分子生物學(xué)chapter4DNA復(fù)制課件

Chapter4TheReplicationofDNA

Chapter8ofthebookIntroductionWhenwilltheDNAreplicationhappen?

（4）細(xì)菌(E.coli)DNA每個(gè)細(xì)胞周期只復(fù)制一次1、Semi-ConservativeReplication

1958Meselson-stahl設(shè)計(jì)的CsCl超離心試驗(yàn)證實(shí)了

DNA復(fù)制的這一特性概念：復(fù)制過程中各以雙螺旋DNA的其中一條鏈為模

板合成其互補(bǔ)鏈，新生的互補(bǔ)鏈與母鏈構(gòu)成子

代DNA分子

聚合反應(yīng)：substrate－－dNTPPoly(核苷酸)n－3’-OH＋dNTP→

Poly(核苷酸)n+1－3’-OH＋

2PiThedirectionofreplication子鏈DNA延伸方向只能是5’－3’5’OHTCATCAC5’OH3’ppp

OH

C++

ppi

如果DNA的延伸方向是3’→5’

ATCG

+5’pppOH3’GpppOHGATCG5’pppOH3’ATCG

+5’pppOH3’GpppOH

G

5’

pppa、因能量的需要，

DNA的5’端必須帶有PPP游離dNTP具有ppppppOH3’ATCG

在0.2MNacl的生理環(huán)境中，使dNTP難以聚合到DNA的5’端

需要其他機(jī)制以解脫

1)、解螺旋酶（helicase）:又稱解旋酶,通過水解ATP獲得能量,解開DNA雙鏈.

2).

單鏈結(jié)合蛋白（SSB):結(jié)合在DNA單鏈上,有時(shí)有協(xié)同效應(yīng).3)、

DNA旋轉(zhuǎn)酶：消除復(fù)制叉前進(jìn)過程中產(chǎn)生的正超螺旋，產(chǎn)生負(fù)超螺旋.TheinitiationofDNAreplication（1）OriCinE.colichromosomalDNA?四個(gè)9bp的重復(fù)序列

dnaA結(jié)合位點(diǎn)?三個(gè)13bp的重復(fù)序列若干GATC位點(diǎn)Replicationfork

真核生物（Eukaryote）:多復(fù)制起點(diǎn)即－－一個(gè)genome中有多個(gè)復(fù)制單位TheinitiationofDNAreplicationDnaAistheinitiator

引發(fā)體（包括引發(fā)酶）pppRNA引物DNApolymeraseIIIpppDNApolymeraseIDNApolymeraseIDNAligase

DNALigase

所需條件：

a、

切刻的3’－OH和5’－P相鄰

b、

切刻各自堿基處于配對(duì)狀態(tài)

c、需要能量原核（ATP、NAD）真核（ATP）

用途：復(fù)制過程中，5’端RNA引物被置換后切刻的連接修復(fù)、重組3’－5’exonucleaseactivity（polymeraseI,II,III）

校對(duì)功能(proofreading)

5’－3’

exonucleaseactivity(polymeraseI,III)

DNApolⅠ的5’－3’外切活性有以下三個(gè)特點(diǎn)：

?必須有5’－磷酸末端?被除去的核苷酸必須是已經(jīng)配對(duì)的?被除去的可以是脫氧核糖核苷酸，也可以是核糖核苷酸（切刻平移）

其中DNApolⅢ

全酶有十種共22個(gè)亞基β二聚體－－滑動(dòng)鉗InteractionbetweenDNAandDNApolymeraseTheinitiationofDNAsynthesisinE.coli

2、真核生物的DNA聚合酶

α、β、δ、ε、γ五種

位置核內(nèi)核內(nèi)核內(nèi)核內(nèi)

線粒體

合成

與引發(fā)修復(fù)合成合成,修復(fù)復(fù)制功能酶結(jié)合前導(dǎo)鏈

后隨鏈3’－5’校NONOYesYesYes正活性

α

β

δ

ε

γActivationofthepre-RCleadstotheassemblyoftheeukaryoticreplicationforkTheactivationofpre-RCsistightlyregulatedbycyclin-dependentkinases(Cdks)

（3）復(fù)制終止a、終止序列

E.coli有兩個(gè)終止區(qū)域，分別結(jié)合專一性的終止蛋白

序列一：terEterDterA

序列二：terFterBterC

每個(gè)區(qū)域只對(duì)一個(gè)方向的復(fù)制叉起作用

b、專一性終止蛋白

E.coli中由tusgene編碼（terminusutilizationsubstance）通過抑制DNA螺旋酶而發(fā)揮終止作用每次復(fù)制時(shí)只使用一個(gè)終止位點(diǎn)ter5、復(fù)制忠實(shí)性的保證

1、DNApol的3’5’外切酶活性

(exonucleaseactivity)

2、DNApol只能從引物的3’

端延伸DNA

（需要RNA引物）

a、堿基配對(duì)協(xié)同性導(dǎo)致最初幾個(gè)堿基錯(cuò)配率高，且不易校正

b、RNA引物最終被降解而避免錯(cuò)誤

3、后隨鏈的不連續(xù)合成因其有利于錯(cuò)配堿基的校正

3.6.真核生物DNA的復(fù)制(DNAreplicationinEukaryote)

3.真核生物DNA復(fù)制的引發(fā)酶

●DNApolα+primase形成緊密的復(fù)合物

6-9NtRNAasprimer

●引發(fā)酶（primase）：50-60kd

●作用方式為陣發(fā)性的，每次作用拷貝6～15個(gè)核苷酸

●既能利用NTP，又能利用dNTP

●SV40體外DNA復(fù)制情況分析

端粒位于真核生物染色體DNA的3’末端，由獨(dú)特的DNA重復(fù)序列及相關(guān)蛋白組成的復(fù)合體。端粒的功能：①維持染色體的完整性，決定細(xì)胞的壽命。若無端粒，兩個(gè)染色體末端很可能融合一起。②解決末端復(fù)制問題，端粒酶能與端粒作用，延伸其長(zhǎng)度。端粒的結(jié)構(gòu)①DNA端粒由簡(jiǎn)單的串聯(lián)重復(fù)序列組成人和其他脊椎動(dòng)物：AGGGTT纖毛原生動(dòng)物四膜蟲：GGGGTT和GGGGTTTT面包酵母：G1－3T和G1－5A共同特點(diǎn)：富含G；長(zhǎng)度達(dá)幾百到幾kb；人類DNA端粒長(zhǎng)幾kb到幾十kb。端粒酶(Telomerase)是催化端粒合成的酶。它是由一條RNA和多種蛋白質(zhì)構(gòu)成的核糖核蛋白復(fù)合體。端粒酶中的蛋白部份具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，能以其自身攜帶的RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒DNA。端粒酶的作用機(jī)制：端粒酶的RNA分子與端粒DNA配對(duì)，以RNA為模板進(jìn)行類似逆轉(zhuǎn)錄合成DNA，向5’→3’延伸端粒至模板RNA末端后，延長(zhǎng)的DNA末端與RNA模板解離，端粒酶移動(dòng)，重新定位于延長(zhǎng)后的DNA3’端，開始下一輪延長(zhǎng)過程，如此反復(fù)可達(dá)數(shù)百次合成幾百個(gè)或數(shù)千個(gè)重復(fù)序列。（3）補(bǔ)齊過程

通過TG鏈的回折形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（G·G氫鍵）－－－尺蠖模型

→→實(shí)現(xiàn)端粒酶位置的調(diào)整大多數(shù)體細(xì)胞不合成端粒酶，每次分裂后端粒就變短（約30～200bp）。當(dāng)端粒比正常的長(zhǎng)度短數(shù)kb時(shí)細(xì)胞就不再分裂。所以端粒變短是一種老化的象征。實(shí)驗(yàn)證明將端粒酶加進(jìn)體細(xì)胞，可以增加體細(xì)胞分裂次數(shù)。癌細(xì)胞主要特性是能無限期的分裂增生，這需要不斷表達(dá)端粒酶。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞的端粒酶活性很強(qiáng)。這點(diǎn)可被用來檢驗(yàn)癌細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)表明－－人體細(xì)胞通過監(jiān)測(cè)失去的端粒的重復(fù)數(shù)而計(jì)數(shù)細(xì)胞分裂次數(shù)，當(dāng)端粒長(zhǎng)度下降到某一臨界值時(shí)，細(xì)胞終止分裂－－－衰老、死亡“多莉”的衰老

研究端粒丟失的速率，預(yù)測(cè)人類的壽命

＞XXXYwhy?研究推測(cè)端粒酶與腫瘤的關(guān)系ColE1質(zhì)粒DNA的復(fù)制是從一個(gè)特定的復(fù)制起點(diǎn)（ori）開始，并沿著環(huán)DNA分子單向性地進(jìn)行?？刂拼朔N質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動(dòng)的兩種關(guān)鍵因素RNAI和RNAⅡ兩種RNA分子，都是由ColE1DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的。其中RNAⅡ也叫做復(fù)制引物。RNAⅡ分子在轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)附近同互補(bǔ)的模板DNA形成一種雜交分子，被RnaseH酶所切割，從而釋放出3′-OH末端，作為供DNA聚合酶Ⅰ合成DNA的引物。RNAⅠ可以通過同RNAⅡ結(jié)合，以阻止其與模板DNA發(fā)生雜交作用。原核細(xì)胞DNA復(fù)制的調(diào)控

真核生物的復(fù)制起始受許可因子的控制a、復(fù)制子的大小（Sizesofreplicon）:Yeastorfly 平均40kbMam