開題報告學科專業(yè)中西醫(yī)結合腫瘤學中醫(yī)學七年制

南方紅豆杉水提物調(diào)控T790M突變和c-Met擴增逆轉(zhuǎn)人肺2011國家自然科學基金（項目編號 一、立論依（包括課題理由研究意義國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析和主要參考文獻：肺癌是世界上與致死率最高的之一，其中約有75%-85%為非小細胞肺癌(Nonsmallcelllungcancer,NSCLC)[1]。NSCLC差5年生存率低于20%[2]近年來以阿法替尼(afatinib)和厄洛替尼(erlotinib)為代表的表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑(epidermalgrowthfactorreceptortyrosinekinaseinhibitor，EGFR-TKI)EGFR可延長無進展生存期(progressionsurvival，PFS)[3，4]，而日益受到人然而，EGFR-TKI終將出現(xiàn)耐藥，中位PFS6-12個月[5]EGFR-TKI1、EGFRNSCLC的關表皮生長因子受體(Epidermalgrowthfactorreceptor，EGFＲ)是一種膜受體，在多種中都有過度表達，激活EGFＲ會加快腫瘤細胞繁殖，促進腫瘤血管生成，加速腫瘤轉(zhuǎn)移，阻礙腫瘤凋亡（10）EGFR廣泛分布于上皮細胞，是一種總相對分子質(zhì)量約為1.73部分組成。其胞內(nèi)結構包含1個酪氨酸激酶域(tyrosinekinase)和具有多個自身磷酸化位點的羧基末端尾,屬于受體酪氨酸激酶(receptortyrosinekinaseRTKs);2所構成,能結合具有激動功能的多種配體,主要有表皮生長因子(epidermalgrowthfactor,EGF)2α(transforminggrowthfactor2α,TGF2α)。EGFTGF2αEGFR1ATP分EGFR磷酸化。EGFRrasrafMAPK(mitogenactivatedproteinkinase)級聯(lián)系統(tǒng)和磷酸肌醇激酶(phosphoinositolkinase)系統(tǒng),成為下游信號轉(zhuǎn)導的親和位點,與多種參與有絲的信號轉(zhuǎn)導分子產(chǎn)生高親和。通過這些系統(tǒng)將有絲信號從細胞傳遞到細胞內(nèi),從而有效調(diào)節(jié)細胞對外界刺激的反應、細胞增生、存活、黏EGFR胞飲作用進入細胞,被降解或再循環(huán)到細胞表面,完成信號轉(zhuǎn)導2、EGFR抑制劑及療效指EGFR抑制劑通過與ATP競爭性結合胞外的配體結合位點,阻斷分子內(nèi)酪氨酸的自身磷酸化及酪氨酸激酶活化,抑制EGFR同源或與ERBB3異源二聚體的形成，抑制EGFR激活,從而抑制細胞周期進程、加速細胞凋亡、抑制血管生成、抑制浸潤和轉(zhuǎn)移[7～9]。時下最有前景的EGFR抑制劑主要有兩類:一是EGFR單克隆抗體(monoclonalantibody，MAb)，主要作用在EGFR的胞外區(qū)，競爭性抑制配體與EGFR結合， EGFR活化；二是特異性抑制EGFR激酶活性的小分子酪氨酸激酶抑制劑(tyrosinekinaseinhibitor，TKI)即表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermalgrowthfactorreceptortyrosineTKIs，（Erlotinib，是選擇性酪氨酸激酶抑制劑。研究表明EGFR EGFR-TKI療效的指標，EFGR的陽性表達不能替代EGFR突變的檢測來預測酪氨3、 突變與獲得性耐藥機EGFREGFRATPEGFR-TKIEGFR突變的肺癌有EGFR-TKI現(xiàn)已成為治療NSCLC的常規(guī) 因外顯子18、19和21的突變有關，外顯子20的突變多見于藥物治療后復發(fā) 這類藥物并不適用于所有NSCLC患者，大部分敏感突變的患者在經(jīng)過大約6-12個月的初始治療后都產(chǎn)生了獲得性耐藥，產(chǎn)生耐藥的機制很復雜[5]。研究發(fā)現(xiàn)EGFR-TKI獲得性耐藥主要包括以下幾點：二次突變、c-Met 突變、AXL激酶的激活、上皮細胞間充質(zhì)化（EMT）與組織學轉(zhuǎn)化、IGF-1R表達等[17]4、吉非替尼獲得性耐藥分子機吉非替尼(gefitinib)是EGFR-TKIs類靶向藥物，可使EGFR突變陽性患者的示其獲得性耐藥主要與以下幾個途徑有關:（1)二次突變學說:該學說主要觀 exon-20在吉非替尼治療過程中出現(xiàn)二次突變，導致EGFR790位點上的蘇氨酸被甲硫氨酸取代，該位點上引入了一條更大的氨基酸側鏈構成空間位阻，將導致吉非替尼無法與酪氨酸激酶相結合，但ATP與酪氨酸激［12似的研究，他們發(fā)現(xiàn)在10個吉非替尼繼發(fā)耐藥的患者中有7個檢測出T790M突變。從另一個側面反映了EGFR 和作用。(2)旁路激活途徑：目前還有一些研究發(fā)現(xiàn)， Engelman等[11]在18例已被 替尼誘導耐藥的肺癌細胞株中檢測出4例 擴增，結果顯示Met 擴增可誘導HER3（ErbB3）磷酸化，使PI3K/Akt通路持續(xù)活化，從而導致 替尼繼發(fā)耐藥的發(fā)生。目前，Met基因擴增與繼發(fā)耐藥的關系是研究熱點之一，但Met 擴增影響PI3K/Akt通 點尚待進一步明確。值得注意的是MET并非 替尼繼發(fā)耐藥中起到了一定作用。(3)其他機制:受體酪氨酸激酶和整合素可通過不同的途徑活化Akt，而PI3K/Akt途徑在抗凋亡信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮重要作盡管以上耐藥機制眾說紛紜，但60%～70%的EGFR-TKIs繼發(fā)耐藥與二次突變學說和Met 擴增這2種機制有關[14].5、靶向治療“瓶EGFR突變種類和EGFR-TKI,T790M及MET擴增引起EGFR-TKI不可避免的獲得性耐藥極大地影響了EGFR-TKI的臨床療效。文獻報導[18]EGFR－TKINSCLC20%左右。這使得逆轉(zhuǎn)EGFR-TKI耐藥及尋找新的多靶點、安全有效的靶向藥物成6、南方紅的天然珍稀抗癌植40IIISMMC-7721Hep-2[9]12B[0]。87、南方紅豆杉水提物與紫杉提取工藝要求高且需采取浸??；③浙江省中藥孔繁智研究員對SD660180靶向治療藥物已廣泛應用于臨床，但EGFR-TKI治療的中位有效時間僅為5～9現(xiàn)。多年臨床實踐中，我們曾遇到數(shù)例服用替尼并聯(lián)合南方紅豆杉水提物為主的患者，有效治療迄今已達三年多，這使到南方紅豆杉水提物是否存在逆轉(zhuǎn)替尼耐藥的可能。于省自然基金資助下的前期實驗結果顯示：(1)Western-blottingA549EGFR)南方紅豆杉水提物與臨床廣泛應用的紫杉醇作用機理顯著A549G1期阻滯，SG2、M（3）A549（4顯微鏡及電鏡下觀察到南方紅豆A549（5）流式檢測表明經(jīng)藥物處理后的細胞早期凋亡的比例明顯升高，呈一定的劑量－效應關系。(9)我們的A549EGFREGFREGFR-TKI18-2120T790Mc-Met擴增的結果。[1]VarugheseS，JahangirKS，SimpsonCE，etal.Aparadigmshiftinthetreatmentofadvancednon-smallcelllungcancer[J].AmJMedSci，2012，344(2)：147-150.JMGubishCTRothsteinMEetkinaseinhibitorvandetanibwiththeantiestrogenfulvestrantenhancesitsantitumoreffectinnon-smallcelllungcancer[J].JThoracOncol，2012，7(3)：485-495.[3]MAEMONDOM,INOUEA,KOBAYASHIK,etal.Gefitiniborchemotherapyfornon-small-celllungcancerwithmutatedEGFR［J］.NEnglJMed,2010,362(25):[4]ZHOUC,WUYL,CHENG,etal.Erlotinibversuschemotherapyasfirst-linetreatmentforpatientswithadvancedEGFRmutation-positivenon-small-celllungcancer(OPTIMAL,CTONG-0802):amulticentre,open-label,randomised,phase3study［J］.LancetOncol,2011,12(8):735-742.[5]RosellR,MoranT,QueraltC,etal.Screeningforepidermalgrowthfactormutationsinlungcancer[J].NEnglJMed，2009，361(10)：958-[7] 制劑J]癌雜志,2002,5(4)∶310-312.[8] LiS,McMahonG.Inhibitionoftumorangiogenesisbysyntheticreceptortyrosinekinaseinhibitors[J].DDT,2000,5(8)∶344-353.[9] MaartenlL,Jannmaat,GiuseppeG,etal.Small-moleculeepidermalgrowthfactorreceptortyrosinekinaseinhibitors[J].Oncologist,2003,8(18)∶576-586.ENGELMANJA,ZEJNULLAHUK,MITSUDOMIT,etal.METleadstogefitinib inlungcancerbyactivatingERBB3signaling[J].Science,2007,316(5827):1039-1043.XUY,LIUH,CHENJ,etal.Acquired oflungadenocarcinomatoEGFR-tyrosinekinasegefitinibanderlotinib[J].CancerBiolTher,2010,9(8):572-ONITSUKAT,URAMOTOH,NOSEN,etal.Acquired togefitinib:thecontributionofmechanismsotherthantheT790M,MET,andHGFstatus[J].LungCancer,2010,68(2):198-ROSELLR,TARONM,SANCHEZJJ,etal.Settingtheben 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RT-PCR、DNA等方法進一步明確TKIT790M圍繞兩種重要的耐藥機制，明確紅豆杉水提物逆轉(zhuǎn)替尼獲得性耐藥的機理，以期為臨床篩選出多途徑、多靶點的、安全、毒副作用少的EGFR-TKI耐藥（二）T790M培養(yǎng)人肺細胞H1975、A549、PC9PC9/R，將好的家兔含藥分別作用于上述細胞，24CCK8RT-PCRDNA、Western-blottingT790M明確南方紅豆杉水提物對c-Met擴增細胞株的干預作用取c-Met （H1993 替尼藥物敏感性變化，檢測c- HGF/c-Met信號通路以及P-gp、MRP、LRP等含 HGF/c-MetP-gp、MRP、（三）明確T790M突變 替尼用藥的先后關探討紅豆杉水提物對20外顯子T790M突變及c-Met 三．擬采取的研究方法、技術路線、實驗方案及可行性分（一）南方紅豆杉水提物 ，步驟如下：將40g飲片置于醫(yī)再加5倍水煮沸20min，將3次藥液經(jīng)真空抽濾器過濾，置于電磁爐上濃縮至終濃度為112mg（生藥量）/ml，靜置過夜后用濾網(wǎng)過濾藥渣，置于4℃保存?zhèn)溆谩?250mg溶于50ul的DMSO中，余液用純水補足，配制成5mg/ml的混懸液，4℃保人肺c-Met擴增細胞株（H1993、H1975、A549、PC9PC9/RH1975EGFR20T790M，PC9非替尼高度敏感的肺細胞株。PC9EGFR19（delE746-A750）使EGFR-ATP結合囊（ATP-bindingpoket，ABP）的角度改變，故其對替尼敏感。PC9/R為替尼獲得性耐藥細胞株。含藥的726（替尼組，南方紅豆杉高、中、低劑量組及南方紅豆杉聯(lián)合替尼組。根據(jù)“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”得各組灌胃劑量，替尼組15.4mg/kg/d，南方紅豆杉高、中、低劑量組（1.12g/kg/d0.56g/kg/d0.28g/kg/d）及替尼（15.4mg/kg/d）聯(lián)合南方紅豆杉（0.56g/kg/d）組。每組按其劑量連續(xù)灌胃7天。末次灌胃后1小時后，清醒狀態(tài)下無菌心臟采血，分離，過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆?。T790M用不同濃度的南方紅豆杉水提物、替尼和各組含藥分別作用于H1975、A549、PC9、PC9/R細胞。24h后Elx808450nm波長處測量各孔的吸光值（OD值=（對照組吸光度值–實驗組替尼含藥②RT-PCREGFR用不同濃度藥物及各組含藥處理上述細胞株，24h后，從各細胞株和各組瘤塊組織中，分別提取總RNAGAPDH為內(nèi)參，應用real-timePCR測定mRNA水平上EGFR表達量。③DNAEGFR20T790M用不同濃度藥物及各組含藥處理上述細胞株，24h后，從各細胞株和各DNAPrimer5EGFR外18-21DNA儀進序，檢測對比T790M突變。④Western-blottingEGFR 作用于呈對數(shù)生長的上述細胞株，24h后，從各組細胞MRP、LRP等蛋白的表達。以SPSS統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布的各項資料均以均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗、方差分析進行各組間的比較；計數(shù)資料根據(jù)數(shù)據(jù)類型的不同分別進行采用χ2南方紅豆杉水提物干預c-Met擴增細胞株的實驗用不同濃度的南方紅豆杉水提物、替尼和各組含藥分別作