抗體酶核酶極端

抗體酶核酶極端第1頁(yè)/共75頁(yè)第十章模擬酶核酶極端酶

第2頁(yè)/共75頁(yè)10.1模擬酶11.1.1模擬酶的概念模擬酶又稱人工酶或酶模型，是在分子水平上模擬酶活性部位的形狀、大小及其微環(huán)境等結(jié)構(gòu)特征，以及酶的作用機(jī)制和立體化學(xué)的一門學(xué)科，是從分子水平上模擬生物功能的一門邊緣學(xué)科。模擬酶是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來(lái)的一個(gè)新的研究領(lǐng)域，是仿生高分子的一個(gè)重要的內(nèi)容。

第3頁(yè)/共75頁(yè)用合成高分子來(lái)模擬酶的結(jié)構(gòu)、特性、作用原理以及酶在生物體內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)過(guò)程。酶是一類有催化活性的蛋白質(zhì)，它具有催化效率高、專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)。酶容易受到多種物理、化學(xué)因素的影響而失活，所以不能用酶廣泛取代工業(yè)催化劑。研究模擬酶主要是為了解決酶的以上缺點(diǎn)。

第4頁(yè)/共75頁(yè)模擬酶的酶學(xué)基礎(chǔ)酶的作用機(jī)制：過(guò)渡態(tài)理論對(duì)簡(jiǎn)化的人工體系中識(shí)別、結(jié)合和催化的研究2.模擬酶理論基礎(chǔ)第5頁(yè)/共75頁(yè)超分子化學(xué)主-客體化學(xué)：主體和客體在結(jié)合部位的空間及電子排列的互補(bǔ)超分子：該分子形成源于底物和受體的結(jié)合，這種結(jié)合基于非共價(jià)鍵相互作用，當(dāng)接受體與絡(luò)合離子或分子結(jié)合形成穩(wěn)定的，具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的實(shí)體，形成超分子功能：分子識(shí)別、催化、選擇性輸出第6頁(yè)/共75頁(yè)3．設(shè)計(jì)要點(diǎn)設(shè)計(jì)前：酶活性中心-底物復(fù)合物的結(jié)構(gòu)酶的專一性及其同底物結(jié)合方式的能力反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)及各中間物的知識(shí)第7頁(yè)/共75頁(yè)3．設(shè)計(jì)要點(diǎn)設(shè)計(jì)中：為底物提供良好的微環(huán)境催化基團(tuán)必須相對(duì)于結(jié)合點(diǎn)盡可能同底物的功能團(tuán)相接近應(yīng)具有足夠的水溶性，并在接近生理?xiàng)l件下保持其催化活性第8頁(yè)/共75頁(yè)4.模擬酶的分類和制備根據(jù)Kirby分類法單純酶模型：化學(xué)方法通過(guò)天然酶活性的模擬來(lái)重建和改造酶活性機(jī)理酶模型：通過(guò)對(duì)酶作用機(jī)制諸如識(shí)別、結(jié)合和過(guò)渡態(tài)穩(wěn)定化的認(rèn)識(shí)，來(lái)指導(dǎo)酶模型的設(shè)計(jì)和合成單純合成的酶樣化合物：化學(xué)合成的具有酶樣催化活性的簡(jiǎn)單分子第9頁(yè)/共75頁(yè)按照模擬酶的屬性主-客體酶模型膠束酶模型肽酶抗體酶分子印跡酶模型半合成酶第10頁(yè)/共75頁(yè)主-客體模型1.環(huán)糊精模擬酶----水解酶的模擬環(huán)糊精的分子結(jié)構(gòu)第11頁(yè)/共75頁(yè)第12頁(yè)/共75頁(yè)水解酶模型第13頁(yè)/共75頁(yè)研究熱點(diǎn)環(huán)糊精（CD）分子原來(lái)：在CD的兩面引入催化基團(tuán)，通過(guò)柔性或剛性加冕引入疏水基團(tuán)，改善CD的疏水結(jié)合和催化功能現(xiàn)在，橋聯(lián)環(huán)糊精和聚合環(huán)糊精，可得到雙重或多重疏水結(jié)合作用和多重識(shí)別作用第14頁(yè)/共75頁(yè)2.冠醚化合物的模擬酶冠醚水解酶模擬物第15頁(yè)/共75頁(yè)膠束模擬酶單分子膠束酶模型第16頁(yè)/共75頁(yè)膠束酶模型第17頁(yè)/共75頁(yè)目前模擬酶的研究主要有以下幾方面：1.模擬酶的金屬輔基:有一類復(fù)合酶,除蛋白質(zhì)外,還有含金屬的有機(jī)小分子物質(zhì)或簡(jiǎn)單的金屬，叫做輔酶或輔基。輔基在催化反應(yīng)中起著重要的作用。有一些研究工作就是模擬酶分子中的金屬輔基。例如，模擬過(guò)氧化氫酶分子中的鐵卟啉輔基，合成了分解過(guò)氧化氫的酶模型──三亞乙基四胺與三價(jià)鐵離子的絡(luò)合物。這個(gè)模型在pH9.5和25℃的條件下，其催化速率是血紅蛋白或正鐵血紅素在同樣條件下的一萬(wàn)倍?；瘜W(xué)模擬生物固氮同樣是模擬固氮酶的金屬輔基。

第18頁(yè)/共75頁(yè)2.模擬酶的活性功能基酶分子中直接與酶催化反應(yīng)有關(guān)的活性中心，通常是由幾個(gè)活性功能基組成。例如牛胰核糖核酸酶的催化中心是肽鏈序列中第12位和第119位的兩個(gè)組氨酸。

C.G.奧弗貝格等根據(jù)胰凝乳蛋白酶的催化中心與絲氨酸的羥基、組氨酸的咪唑基和天冬氨酸的羧基有關(guān)的事實(shí)，用乙烯基苯酚與乙烯基咪唑進(jìn)行共聚合，制得帶有羥基和咪唑基的-胰凝乳蛋白酶模型,用這個(gè)模型聚合物作為3-乙酰氧基－N－三甲基碘化苯胺,水解的催化劑，當(dāng)pH為9.1時(shí),其活性比單一的乙烯基咪唑高63倍。第19頁(yè)/共75頁(yè)3.模擬酶與底物的作用酶分子具有一定的空間構(gòu)型，它與被催化的底物的作用在構(gòu)型上有較嚴(yán)格的匹配關(guān)系，體現(xiàn)了酶的專一性。為了模擬酶的結(jié)合功能，近年來(lái)人們合成了許多冠醚化合物來(lái)模擬酶。隨著冠醚空穴尺寸的不同，其對(duì)底物的選擇性也不一樣。第20頁(yè)/共75頁(yè)4.模擬酶的性狀在水溶液中，酶形成巨大的分子締合體（膠束），構(gòu)成同一分子內(nèi)的疏水和親水微環(huán)境。模擬酶的這種微環(huán)境中的化學(xué)反應(yīng)的特殊性質(zhì)，也是模擬酶的一個(gè)重要方面。有人利用組氨酸的衍生物十四酰組氨酸與十六酰烷基－三甲基溴化銨組成兩種分子的混合微膠束，來(lái)催化乙酸對(duì)硝基苯酯的水解，其速率比組氨酸增加了100倍。第21頁(yè)/共75頁(yè)5.模擬酶的高分子作用方式酶是一類由氨基酸組成，以多肽鏈為骨架的生物大分子。人們利用高分子化合物作為模型化合物的骨架，引入活性功能基來(lái)模擬酶的高分子作用方式。例如，用分子量為40000～60000的聚亞乙基亞胺作為模型化合物的骨架，引入10％摩爾的十二烷基和15％摩爾的咪唑基，合成一個(gè)硫酸酯酶模型.用這個(gè)模型聚合物催化苯酚硫酸酯類化合物的水解，其活性比天然的Ⅱ型芳基硫酸酯酶高100倍。第22頁(yè)/共75頁(yè)10.1.2抗體酶（Abzyme)第23頁(yè)/共75頁(yè)內(nèi)容抗體酶概念抗體酶產(chǎn)生的理論基礎(chǔ)抗體酶的制備方法抗體酶的應(yīng)用第24頁(yè)/共75頁(yè)抗體由抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的，在結(jié)構(gòu)上與抗原高度互補(bǔ)并與抗原具有特異結(jié)合功能的免疫球蛋白?？贵w的最顯著的特征是多樣性和專一性第25頁(yè)/共75頁(yè)第26頁(yè)/共75頁(yè)抗體中的每條鏈中有恒定區(qū)和可變區(qū)。

第27頁(yè)/共75頁(yè)第28頁(yè)/共75頁(yè)相同點(diǎn)：都是蛋白質(zhì)，都有特異性。不同點(diǎn)：1）酶與抗體的差別：酶是能與反應(yīng)過(guò)渡態(tài)選擇結(jié)合的催化性物質(zhì)，抗體是和基態(tài)分子結(jié)合的催化性物質(zhì)。2）酶的活性和合成受到代謝調(diào)節(jié)，種類有限?？贵w只有在抗原存在時(shí)才產(chǎn)生，種類無(wú)限?？贵w與酶的異同：第29頁(yè)/共75頁(yè)酶是生物催化劑酶是一類具有催化功能的生物分子酶反應(yīng)有兩個(gè)主要的特征：高催化效率、高選擇性1946年，Pauling用過(guò)渡態(tài)理論闡明酶催化的實(shí)質(zhì)酶之所以具有催化活力是因?yàn)樗芴禺愋越Y(jié)合并穩(wěn)定化學(xué)反應(yīng)的過(guò)渡態(tài)(底物激態(tài))，從而降低反應(yīng)能級(jí)。第30頁(yè)/共75頁(yè)對(duì)任何化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)物在變?yōu)楫a(chǎn)物之前，必須獲得一定的能量，成為活化態(tài)或稱過(guò)渡態(tài)。過(guò)渡態(tài)處于最高能階上。過(guò)渡態(tài)與反應(yīng)物的能階之差稱為活化能。獲得活化能的多少與反應(yīng)的速度成正比。

過(guò)渡態(tài)理論是解釋酶催化原理的經(jīng)典理論。過(guò)渡態(tài)理論第31頁(yè)/共75頁(yè)過(guò)渡態(tài)理論認(rèn)為，酶與底物的結(jié)合經(jīng)歷了一個(gè)易于形成產(chǎn)物的過(guò)渡態(tài)，實(shí)際上是降低了反應(yīng)所需的活化能。過(guò)渡態(tài)理論第32頁(yè)/共75頁(yè)與反應(yīng)過(guò)渡狀態(tài)結(jié)合作用在酶催化的反應(yīng)中，與酶的活性中心形成復(fù)合物的實(shí)際上是底物形成的過(guò)渡狀態(tài)，酶與過(guò)渡狀態(tài)的親和力要大于酶與底物或產(chǎn)物的親和力。第33頁(yè)/共75頁(yè)1969年Jencks根據(jù)抗體結(jié)合抗原的高度特異性，與天然酶結(jié)合底物的高度專一性相類似的特性，在過(guò)渡態(tài)理論的基礎(chǔ)上首先提出設(shè)想：能與化學(xué)反應(yīng)中過(guò)渡態(tài)結(jié)合的抗體，可能具有酶的活性，催化反應(yīng)的進(jìn)行。1986年Lerner和Schultz證實(shí)了這一設(shè)想。抗體酶設(shè)想第34頁(yè)/共75頁(yè)抗體酶的發(fā)現(xiàn)Lerner和Schultz分別領(lǐng)導(dǎo)各自的研究小組首次觀察到了抗體具有選擇性的催化活性。1986年美國(guó)Lerner和Schultz兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)在Science上發(fā)表論文，報(bào)道他們成功地得到了具有催化活性的抗體。并將這類具催化能力的免疫球蛋白稱為催化抗體，即抗體酶。第35頁(yè)/共75頁(yè)1986年Schultz以對(duì)硝基苯酚磷酸膽堿酯（PNPPC）作為相應(yīng)的羧酸二酯的過(guò)渡態(tài)類似物。誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體酶使水解反應(yīng)速度加快12000倍。第36頁(yè)/共75頁(yè)抗體酶抗體酶（Abzyme）或催化抗體（Catalyticantibody)是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物。本質(zhì)上是一類具有催化活力的免疫球蛋白，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性。它是利用現(xiàn)代生物學(xué)與化學(xué)的理論與技術(shù)交叉研究的成果，是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物。第37頁(yè)/共75頁(yè)抗體酶具有典型的酶反應(yīng)特性與配體(底物)結(jié)合的專一性，包括立體專一性，抗體酶催化反應(yīng)的專一性可以達(dá)到甚至超過(guò)天然酶的專一性；具有高效催化性，一般抗體酶催化反應(yīng)速度比非催化反應(yīng)快102～106倍，有的反應(yīng)速度已接近于天然酶促反應(yīng)速度；抗體酶還具有與天然酶相近的米氏方程動(dòng)力學(xué)及pH依賴性等。第38頁(yè)/共75頁(yè)過(guò)渡態(tài)理論與抗體酶如果使抗原最大限度地接近某一特定反應(yīng)的過(guò)渡態(tài)，就可能使誘導(dǎo)的抗體在與之結(jié)合時(shí)發(fā)揮催化作用。實(shí)際所采用的過(guò)渡態(tài)抗原知識(shí)推測(cè)而設(shè)計(jì)的過(guò)渡態(tài)類似物。用過(guò)渡態(tài)類似物誘導(dǎo)的抗體所催化的反應(yīng)并非該類似物本身，而是與其相似的另一種反應(yīng)。第39頁(yè)/共75頁(yè)抗體酶的特性1、能催化一些天然酶不能催化的反應(yīng)有許多化學(xué)反應(yīng)還沒(méi)有已知酶催化進(jìn)行抗體的多樣性決定了抗體酶催化反應(yīng)類型多樣性抗體酶可以根據(jù)需要人工裁制一種對(duì)酶促反應(yīng)過(guò)渡態(tài)特異的抗體結(jié)合了酶與抗體的優(yōu)點(diǎn)，既可以起酶促催化作用，又可以起抗體的選擇性和專一性結(jié)合抗原的作用。第40頁(yè)/共75頁(yè)抗體酶的催化反應(yīng)類型1、轉(zhuǎn)?；磻?yīng)2、水解反應(yīng)3、Claisen重排反應(yīng)4、酰胺合成反應(yīng)5Diels-Alder反應(yīng)6、轉(zhuǎn)酯反應(yīng)7、光誘導(dǎo)反應(yīng)8、氧化還原反應(yīng)9、脫羧反應(yīng)10、順?lè)串悩?gòu)化反應(yīng)第41頁(yè)/共75頁(yè)抗體酶的特性2、有更強(qiáng)的專一性和穩(wěn)定性抗體的精細(xì)識(shí)別使其能結(jié)合幾乎任何天然的或合成的分子抗體酶催化反應(yīng)的介質(zhì)效應(yīng)酯解反應(yīng)中介質(zhì)效應(yīng)：抗體酶在有機(jī)溶劑中具穩(wěn)定性。脫羧反應(yīng)中介質(zhì)效應(yīng)：有機(jī)溶劑引起脫羧反應(yīng)速率增加。?；D(zhuǎn)移反應(yīng)中介質(zhì)效應(yīng)：在疏水溶劑中，活性較高。第42頁(yè)/共75頁(yè)抗體酶的制備將抗體轉(zhuǎn)變?yōu)槊缚赏ㄟ^(guò)誘導(dǎo)法、拷貝法、引入法、化學(xué)修飾法等途徑。誘導(dǎo)法是利用反應(yīng)過(guò)渡態(tài)類似物為半抗原制作單克隆抗體，篩選出具高催化活性的單抗即抗體酶?？截惙ㄖ饕鶕?jù)抗體生成過(guò)程中抗原-抗體互補(bǔ)性來(lái)設(shè)計(jì)的。引入法則借助基因工程和蛋白質(zhì)工程將催化基因引入到特異抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)上，使其獲得催化功能?；瘜W(xué)修飾法對(duì)抗體進(jìn)行化學(xué)修飾，使抗體與催化基團(tuán)相連。第43頁(yè)/共75頁(yè)1.誘導(dǎo)法用設(shè)計(jì)好的半抗原，通過(guò)與載體蛋白（如牛血清白蛋白）偶聯(lián)制成抗原。然后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫，取免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞雜交，雜交細(xì)胞則分泌單克隆抗體，經(jīng)篩選和純化，得抗體酶。

第44頁(yè)/共75頁(yè)第45頁(yè)/共75頁(yè)用酶作為抗原免疫動(dòng)物得到抗酶的抗體，再將此抗體免疫動(dòng)物并進(jìn)行單克隆化，獲得單克隆的抗抗體。對(duì)抗抗體進(jìn)行篩選，獲得具有原來(lái)酶活性的抗體酶。2.拷貝法第46頁(yè)/共75頁(yè)第47頁(yè)/共75頁(yè)3.引入法將催化基團(tuán)或輔助因子引入到抗體的抗原結(jié)合部位，可采用選擇性化學(xué)修飾方法，亦可利用蛋白質(zhì)工程和基因工程技術(shù)第48頁(yè)/共75頁(yè)四、抗體酶的應(yīng)用

1.戒毒:

用可卡因水解的過(guò)渡態(tài)類似物-磷酸單酯為半抗原，產(chǎn)生的單克隆抗體能催化可卡因的分解，水解后的可卡因片斷失去可卡因刺激功能。第49頁(yè)/共75頁(yè)2.

腫瘤治療

抗體介導(dǎo)前藥治療技術(shù):將能水解前藥釋放出腫瘤細(xì)胞毒劑的酶和腫瘤專一性抗體相偶聯(lián)，則酶通過(guò)和腫瘤結(jié)合的抗體存在于細(xì)胞的表面。靜脈給藥后，當(dāng)藥物擴(kuò)散至腫瘤細(xì)胞的表面或附近，抗體酶將前藥迅速水解釋放出抗腫瘤藥物。第50頁(yè)/共75頁(yè)第二節(jié)核酶（Ribozyme)一、核酶的概念二、核酶的種類三、核酶的應(yīng)用四、核酶面臨的問(wèn)題五、影響核酶活性的因素第51頁(yè)/共75頁(yè)

具有生物催化功能的RNA。一、核酶的概念生物催化劑（Biocatalyst）蛋白質(zhì)類：天然酶

enzyme

極端酶extremozyme

抗體酶abzyme

生物工程酶其它：模擬酶核酸類:克隆酶遺傳修飾酶蛋白質(zhì)工程新酶、RibozymeDeoxyribozyme第52頁(yè)/共75頁(yè)I型內(nèi)含子剪接型核酶

II型內(nèi)含子錘頭核酶剪切型核酶發(fā)夾核酶自體催化丁型肝炎病毒（HDV)核酶

RNaseP異體催化

二、核酶的分類第53頁(yè)/共75頁(yè)1.剪接型核酶

剪接型核酶的作用機(jī)制是通過(guò)既剪又接的方式除去內(nèi)含子（Intron)。第54頁(yè)/共75頁(yè)1）I類內(nèi)含子的自我剪接(Self-splicing)I型IVS(interveningsquense,間隔序列）是與四膜蟲(chóng)26srRNA前體的IVS結(jié)構(gòu)相似的間隔序列，具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)。通過(guò)轉(zhuǎn)磷酸酯反應(yīng)，生成成熟的26srRNA及G-IVS，G-IVS經(jīng)兩次環(huán)化生成L-19IVS。催化過(guò)程需要鳥(niǎo)苷酸或鳥(niǎo)苷以及鎂離子參與。剪接機(jī)制L-19IVS在體外的多種酶活性第55頁(yè)/共75頁(yè)p3’HO-Gp3’pP-GOHpP-G3‘HO

Ⅰ類內(nèi)含子的剪接機(jī)制Mg2+或Mn2+GMP,GDP,GTP外顯子

內(nèi)含子或居間序列（Interveningsequence,IVS)5‘第56頁(yè)/共75頁(yè)

第57頁(yè)/共75頁(yè)UCUAAAIVSGUAAPre-rRNAUCU

AAAGUAAUCUoH3’5‘GAAAGUAAUCUUAA5’GAAAGOH3’G-IVSL-19IVS19nt5‘3‘rRNA5‘3‘5‘pGOH3‘5‘3‘四膜蟲(chóng)rRNA前體自我剪接反應(yīng)第58頁(yè)/共75頁(yè)第59頁(yè)/共75頁(yè)1、轉(zhuǎn)核苷酸作用

2CpCpCpCpCCpCpCpCpCpC+CpCpCpC2、水解作用

CpCpCpCpCCpCpCpC+pC3、轉(zhuǎn)磷酸作用CpCpCpCpCpCp+UpCpUCpCpCpCpCpC+UpCpUp4、去磷酸作用

CpCpCpCpCpCpCpCpCpC+Pi5、限制性內(nèi)切酶作用

CpUpCpUpN+GCpUpCpU+GpN第60頁(yè)/共75頁(yè)2）Ⅱ類內(nèi)含子的自我剪接Ⅱ型IVS是與細(xì)胞核mRNA前體的IVS結(jié)構(gòu)相似的間隔序列。通過(guò)轉(zhuǎn)磷酸酯反應(yīng)，生成成熟的RNA及套環(huán)狀的IVS。催化的剪接反應(yīng)不需要鳥(niǎo)苷或鳥(niǎo)苷酸參加，但仍需要鎂離子(Mg2+)。剪接機(jī)制第61頁(yè)/共75頁(yè)p2‘HO-Ap

p-Ap3’OHpP-AHO3’Ⅱ類內(nèi)含子的剪接機(jī)制Mg2+套環(huán)的形成5‘3‘外顯子連接第62頁(yè)/共75頁(yè)2.剪切型核酶

這類RNA進(jìn)行自身催化的反應(yīng)是只切不接。

1）自體催化剪切型

剪切機(jī)制

第63頁(yè)/共75頁(yè)轉(zhuǎn)酯化過(guò)程：由靠近切割位點(diǎn)3‘端的2’OH或氧原子對(duì)切割位點(diǎn)的磷原子實(shí)施親核攻擊，產(chǎn)生5‘-OH和2’，3‘-環(huán)磷酸二酯。

剪切機(jī)制核酶自身剪切反應(yīng)第64頁(yè)/共75頁(yè)錘頭型核酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)和空間立體結(jié)構(gòu)示意圖三個(gè)雙螺旋區(qū)。13個(gè)核苷酸殘基保守序列。剪切反應(yīng)在右上方GUX序列的3‘端自動(dòng)發(fā)生。第65頁(yè)/共75頁(yè)發(fā)夾（hairpin）結(jié)構(gòu)1989年漢普（Hample）研究煙草環(huán)斑病毒（sTRSV）的負(fù)鏈RNA的自我剪切反應(yīng)，提出發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpinstructure）模型。發(fā)夾核酶結(jié)構(gòu)模型第66頁(yè)/共75頁(yè)四個(gè)螺旋區(qū)、三個(gè)連接區(qū)和兩個(gè)環(huán)。剪切反應(yīng)發(fā)生在底物識(shí)別序列GUC的5‘端。5‘3‘

發(fā)夾二級(jí)結(jié)構(gòu)模型剪切位點(diǎn)第67頁(yè)/共75頁(yè)2)異體催化剪切型

核糖核酸酶P(RNaseP)是內(nèi)切核酸酶，是核糖核蛋白體復(fù)合物，能剪切所有tRNA前體的5‘端，除去多余的序列，形成3’-OH和5’-磷酸末端。

RNaseP由M1RNA和蛋白質(zhì)亞基組成。第68頁(yè)/共75頁(yè)攜帶氨基酸