靈敏，加樣量越少，對分離更有利。如加樣量過大,則電泳后區(qū)帶分離不清楚，甚至互相干擾，染色也較費(fèi)時(shí)。如電泳后用洗脫法定量時(shí)，每厘米加樣線上需加樣品0.1—5μL，約相當(dāng)５—－１00０μg蛋白。血清蛋白常規(guī)電泳分離時(shí),每厘米加樣線加樣量不超過1μL，相當(dāng)于6０-－8０μｇ蛋白質(zhì)。但糖蛋白和脂蛋白電泳時(shí)，加樣量則應(yīng)多些。對每種樣品加樣量應(yīng)先作預(yù)實(shí)驗(yàn)加以選擇。點(diǎn)樣好壞是獲得理想圖譜的重要環(huán)節(jié)之一，以印章法加樣時(shí)，動作應(yīng)輕、穩(wěn),用力不能太重，以免將薄膜弄破或印出凹陷而影響電泳區(qū)帶分離效果。４。電量的選擇電泳過程應(yīng)選擇合適的電流強(qiáng)度，一般電流強(qiáng)度為０.4—０。5mA/cm膜寬為宜。電流強(qiáng)度高，則熱效應(yīng)高,尤其在溫度較高的環(huán)境中,可引起蛋白質(zhì)變性或由于熱效應(yīng)引起緩沖液中水分蒸發(fā),使緩沖液濃度增加,造成膜片干涸。電流過低,則樣品泳動速度慢且易擴(kuò)散。5.染色液的選擇對纖維素薄膜電泳后應(yīng)根據(jù)樣品的特點(diǎn)加以選擇。其原則是燃料對被分離樣品有較強(qiáng)的著色力,背景易脫色;應(yīng)盡量采用水溶性染料，不宜選擇醇溶性染料，以免引起醋酸纖維素薄膜溶解.應(yīng)控制染色時(shí)間。時(shí)間長，薄膜底色深不易脫去;時(shí)間太短,著色淺不易區(qū)分，或造成條帶染色不均勻,必要時(shí)可進(jìn)行復(fù)染。６.透明及保存透明液應(yīng)臨用前配制,以免冰乙酸及乙醇揮發(fā)而影響透明效果.這些試劑最好選用分析純。透明前，薄膜應(yīng)完全干燥。透明時(shí)間應(yīng)掌握好,如在透明乙液中浸泡時(shí)間太長則薄膜溶解，太短則透明度不佳。透明后的薄膜完全干燥后才能浸入液體石蠟中,使薄膜軟化。如有水，則液體石蠟不易浸入,薄膜不易展平.思考題１.名詞解釋:區(qū)帶電泳；電滲現(xiàn)象；電泳遷移率２．通過本次實(shí)驗(yàn)，討論下列問題：（1)簡述醋酸纖維薄膜電泳原理。（２)根據(jù)人血清中血清蛋白各組分等電點(diǎn),如何估計(jì)它們在ｐH8。6的巴比妥—巴比妥鈉電極緩沖液中,移動的相對位置。（3）醋酸纖維素薄膜與濾紙相比較，有哪些優(yōu)點(diǎn)？實(shí)驗(yàn)3?SＤＳ-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量（4學(xué)時(shí)）目的要求1．學(xué)習(xí)SDS—PＡＧE測定蛋白質(zhì)分子量的原理。2。掌握SDＳ—ＰAGＥ測定蛋白質(zhì)分子量的操作方法。原理聚丙烯酰胺凝膠是由單體—丙烯酰胺(acｒylamｉｄe,簡稱Ａcr)和交聯(lián)劑—N，N—甲叉雙丙烯酰胺（meｔhylｅnｅ-biｓａcrylamide，簡稱Ｂis）在加速劑和催化劑的作用下聚合而成的高分子物質(zhì)，具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和分子篩性質(zhì)。以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（ｐolｙacrｙlaｍidegeｌelectｒophｏrｅsis，簡稱PAGＥ)。由于各種蛋白質(zhì)所帶的凈電荷、分子量大小和形狀不同，在電泳中會產(chǎn)生不同的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，不連續(xù)電泳還有濃縮效應(yīng)，因而有不同的遷移率。聚丙烯酰胺凝膠由于富含酰胺基，故它是穩(wěn)定的親水凝膠。結(jié)構(gòu)中不帶電荷,因而在電場中電泳電滲現(xiàn)象極為微小。網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能限制蛋白質(zhì)大分子的擴(kuò)散運(yùn)動，具有良好的抗對流作用。在合適濃度范圍內(nèi)還具有較好的透明度，一定的機(jī)械強(qiáng)度,以及化學(xué)上惰性、吸附作用很小等許多優(yōu)點(diǎn)。十二烷基硫酸鈉（簡稱SDS）是陰離子表面活性劑,它在水溶液中，以單體和分子團(tuán)的混合形式存在.單體ＳＤS能與蛋白質(zhì)結(jié)合生成蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物。由于SDＳ帶有大量負(fù)電荷，所以生成的蛋白質(zhì)—SＤＳ復(fù)合物所帶的負(fù)電荷大大超過了天然蛋白質(zhì)原有的電荷,因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)所帶凈電荷的差異，均帶有相同密度的負(fù)電荷,.在蛋白質(zhì)溶液中，加入SDＳ和巰基乙醇，巰基乙醇可使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原，使多肽組分分成單個亞單位，SDS可使蛋白質(zhì)亞單位中的氫鍵、疏水鍵打開，因此ＳDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物形狀近似雪茄形的長橢圓棒，不同復(fù)合物的短軸相同，約1.8nm,而長軸改變則與蛋白質(zhì)的分子量成正比?；谏鲜鰞煞N情況,蛋白質(zhì)-ＳDＳ復(fù)合物在凝膠電泳中的遷移率不再受原有電荷和形狀的影響，而只是與橢圓棒的長度有關(guān)，也就是只與蛋白質(zhì)分子量有關(guān)。在電泳體系中加入十二烷基硫酸鈉（簡稱ＳDS），則電泳遷移率主要依賴于蛋白質(zhì)分子量,而與所帶的凈電荷和形狀無關(guān)，這種電泳方法稱為SＤS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（ＳＤＳ—ＰAGE).蛋白質(zhì)分子量在１0，0００-200，00０之間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系,可用下列公式表示:上式中,為蛋白質(zhì)分子量；為常數(shù)；為斜率;為相對遷移率（即蛋白質(zhì)的電泳遷移距離除以示蹤染料遷移距離）。根據(jù)上述方程將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)電泳遷移率與分子量的對數(shù)作圖，可制作出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。在相同條件下只要測得未知分子量的蛋白質(zhì)的電泳遷移率，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線求得其近似分子量.不同的凝膠濃度適用于不同的分子量范圍（見表３—1)，可根據(jù)所測分子量的范圍選擇最適凝聚濃度,并盡可能選擇分子量范圍和性質(zhì)與待測樣品相近的蛋白質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn)蛋白。凝膠濃度交聯(lián)度分子量范圍５%2。6％２5，0０0—200,000１0%2。６％10,0０0—７0，0001５％2．6％1０，000-5０，0００表3—１分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系由于ＳDS—PAＧＥ具有設(shè)備簡單、快速，分辨率和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程、醫(yī)學(xué)及免疫學(xué)等方面。SDＳ—PAGE作為一種測定蛋白質(zhì)分子量的方法,盡管對于大部分蛋白質(zhì)來說，在比較廣泛的分子量范圍內(nèi),蛋白質(zhì)的遷移率與其分子量的對數(shù)確實(shí)存在著線性關(guān)系，但是有許多蛋白質(zhì)是由亞基或兩條以上肽鏈組成的（如血紅蛋白、胰凝乳蛋白酶等）,他們在變性劑和強(qiáng)還原劑的作用下，解離成亞基或單條肽鏈。因此，對于這一類的蛋白質(zhì),SＤＳ—PＡGＥ測定的只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量，而不是完整蛋白質(zhì)的分子量.為此，對這類樣品分子量的測定,還必須采用其他測定方法作參照。當(dāng)然這也使得SDS—PAGE特別適用于寡聚蛋白及其亞基的分析鑒定和分子量的測定。另外,還有一些電荷異常和構(gòu)象特殊的蛋白質(zhì)(如組蛋白Ｆ1)，含有較大輔基的糖蛋白和含有二硫鍵較多的蛋白質(zhì)，以及一些結(jié)構(gòu)蛋白（如膠原蛋白）等,它們在SDS—凝膠系統(tǒng)中，電泳的遷移率與分子量的對數(shù)不呈線性關(guān)系。因此，為了測得真實(shí)和完整的蛋白質(zhì)分子量,通常可采用多種方法進(jìn)行測定和相互驗(yàn)證。試劑與器材一、試劑1.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)試劑盒(２0次/支）：按使用說明配制２。胰蛋白酶３。連續(xù)體系ＳDS有關(guān)試劑1）0．２moｌ/ＬpH７．2磷酸鹽緩沖液:稱Ｎa2HＰＯ４·12H２O51。５8g及NaH2PO4·2H２O8。７4g,溶于重蒸水中并定容１L.２）樣品溶解液(上樣液）:10ｍｌ/組0．01mol／LpＨ7.2磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1％SDS、１%巰基乙醇、1０%甘油和０.０2％溴酚藍(lán).用來溶解標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)及待測蛋白質(zhì)樣品.配制方法見表３-2：SDＳ巰基乙醇甘油溴酚藍(lán)0.2mol/LｐH磷酸鹽緩沖液加重蒸水至最后總體積為100ｍｇ0。1ml1ml2mg0。５ｍl10ｍl表3－２連續(xù)體系樣品溶解液3)凝膠貯液:稱Ａcr3０g，Ｂｉs0．8g，加重蒸水至1０0ml,過濾后置棕色瓶內(nèi)，4℃４)凝膠緩沖液：6ｍｌ/組稱ＳＤS0.2g，加0。２mol/LpH7。2磷酸鹽緩沖液至１00ｍl。４5）1％TＥＭＥD:?。裕牛停牛模眒l,加重蒸水至100ml，置棕色瓶內(nèi)４℃６)１0％過硫酸銨（AP)：1mｌ/組稱ＡP10g，加重蒸水100ml,置棕色瓶內(nèi)47）電極緩沖液（0。1％ＳDS,0．1ｍol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液）:稱SＤＳ1克，加５００ｍｌ0.2mol/ＬｐＨ７．2磷酸鹽緩沖液,再用蒸餾水定容至1L。8）2％瓊脂（糖)粉：2０ml/組稱瓊脂(糖）2g,加100ｍl上述電極緩沖液,44。固定液:取50％甲醇４54ｍl,冰乙酸４６ml混勻。5.染色液：考馬斯亮藍(lán)R2500．125g，加上述固定液250ｍl6.脫色液：冰乙酸75ml,甲醇50ml，加蒸餾水定容至１L.二、器材夾心式垂直板電泳槽(附帶凝膠模135×1００×1.5mm，1臺／組），直流穩(wěn)壓電源(電壓300—6００V,電流5０—100ｍA），移液管（１mｌ×2/組，５ml×１／組,1０ml×2/組），燒杯（5０mｌ×3／組），細(xì)長頭的滴管1只/組，1ml注射器，微量注射器（10或5０μL），大培養(yǎng)皿(φ120—１60mm操作方法一、安裝夾心式垂直板電泳槽夾心式垂直板電泳槽操作簡單，不易滲漏.這種電泳槽兩側(cè)為有機(jī)玻璃制成的電極槽,兩個電極槽中間夾有一個凝膠模,該模由1個凵形硅膠框、長與短玻璃板及樣品槽模板（梳子）所組成.電泳槽由上貯槽（白金電極在上或面對短玻璃板)，下貯槽（白金電極在下或面對長玻璃板)和回紋冷凝管組成.兩個電極槽與凝膠模間靠貯液槽螺絲固定。各部分按下列順序組裝：裝上貯槽和固定螺絲銷釘，仰放在桌面上。將長、短玻璃板分別插到凵形硅膠框的凹形槽中.注意勿用手接觸灌膠面的玻璃.將已插好玻璃板的凝膠模平放在上貯槽上，短玻璃板應(yīng)面對上貯槽.將下貯槽的銷孔對準(zhǔn)已裝好螺絲銷釘?shù)纳腺A槽，雙手以對角線的方式旋緊螺絲帽。豎直電泳槽，用細(xì)長頭滴管吸取已熔化的2%瓊脂（糖）加在長玻璃板下端與硅膠框交界的縫隙內(nèi)，其目的是封住空隙,加瓊脂(糖)溶液時(shí)中應(yīng)避免有氣泡。二、配膠及凝膠板的制備1．配膠根據(jù)所測蛋白質(zhì)分子量范圍,選擇適宜的分離膠濃度。表3－3表示配制20ml不同濃度分離膠所需各種試劑用量(單位/ｍl）。凝膠凝膠濃度試劑5%7。5％10%凝膠貯液3０％Acr—0。８%Bis3.３3５.００６．660。２mol/LpH7.2磷酸緩沖液內(nèi)含０.2%SDS10.0010.0010.001％TEMＥD２．00２.0０2。０0重蒸餾水4．572.901．１31０％AP０．100。10０．20表3－３20mｌ不同濃度分離膠各試劑用量2．凝膠板的制備按表配制２0ml10%濃度的膠,將分離膠混合液直接倒入兩塊玻璃板的縫隙內(nèi)直至距離短玻璃板上緣0.５cm處，插入樣品槽模板。凝膠聚合約需30min,20-3０min三、加樣加樣體積要根據(jù)凝膠厚度及樣品濃度靈活掌握,一般加樣體積為10—1５μＬ。如果樣品槽中有氣泡，可用注射器針頭挑除。加樣時(shí)，將微量注射器的針頭通過電極緩沖液伸入加樣槽內(nèi)，盡量接近底部，輕輕推動微量注射器,注意針頭勿碰破凹形槽膠面。四、電泳上槽接負(fù)極,下槽接正極，打開電源,將電流調(diào)至２０mA，待樣品進(jìn)入分離膠后,將電流調(diào)至60mA，待染料前沿遷移至距硅膠框底邊1—1。5ｃm五、凝膠板剝離電泳結(jié)束后，取下凝膠模，卸下硅膠框,用不銹鋼藥鏟撬開短玻璃板，在凝膠板切下一角作為前沿標(biāo)記。在兩側(cè)溴酚藍(lán)染料區(qū)帶中心,插入細(xì)銅絲作為前沿標(biāo)記。六、染色與脫色先用固定液將凝膠固定1小時(shí)，再將染色液倒入培養(yǎng)皿內(nèi),染色40min左右,用蒸餾水漂洗數(shù)次,再用脫色液脫色，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，即可計(jì)算相對遷移率。七、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線將大培養(yǎng)皿放在一張坐標(biāo)紙上，量出加樣端距細(xì)銅絲間的距離（cm）（即染料遷移距離)以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離（ｃm)(即樣品遷移距離）,如圖所示.按下式計(jì)算相對遷移率mR:以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的分子量為縱坐標(biāo),對應(yīng)的相對遷移率為橫坐標(biāo)在半對數(shù)坐標(biāo)紙上作圖,可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測樣品相對遷移率可直接在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其分子量。圖3—1樣品及標(biāo)準(zhǔn)蛋白在連續(xù)SDS—PAGE分離示意圖樣品槽1，2,４，5，為待測樣品,樣品槽3為標(biāo)準(zhǔn)蛋白思考題名詞解釋:聚丙烯酰胺凝膠電泳中濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)；2.根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪出標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計(jì)算出待測蛋白的分子量。3。通過本次實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí),討論下列問題：1）SＤＳ—ＰＡGE用于蛋白質(zhì)分子量測定的基礎(chǔ)是什么？2）對于由多條肽鏈組成的蛋白質(zhì)，ＳＤＳ—ＰAGE能否測定出它的分子量,如何測定出？

實(shí)驗(yàn)４ 葡聚糖凝膠過濾層析法測定蛋白質(zhì)分子量(4學(xué)時(shí))目的要求1.初步掌握利用凝膠層析法測定蛋白質(zhì)分子量的原理。2.學(xué)習(xí)用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合液制作Ve,Kav對的“選擇曲線”以及測定未知蛋白質(zhì)樣品分子量的方法.原理凝膠是由膠體溶液凝結(jié)而成的固體,它們的內(nèi)部有很細(xì)微的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。目前關(guān)于凝膠層析的原理有許多假設(shè)和理論，普遍接受的是分子篩效應(yīng)。凝膠顆粒在合適的溶劑中浸泡，充分吸液膨脹，然后裝入層析柱內(nèi)，加入欲分離的混合物后,再以同一溶劑洗脫。在洗脫過程中，大分子不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外，而小分子可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，流速緩慢，以至最后流出柱外，從而使樣品中分子大小不同的物質(zhì)得到分離。對凝膠層析分離的簡單過程可用圖４-1表示。圖4-1小分子由于擴(kuò)散作用進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部而被滯留，大分子被排阻在凝膠顆粒外面，在顆粒之間迅速通過.當(dāng)凝膠裝柱后，柱床容積為“總?cè)莘e”Vｔ，它由V０，Vｉ,Ｖg三部分組成：式中V0為外容積,即存在于柱床內(nèi)凝膠顆粒外面空隙之間的水相容積,相應(yīng)于一般層析法中柱內(nèi)流動相的容積；Ｖi為內(nèi)容積,即凝膠顆粒內(nèi)部所含水相容積，相應(yīng)于一般層析法中的固定相容積；Vg為凝膠本身的容積.洗脫容積Ve是自加入樣品時(shí)算起，到組分最大濃度峰出現(xiàn)時(shí)所流出的容積，它與V0，Vi的關(guān)系為：式中Ｋd為分子量不同的溶質(zhì)在凝膠內(nèi)部和外部的分配系數(shù),只與被分離物質(zhì)分子的大小和凝膠顆?？障兜拇笮》植加嘘P(guān).上式可改寫成：Kav是有效分配系數(shù),對交聯(lián)度小的凝膠Ｋav與Kd差別較小，而對交聯(lián)度大的凝膠二者差別較大.Kav可用下式表示：根據(jù)凝膠層析原理，對同一類型化合物的特征與組分的分子量有關(guān)。流過凝膠柱時(shí),按分子大小順序流出，分子量大的走在前面.洗脫容積Ve是該物質(zhì)分子量對數(shù)的線性函數(shù)：式中,為常數(shù)，為分子量。也可以用(有效分配系數(shù)）代替，與分子量的關(guān)系同上式,只是常數(shù)不同.通常多以對分子量的對數(shù)作圖得一曲線，稱為“選擇曲線”。如圖4-2所示。選擇曲線的斜率說明凝膠性質(zhì)的一個很重要的特征。在允許的工作范圍內(nèi)，曲線愈陡，則分級愈好，而工作范圍愈窄.凝膠層析主要決定于溶質(zhì)分子量大小，每一類型的化合物如球蛋白類等都有自己特殊的選擇曲線，可用于測定未知物的分子量，測定時(shí)以使用曲線的直線部分為宜。圖4—2球蛋白分子量選擇曲線為了測定分子量，就必須知道一根特定柱的Vt，V0和Vi,從而計(jì)算出Ｋd，Kav等。Ｖ0可用不被凝膠滯留的大分子物質(zhì)的溶液,如血紅蛋白,印度黑墨水,分子量約200萬的藍(lán)色葡聚糖—20０0等有顏色的溶液，通過測定大分子物質(zhì)的洗脫曲線，洗脫峰峰頂洗出的體積就是該柱的V0值.選一種分子量小于凝膠工作范圍下限的化合物，測出其洗脫體積Ｖe，減去V０就是Vi，常用硫酸銨來測定。Vt可用下式計(jì)算：為常數(shù)3．14，為柱直徑,為凝膠床的高度.試劑和器材一、試劑1．蛋白質(zhì)樣品（采用氯化高鐵血紅素溶液8mｇ/mｌ)：2ml/組２。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合液：2ml/組3mｇ／ｍl藍(lán)色葡聚糖，8mg/ml肌紅蛋白,０.3mg/ｍlDNＰ-天冬氨酸。溶劑為含15%(V/V）甘油的洗脫緩沖液。３。藍(lán)色葡聚糖—200０（2mｇ/ml）:２ml／組４．硫酸銨（1—2mg／ml)：2ml/組5。洗脫液[0.05ｍｏｌ/LTrｉs—鹽酸溶液（pH７.5）,內(nèi)含0.1mｏl/LNaCl]:50ml0.1mｏl／LTｒｉs溶液與40.3ｍl0。１mol/L鹽酸混勻后，溶解0．585克NａCl，加水稀釋至10０ml，即得洗脫液6。SｅphaｄｅxＧ－75７.5%Bａ(Ac）2二、器材層析柱：柱管（直徑１．０~1。3cｍ;管長90～1０0ｃm)１個/組，試管(3０支/組)，玻璃棒1個/組，濾紙一盒,移液管（1ml操作方法一、一般操作方法1．凝膠的處理（教師準(zhǔn)備）將稱好的干粉傾入過量的洗脫液中，在室溫下放置，使之充分溶脹。為了縮短時(shí)間,可在沸水浴中加熱將近100℃２。裝柱裝柱前將凝膠上面過多的溶液傾出,用真空干燥器抽盡凝膠中空氣。關(guān)閉層析柱出水口,并向柱管內(nèi)加入約１/3柱容積的洗脫液，然后在緩慢攪拌下，將濃漿狀的凝膠連續(xù)地傾入柱中，使之自然沉降，待凝膠沉降約2—３cm后,打開柱的出口，調(diào)節(jié)合適的流速，使凝膠繼續(xù)沉集,待沉集的膠面上升到離柱的頂端約5ｃm處時(shí)停止裝柱，關(guān)閉出水口.接著通過23。加樣加緊上、下進(jìn)出水口夾子,以防止操作壓改變.用1ml移液管吸?。眒ｌ樣品混合液,將移液管尖端小心插入柱中液面下方１cm處,小心釋放樣品，使其在脫脂棉上端形成一個層面，過程大約需要2分鐘完成。看到樣品層剛好完全流入凝膠床時(shí)，向柱上小心的添加緩沖液至合適高度(約5cm左右），以保證流速的穩(wěn)定。（注意:不能使膠床上端無充裕的緩沖液，以防干裂)4．洗脫洗脫時(shí)，打開上、下進(jìn)出口夾子,先收集10ml流出液，用洗脫液以每管4mｌ/管流速洗脫，用試管收集流出液，并對每管編號.當(dāng)所有有色物質(zhì)洗脫下來后，關(guān)閉螺旋夾停止洗脫。然后在對應(yīng)的波長下讀各管的光吸收值。二、蛋白質(zhì)分子量的測定1。測定Ｖ0和Vi將0.５ｍl藍(lán)色葡聚糖-200０和硫酸銨混合液（2ｍg/ml）上柱、洗脫，分別測出藍(lán)色葡聚糖的洗脫體積Ve即為該柱的V０,硫酸銨的洗脫體積Ve即為該柱的Vｉ。藍(lán)色葡聚糖的洗脫峰可根據(jù)顏色判斷，硫酸銨的洗脫峰用Ba（Ａc）2判斷。２．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作按上述方法將1ｍl標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合液上柱、洗脫,用試管收集。`收集后，于以下對應(yīng)波長下讀各管的光吸收值：藍(lán)色葡聚糖(藍(lán)色）：６50nm肌紅蛋白(琥珀色）:500nmP-天冬氨酸（黃色):440nm以洗脫體積為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)作洗脫曲線。根據(jù)洗脫峰位置，量出每種蛋白質(zhì)的洗脫體積（Ｖe)，然后以蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)lgMr為縱坐標(biāo)，Ve為橫坐標(biāo),作出標(biāo)準(zhǔn)曲線.同時(shí)根據(jù)已測出的Ｖ0和Ｖi以及計(jì)算出的Vｔ，求出Kａv。也可以Ｋａv為橫坐標(biāo)，lｇMr為縱坐標(biāo)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線.３.未知樣品分子量的測定將未知樣品按標(biāo)準(zhǔn)曲線的條件操作。根據(jù)洗脫峰的位置，量出洗脫體積，也可以計(jì)算出Kav，分別由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得樣品的分子量。思考題根據(jù)實(shí)驗(yàn)中遇到的各種問題，概述做好本實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)與教訓(xùn)。凝膠過濾的介質(zhì)有哪些，各過濾介質(zhì)的異同是什么?通過本次實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí),討論SDＳ和凝膠過濾法測定蛋白質(zhì)分子量的異同.

實(shí)驗(yàn)５ DＮＡ的瓊脂糖凝膠電泳（4學(xué)時(shí))目的要求1。掌握瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理和方法。2．學(xué)習(xí)利用瓊脂糖電泳方法測定DNA片段大小。3。學(xué)習(xí)有關(guān)建立DNＡ限制性內(nèi)切酶圖譜的基本技術(shù).原理ＤNA分子在堿性環(huán)境中（pH8。3緩沖液）帶負(fù)電荷，外加電場作用下，向正極泳動.不同的DNA片段由于其電荷、分子量大小及構(gòu)型的不同,在電泳時(shí)的泳動速率就不同，從而可以區(qū)分出不同的區(qū)帶,電泳后經(jīng)溴乙錠染色,在波長254nｍ紫外光照射下，DＮＡ顯橙紅色熒光。瓊脂糖凝膠電泳對DNＡ的分離作用主要依據(jù)DNＡ的分子量及分子構(gòu)型,同時(shí)與凝膠的濃度也有密切關(guān)系。一定大小的DＮA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中，電泳遷移率不相同。不同濃度的瓊脂糖凝膠適宜分離DNＡ片段大小范圍見表1。因而要有效分離大小不同的ＤNA片段,主要是選用適當(dāng)?shù)沫傊悄z濃度.不同構(gòu)型的DＮA在瓊脂糖凝膠中的電泳速度差別較大。在分子量相當(dāng)?shù)那闆r下，不同構(gòu)型的DＮA移動速度次序如下:共價(jià)閉環(huán)DNＡ＞直線DNA＞開環(huán)的雙鏈環(huán)狀ＤＮＡ。在同一濃度的凝膠中，分子量較小的DＮA片段比較大的片段快.DNA片段的遷移距離（遷移率）與它的大小(分子量）的對數(shù)成反比。將未知DNA的遷移距離與已知分子大小的DNA標(biāo)準(zhǔn)物的電泳遷移距離進(jìn)行比較，即可計(jì)算出未知DＮA片段的大小。瓊脂糖凝膠濃度/％可分辨的線性ＤNA大小范圍/kｂ0．3６0—50．６2０-10．710-0.80．97—0。51。26—0.41.5４—0。2２.03—０.1表５—1ＤＮA大小范圍與瓊脂糖凝膠濃度的關(guān)系本實(shí)驗(yàn)采用限制性內(nèi)切酶ＨiｎdⅢ或EcoＲⅠ酶解λDNＡ的片段為標(biāo)準(zhǔn)物,建立其酶切圖譜,同時(shí)以酶解各片段的分子量為縱坐標(biāo)，以它們對應(yīng)的遷移率為橫坐標(biāo),在半對數(shù)坐標(biāo)紙上，連接各點(diǎn)繪制出測定DＮA分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒ｐB(yǎng)Ｒ３22DNA只有一個EcoRⅠ酶切位點(diǎn),酶解后成為一條線狀DNＡ,通過瓊脂糖凝膠電泳,測量酶解后線型ＤNA的遷移距離，可以直接在分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出其分子大小.試劑和器材一、試劑限制性內(nèi)切酶HinｄⅢ、ＥcoRⅠ試劑盒標(biāo)準(zhǔn)λDNA：按使用說明配制標(biāo)準(zhǔn)ｐB(yǎng)R3２2:按使用說明配制酶反應(yīng)終止液（1０×0。1mol／LEDTA，２0％Fｉｃｏll，０.25%溴酚藍(lán)）:1０μL/組稱?。?７2克EDＴA·Na2·2H2O,20克Fiｃｏll,０.２5克溴酚藍(lán),溶解后定容至１0０mｌ。電極緩沖液(5×TBE）：用前稀釋１０倍稱?。?．8８克Tris，5。5２克硼酸,0。74克EＤＴA·Na2·２H２O，溶解后用蒸餾水定容至200ml.使用前用蒸餾水稀釋１0倍，稱為TBE稀釋緩沖液（0.5×TBE)溴乙錠（EＢ）染色貯存液（1ｍg/ml)：1滴／組將10０mg溴乙錠溶于蒸餾水或電極緩沖液１00ml,棕色瓶內(nèi)封好,避光保存.EB是誘變劑，配制和使用時(shí)應(yīng)戴乳膠手套,并且不要將該溶液灑在地面或桌面上。凡是沾污過EB的器皿或物品，必須經(jīng)專門處理后，才能進(jìn)行清洗或棄去。1％瓊脂糖二、器材Eppenｄorf離心管(１.5mｌ,預(yù)先高溫高壓滅毒，3個/組）及其離心管架，電泳槽(１個/組），電泳儀(1個/2組)，凝膠塑料托盤（1個/組)，錐形瓶(10０ｍl×1,烘干),小燒杯(５0,100，２50mｌ),微量注射器（2μL×3，1５μL或２0μL×1）,一次性塑料手套（６4只),膠頭滴管（×3)，紫外反射投射儀，防護(hù)眼鏡，洗瓶2個(分別盛重蒸水和蒸餾水）,大燒杯１個,膠頭滴管2支，量筒（50ｍl×1），卡尺（學(xué)生自備）操作方法一、DNA的酶解取2只清潔、干燥、無菌的Eｐpendｏrｆ管，編號，按照限制性內(nèi)切酶HiｎdⅢ、EcｏRⅠ試劑盒說明書用量,用微量注射器加入各種試劑＼質(zhì)粒λＤＮA和pＢR32２，最后用雙蒸水補(bǔ)足至20μL,小心混勻。3７℃水浴保溫1—２ｈ，然后各小管內(nèi)加入2μL的酶反應(yīng)終止液，混勻，終止酶促反應(yīng)，冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩２僮髑案髟噭┯昧恳磸?fù)核對，保證準(zhǔn)確無誤,所加試劑用量很少,必須認(rèn)真操作二、1．0%瓊脂糖凝膠板的制備用配套擋板將凝膠塑料托盤短邊缺口封住，置水平玻板或水平工作臺面上，將樣品槽模板（梳子）插進(jìn)托盤長邊上的凹槽內(nèi)(距一端約１．５cm）,梳齒底邊與托盤表面保持0。５-1圖5－1凝膠托盤的組裝1．托盤2。擋板3．梳子稱取0。3克瓊脂糖置于小錐形瓶中,加入3０待瓊脂糖冷卻至放在手背不覺太燙手（約60℃）后，滴一滴EB，然后將瓊脂糖溶液在靠近擋板一側(cè)連續(xù)地倒入托盤內(nèi)（注意中間不要間斷),使凝膠緩慢而連續(xù)地展開直至在托盤表面形成一層約３mm厚均勻膠層（７.1×９.0cm待凝固完全后，用小滴管在梳齒附近加入少量ＴBE稀釋液潤濕凝膠，雙手均勻用力輕輕拔出樣品槽模板(注意勿使樣品槽破裂），則在膠板上形成相互隔開的樣品槽.取下封邊的擋板,將凝膠連同托盤放入電泳槽平臺上,倒入大量ＴBＥ稀釋緩沖液直至浸沒過凝膠面２—3mm，要防止樣品槽內(nèi)窩存氣泡,可以用微量注射器挑除三、加樣用微量注射器或移液槍將經(jīng)酶切的樣品液和未經(jīng)酶切的樣品液（要加2μL的酶反應(yīng)終止液）分別加入到膠板的不同加樣槽內(nèi)，每個槽（5×2×2。5ｍm)容積約為25μL，因此加樣量不要超過２0μL，避免因樣品過多而溢出,污染鄰近樣品。加樣時(shí),注射器針頭穿過緩沖液小心靠近加樣槽底部，但不要損壞凝膠槽，然后緩慢地將樣品推進(jìn)槽內(nèi),讓其集中沉于槽底部。四、電泳加樣完畢，將靠近樣品槽一端連接負(fù)極,另一端連接正極(千萬不要搞錯），接通電源,開始電泳.在樣品進(jìn)膠前可用略高電壓,防止樣品擴(kuò)散，樣品進(jìn)膠后，應(yīng)控制電壓降不高于５V／cｍ。當(dāng)染料帶移動到距離凝膠前沿約１ｃm五、觀察小心地取出凝膠置托盤上，將膠板推至預(yù)先浸濕并鋪在紫外燈觀察臺上的玻璃紙內(nèi)，在波長２4５nm紫外燈下進(jìn)行觀察。DNA存在的位置呈現(xiàn)橘紅色熒光，可觀察到清晰的條帶.觀察時(shí)應(yīng)帶上防護(hù)眼鏡，避免紫外燈對眼睛的傷害。六、制作測定分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線用卡尺量出λＤNA—HｉｎdⅢ酶解各片段的遷移距離（ｃm)，以DNA酶解各片段分子量為縱坐標(biāo),它們的遷移距離為橫坐標(biāo)，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上連結(jié)各點(diǎn)劃出曲線，即為DＮA分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。λDNA—HindⅢ酶解各片段大小見表５-2。片段堿基對數(shù)目（kｂ)道爾頓（×１06）１2３45６7823．1309.4196.５574。3712。3222．028０。５640．12515.06．124．262。841.5１１。3２0．37０。0８表5—2λＤNA—ＨindⅢ酶解片段注意事項(xiàng)溴乙錠(EB）是誘變劑，配制和使用時(shí)應(yīng)帶乳膠手套,并且不要將該溶液灑在桌面或地面上。凡是沾污過EB的器皿或物品，必須經(jīng)過專門處理后，才能進(jìn)行清洗或棄去。DNA酶解過程中,使用的器具都應(yīng)干凈，并經(jīng)消毒。配制時(shí)急需用滅菌的雙蒸水，還要防止限制性內(nèi)切酶被污染.加樣量的多少取決于加樣槽最大容積?？梢圆捎么笮〔煌臉悠凡勰０逡孕纬扇莘e不同的加樣槽，加入樣品的體積應(yīng)略小于加樣槽容積,為此,對于較稀的樣品液應(yīng)設(shè)法調(diào)整其濃度或加以濃縮.λＤNA—HｉndⅢ酶解后應(yīng)有8條帶，但實(shí)際上只能看見6條，分子量小的2條帶由于其熒光弱，往往看不見.思考題1。名詞解釋：λDNA;限制性內(nèi)切酶;Marｋer2．根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，解釋瓊脂糖凝膠電泳測定DＮA片段大小的根據(jù)，聚丙烯酰胺凝膠電泳能否測定DNA分子的大小,它們的區(qū)別是什么？3.說明DNA限制性內(nèi)切酶圖譜的構(gòu)建在核酸研究和遺傳工程等方面的應(yīng)用價(jià)值.?實(shí)驗(yàn)6唾液淀粉酶的性質(zhì)和活力測定（8學(xué)時(shí))目的要求通過唾液淀粉酶性質(zhì)的測定,了解酶的專一性和多種因素對酶促反應(yīng)速度的影響，如:底物濃度、酶濃度、溫度、pＨ值、激活劑和抑制劑等。通過對唾液淀粉酶活力的測定,學(xué)習(xí)酶活力、蛋白質(zhì)含量的測定方法，及酶活力和比活力的計(jì)算方法。試劑和器材主要器材：可見光分光光度計(jì)、試管、漏斗、移液管、恒溫水浴鍋、ｐＨ試紙等.主要試劑:可溶性淀粉、葡萄糖、3,5—二硝基水楊酸、酚、NaＯＨ、ＨＣl、乙醇、醋酸、醋酸鈉、牛血清白蛋白溶液、考馬斯亮藍(lán)G—250等。要求涉及的實(shí)驗(yàn)操作：用考馬斯亮藍(lán)法制作蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。用3，5-二硝基水楊酸試劑法或Benedict試劑法制作葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。至少測定底物濃度、溫度、pH值、激活劑和抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響。時(shí)間內(nèi)容安排實(shí)驗(yàn)前六周，教師向?qū)W生介紹實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)材料，學(xué)生查閱文獻(xiàn)資料。實(shí)驗(yàn)前五周，學(xué)生提交具體實(shí)驗(yàn)方案和所需儀器、藥品清單，實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)相關(guān)實(shí)驗(yàn)藥品、設(shè)備的準(zhǔn)備工作。實(shí)驗(yàn)開出。提交一份實(shí)驗(yàn)報(bào)告，內(nèi)容包括：實(shí)驗(yàn)的目的、實(shí)驗(yàn)的原理、實(shí)驗(yàn)試劑和器材、操作方法、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析、討論和實(shí)驗(yàn)情況總結(jié)。參考書目(僅供參考,另外可以查閱期刊雜志)高級生化實(shí)驗(yàn)教程,王重慶等編生化實(shí)驗(yàn)方法和技巧,張龍翔等編生物化學(xué)實(shí)驗(yàn),中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)出版社實(shí)驗(yàn)7生物氧化與電子傳遞（３學(xué)時(shí))目的要求１。掌握電子在電子傳遞鏈中的傳遞過程；2。了解體外實(shí)驗(yàn)中研究電子傳遞鏈的方法。原理生物氧化過程中代謝物脫下的氫由ＮＡD+或FAD接受生成還原型NAＤＨ或ＦＡDH2，再經(jīng)一系列電子傳遞體傳遞,最后與氧結(jié)合生成水。這些存在于線粒體內(nèi)膜上的氧化還原酶及其輔酶依次排列，順序地起傳遞電子或電子和質(zhì)子的作用，稱為電子傳遞鏈或呼吸鏈。在體內(nèi)，代謝中間產(chǎn)物琥珀酸在線粒體琥珀酸脫氫酶（輔酶FAD)的作用下脫氫氧化生成延胡索酸,脫