基因工程8DNA誘變課件

第十章DNA誘變突變是研究基因結(jié)構(gòu)與功能的最基本手段。分離自發(fā)突變體或用物理、化學(xué)誘變劑處理活體來獲得突變，再根據(jù)突變體的表型，采用遺傳學(xué)方法鑒定相應(yīng)基因。體外誘變：對(duì)克隆化的DNA進(jìn)行誘變處理，改變其核苷酸序列，從而獲得突變基因，用于基因工程、蛋白質(zhì)工程等研究。定向進(jìn)化的原理第一節(jié)隨機(jī)誘變體外隨機(jī)誘變：指隨機(jī)地在克隆化DNA中引入堿基置換突變。特點(diǎn)：不需要有序列針對(duì)性的合理設(shè)計(jì)，引入突變的位置隨機(jī)；結(jié)果：在目的DNA片段中引入大量的序列多樣性；方法：錯(cuò)誤摻入誘變、增變菌株誘變、盒式誘變、化學(xué)誘變；用途：誘變基因的編碼區(qū)，改變氨基酸序列，從而改造蛋白質(zhì)的性質(zhì)或活性，得到符合需要的蛋白質(zhì)。定向進(jìn)化：對(duì)于某些實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，一次突變很難獲得滿意的結(jié)果，通常采用反復(fù)多次誘變和循環(huán)，其目的是獲得滿足人們需要的性能改良的蛋白質(zhì)，又稱為試管進(jìn)化。易錯(cuò)PCR采用的方法：增加MgCl2濃度到7mM，穩(wěn)定非互補(bǔ)的堿基配對(duì)；加入0.5mM的MnCl2，Mn

2+能降低聚合酶對(duì)模板的特異性；增加聚合酶量到5U，促使在錯(cuò)配堿基處繼續(xù)延伸反應(yīng)；限定4種堿基中的一種，通常為正常濃度的1-10%，在缺乏正確核苷酸時(shí)，DNA聚合酶經(jīng)短暫停頓后，會(huì)插入另外3種可用核苷酸的一種；

3種為正常濃度的正常堿基，第四種為次黃嘌呤dITP（可與C、T、A配對(duì)）；增加dCTP和dTTP的濃度到1mM，促進(jìn)錯(cuò)誤摻入；使用突變DNA聚合酶，如Mutazyme。二、盒式誘變盒式取代誘變混合寡核苷酸誘變盒式取代誘變種類簡單的盒式取代誘變是通過限制性酶切除去特定的雙鏈DNA片段，再與含有突變的單一序列雙鏈寡核苷酸連接,得到取代突變，是一種定點(diǎn)誘變?；旌瞎押塑账嵴T變混合寡核苷酸誘變：若用于取代的是含有隨機(jī)突變的混合雙鏈寡核苷酸，則可在限定區(qū)域內(nèi)引入大量的隨機(jī)突變。四、化學(xué)誘變用化學(xué)誘變劑處理雙鏈DNA片段，將發(fā)生隨機(jī)突變的片段群體克隆到合適的宿主中，構(gòu)建成一個(gè)重組突變體庫。用適當(dāng)?shù)墓δ芊治隹设b別攜帶突變的重組子。常用的化學(xué)誘變劑：1.烷基磺酸鹽和烷基硫酸鹽——甲基磺酸乙酯（EMS）、硫酸二乙酯（DES）2.亞硝基烷基化合物——亞硝基乙基脲（NEH）、N-亞硝基-N-乙基脲烷（NEU）3.次乙胺和環(huán)氧乙烷類——乙烯亞胺（EI）4.芥子氣類——氮芥類、硫芥類

烷化劑作用機(jī)制——作用重點(diǎn)是核酸，導(dǎo)致DNA斷裂、缺失或修補(bǔ)。這類化合物具有與DNA堿基類似的結(jié)構(gòu)。

代表藥劑：

5-溴尿嘧啶（BU）、5-溴去氧尿核苷（BudR）為胸腺嘧啶（T）的類似物

2-氨基嘌呤（AP）為腺嘌呤（A）的類似物

馬來酰肼（MH）為尿嘧啶（U）的異構(gòu)體核酸堿基類似物亞硝酸能使嘌呤或嘧啶脫氨，改變核酸結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，造成DNA復(fù)制紊亂。HNO2還能造成DNA雙鏈間的交聯(lián)而引起遺傳效應(yīng)。

疊氮化鈉(NaN3)是一種呼吸抑制劑，能引起基因突變，可獲得較高的突變頻率，而且無殘毒。其它誘變劑作用機(jī)制——作為DNA的成份而滲入到DNA分子中去，使DNA復(fù)制時(shí)發(fā)生配對(duì)錯(cuò)誤，從而引起有機(jī)體變異。第二節(jié)DNA體外重組依賴序列同源性的DNA體外重組技術(shù)。要求：DNA親本序列之間要有一定程度的同源性，重組交換在局部序列完全相同的片段內(nèi)發(fā)生。關(guān)鍵：引入DNA片段的重新組裝過程，又稱有性PCR（sexualPCR）或分子育種PCR（molecularbreedingPCR）。優(yōu)點(diǎn)：可以將大量突變中的有益突變快速地組合，加速產(chǎn)生DNA序列多樣性，使定向進(jìn)化從以往的“突變—選擇”模式變?yōu)榕c自然進(jìn)化更為相似的“突變—重組—選擇”模式。二、交錯(cuò)延伸重組（staggeredextensionprocess）交錯(cuò)延伸重組是一種簡化的DNAshuffling技術(shù)。它不是由短片段組裝全長基因，而是在PCR樣反應(yīng)中將含不同點(diǎn)突變的模板混合，隨之進(jìn)行多輪變性、短暫（5sec）復(fù)性/延伸反應(yīng)，在每一輪PCR循環(huán)中，那些部分延伸的片段可以隨機(jī)地雜交到含不同突變的模板上繼續(xù)延伸，由于模板轉(zhuǎn)換而實(shí)現(xiàn)不同模板間的重組，這樣重復(fù)直到獲得全長基因片段，重組的程度可通過調(diào)整反應(yīng)時(shí)間和溫度來控制。三、隨機(jī)引發(fā)重組(randompriminginvitrorecombination，RPR)RPR以單鏈DNA為模板，配合一套隨機(jī)序列引物，先產(chǎn)生大量互補(bǔ)于模板不同位點(diǎn)的短DNA片段，由于堿基的錯(cuò)配和錯(cuò)誤引發(fā)，這些短DNA片段中也會(huì)有少量的點(diǎn)突變，在隨后的PCR反應(yīng)中，它們互為引物進(jìn)行合成，伴隨組合，再組裝成完整的基因長度。該法可以用一條DNA單鏈為模板，因此可以直接以cDNA為模板進(jìn)行隨機(jī)引發(fā)重組。第三節(jié)寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變70年代初Φx174DNA（ssDNA5386bp），當(dāng)用帶琥珀突變的ssDNA與變性的野生型DNA片段一起轉(zhuǎn)染細(xì)菌時(shí)，觀察到“標(biāo)記獲救”現(xiàn)象，即產(chǎn)生帶野生型基因組的噬菌體。二、誘變寡核苷酸的設(shè)計(jì)要求①與靶DNA的適當(dāng)鏈互補(bǔ)，并注意與模板的其他區(qū)域不能錯(cuò)誤雜交；②足夠的長度與靶序列特異地結(jié)合，1-2個(gè)堿基改變的引物要求至少25個(gè)堿基長度；③錯(cuò)配堿基位于中央位置，使每側(cè)有10-15個(gè)堿基與模板鏈完全匹配；④含有與模板完全雜交的5’端區(qū)，這樣從上游引物起始的DNA合成不至于取代誘變寡核苷酸引物；⑤誘變寡核苷酸引物3’區(qū)域有10-15個(gè)堿基與模板鏈完全匹配，形成足夠穩(wěn)定的雜交分子；⑥無回紋、重復(fù)或自身互補(bǔ)序列；⑦必要時(shí)可在誘變寡核苷酸上加入新的酶切位點(diǎn)，或消除靠近誘變點(diǎn)的已有酶切位點(diǎn)。三、經(jīng)典DNA定點(diǎn)誘變?cè)赑CR技術(shù)得到廣泛使用之前，定點(diǎn)誘變程序均采用普通的DNA聚合酶催化DNA的復(fù)制。通常以單鏈DNA為模板，大部分方案利用了M13噬菌體可制備單鏈DNA的特點(diǎn)。M13噬菌體是一種絲狀噬菌體，只感染雄性大腸桿菌，不裂解大腸桿菌細(xì)胞，可形成模糊噬菌斑，其基因組為閉合環(huán)狀DNA，插入M13的DNA可以分別回收到兩種形式：dsDNA和ssDNA。（三）轉(zhuǎn)化子誘變（transformersite-directedmutagenesis）

轉(zhuǎn)化子誘變也使用了2個(gè)寡核苷酸引物，除了突變引物外，還使用了1個(gè)用來剔除單一酶切位點(diǎn)的引物。因此該方法也稱酶切位點(diǎn)剔除法。將待突變的DNA片段裝載到克隆載體上，該載體上必須存在1個(gè)單一酶切位點(diǎn)。當(dāng)這兩個(gè)引物同時(shí)指導(dǎo)DNA合成時(shí)，突變的DNA鏈將不再含有該單一酶切位點(diǎn)，而模板DNA在該位置能被切割。通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌，線性化的模板DNA不能復(fù)制，只有突變保持環(huán)狀，可以獲得轉(zhuǎn)化子。四、PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變優(yōu)點(diǎn)：突變體回收率高；快速簡便，不需制備單鏈DNA模板；高溫的利用可降低模板DNA形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的幾率；所有反應(yīng)可在同一試管進(jìn)行。缺點(diǎn)：PCR擴(kuò)增DNA時(shí)會(huì)產(chǎn)生一定程度的堿基錯(cuò)配；在擴(kuò)增DNA的3’末端加上非預(yù)設(shè)堿基；對(duì)每套引物和模板，PCR反應(yīng)的條件都需要優(yōu)化；標(biāo)準(zhǔn)PCR不能有效擴(kuò)增大于3kb的DNA片段。（一）大引物PCR誘變（二）重疊延伸PCR誘變(overlappingextensionPCR)（三）重疊延伸剪接技術(shù)（splicingbyoverlapextension,SOE）（四）同源重組法（五）雙向PCR快速定點(diǎn)誘變五、野生型DNA的篩選和排除限制性內(nèi)切酶DpnI可特異性切割dsDNA中的Gm6ATC位點(diǎn)，對(duì)半甲基化的DNA效率較低，完全不能切割非甲基化DNA。大腸桿菌體內(nèi)DNA在Dam甲基化酶催化下完全甲基化，對(duì)DpnI敏感。第四節(jié)嵌套缺失逐步從感興趣的DNA的一端或兩端刪除多個(gè)寡核苷酸，得到一套終末端長短不同的嵌套缺失突變體，這個(gè)突變體群體也稱漸次截短文庫。外切核酸酶Ⅲ（3’→5’外切核酸酶活性）

BAL31核酸酶（3’→5’外切核酸酶活性）

DNaseI（內(nèi)切核酸酶活性）一、外切核酸酶Ⅲ的消化二、BAL31核酸酶消化主要活性為3’外切核酸酶