基因工程原理楊紅final5課件

基因工程原理PrincipleofGeneEngineering第一章第一節(jié)基因工程原理LiaoningNormalUniversityLNNU第四章第四章目的基因的分離與修飾第一節(jié)基因的基本結(jié)構(gòu)特征第二節(jié)基因組文庫第三節(jié)目的基因的分離與制備第四節(jié)基因突變與修飾第一章第一節(jié)基因工程原理一個能轉(zhuǎn)錄、翻譯的結(jié)構(gòu)基因依次包括：轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)核糖體識別區(qū)編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)起始密碼子ATG開放閱讀框終止密碼子（TAG、TAA、TGA）原核生物基因啟動區(qū)的結(jié)構(gòu)乳糖操縱子模型二、真核生物基因的組成基因區(qū)轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)轉(zhuǎn)錄區(qū)四、基因的排列重疊基因：是指兩個或兩個以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成為兩個或兩個以上基因的組成部分。重復(fù)基因：重復(fù)基因指染色體上存在多數(shù)拷貝基因，重復(fù)基因往往是生命活動最基本，最重要的功能相關(guān)的基因。加倍基因基因重排：基因的可變區(qū)通過基因的轉(zhuǎn)座、DNA的斷裂錯接而使正?；蝽樞虬l(fā)生改變的現(xiàn)象。尤指在B細(xì)胞分化過程中抗體基因的重排及T細(xì)胞抗原受體基因的重排，是基因差別表達(dá)的一種調(diào)控方式。第二節(jié)基因組文庫基因組文庫（DNA文庫）：某種生物的基因組DNA通過克隆載體儲存在一個受體菌的群體之中，這個群體即為這種生物的DNA文庫。cDNA文庫：某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的部分或全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA片段分別與克隆載體重組，貯存在一種受體菌群體中，這個群體叫cDNA文庫?；蛭膸欤╣enelibrary)——某種生物的全部遺傳信息通過克隆載體儲存在一個受體菌的群體之中，這個群體即為這種生物的基因文庫。1976年，Clark等提出估算克隆子數(shù)的公式。N=ln（1-P）/ln（1-f）N：基因組文庫必需的克隆數(shù)目P：文庫中目的基因出現(xiàn)的概率（99%）f：插入片段大小于基因組大小的比值例如上面例子：N=ln（1-0.99）/ln（1-15/3×106）=9×105個為了保證基因組文庫具有代表性，一般構(gòu)建基因組文庫的實際克隆子數(shù)應(yīng)該比上述計算值大2—3倍與基因組大小成正比與克隆的DNA片段大小成反比與載體的容量有關(guān)：某一生物如果用質(zhì)粒作載體需要900萬個克隆，用λ噬菌體需要90萬個克隆，用cosmid作載體需要35萬個克隆。（1）制備基因組DNA并片段化3.構(gòu)建基因組文庫的基本步驟提取總基因組DNA切割：機(jī)械方法、RE法、識別序列4位點回收：電泳、梯度離心（2）DNA片段與載體重組連接+4.原核生物基因組文庫的構(gòu)建二、真核生物基因組文庫的構(gòu)建1.構(gòu)建λ噬菌體基因組文庫2.用Cosmid構(gòu)建基因組文庫三、cDNA基因文庫的構(gòu)建從基因組分離基因難度大：基因以單拷貝形式存在，占染色體DNA的10-5——10–7；真核染色體DNA大，難定位基因；真核生物基因有內(nèi)含子，在原核細(xì)胞表達(dá)時沒有加工功能。1.cDNA文庫的概念——某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的部分或全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA片段分別與克隆載體重組，貯存在一種受體菌群體中，這個群體叫cDNA文庫。表達(dá)型cDNA文庫：直接檢測表達(dá)產(chǎn)物-蛋白質(zhì)，篩選重組克隆，不知道目的基因序列和蛋白氨基酸序列。非表達(dá)型cDNA文庫：已知目的基因序列或蛋白氨基酸序列，可以通過雜交篩選。mRNA分級：梯度離心，電泳，mRNA轉(zhuǎn)譯活性鑒定——無細(xì)胞體系（兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物）——蛙卵系統(tǒng)（非洲爪蟾卵母細(xì)胞系統(tǒng)）Oligo（dT）引導(dǎo)的cDNA合成mRNA-cDNA（2）以mRNA分子為模版，合成cDNA第一鏈（3）雙鏈cDNA的合成AAAAAAAAAAAAAAA①大腸桿菌RNaseH媒介取代法②Oligo（dG）寡聚引物引導(dǎo)法合成雙鏈DNA③PCR法RNADNA（4）將合成的雙鏈cDNA重組到質(zhì)?；蚴删w載體上，導(dǎo)入大腸桿菌增殖①以質(zhì)粒為載體構(gòu)建cDNA文庫：重組子鑒定、文庫擴(kuò)增方便?？寺⌒实?。以質(zhì)粒為載體構(gòu)建cDNA文庫末端轉(zhuǎn)移酶dGTP②以噬菌體為載體構(gòu)建cDNA文庫克隆效率高，重組子鑒定、文庫擴(kuò)增繁瑣。③mRNA豐度與cDNA文庫大小的關(guān)系cDNA文庫大小的理論估算：文庫中cDNA的克隆數(shù)細(xì)胞總mRNA數(shù)細(xì)胞中某種mRNA的拷貝數(shù)=例如：細(xì)胞總mRNA數(shù)為500500個，——豐度為3500拷貝/細(xì)胞的基因，其cDNA文庫應(yīng)為：500500/3500=143個克??；——豐度為14拷貝/細(xì)胞的基因，其cDNA文庫應(yīng)為：500500/14=35750個克??；N：cDNA基因組文庫必需的克隆數(shù)目P：文庫中目的基因出現(xiàn)的概率（99%）f：mRNA豐度與總mRNA比值實際cDNA基因文庫大?。篘=ln（1-P）/ln（1-f）例如，豐度3500時，N是650個。N=ln（1-0.99）/ln（1-3500/500500）=650個4.cDNA克隆的優(yōu)越性cDNA克隆適合RNA病毒的研究cDNA文庫的篩選比較簡單易行目的基因篩選的假陽性率低可以克隆在細(xì)菌中表達(dá)的基因用于mRNA的結(jié)構(gòu)和功能的研究第三節(jié)目的基因的分離與制備基因文庫分離法PCR擴(kuò)增法差式分析法DNA插入誘變法基因定位克隆標(biāo)簽測序法化學(xué)合成法一、從基因文庫中篩選分離目的基因1.制備核酸探針進(jìn)行雜交篩選制備猜測體探針：根據(jù)已知氨基酸順序人工合成探針。探針的特異性：長度不小于17-20bp（6個以上連續(xù)氨基酸順序）遺傳密碼的簡并性：一組探針，導(dǎo)致假陽性。與cDNA文庫雜交事實上的DNA序列將已知蛋白作為抗原，從cDNA表達(dá)文庫中篩選。cDNA應(yīng)克隆在表達(dá)載體中一般以融合形式表達(dá)目的基因考慮cDNA表達(dá)的方向性Westernblotting方法2.制備抗體進(jìn)行免疫雜交篩選disulfidebridges抗原-抗體免疫反應(yīng)必須在特異性蛋白純化后應(yīng)用某些基因的表達(dá)量很少，難以純化有些基因沒有蛋白產(chǎn)物不同發(fā)育階段、不同環(huán)境下蛋白不同遺傳密碼簡并性導(dǎo)致正確探針的難度?！帽豢寺NA片段與寄主細(xì)胞染色體DNA在功能上的同源互補(bǔ)性篩選目的基因。例如：大腸桿菌His缺陷型寄主細(xì)胞，原因之一是吲哆甘油磷酸脫氫酶基因突變。利用這特點，篩選面包酵母吲哆甘油磷酸脫氫酶基因。3.功能互補(bǔ)法克隆基因His-His-：大腸桿菌His-菌株不能生長某cDNA文庫的cDNA片段導(dǎo)入大腸桿菌His-菌株說明產(chǎn)生His的酶的基因重組進(jìn)大腸桿菌His-菌株中4.利用PCR技術(shù)篩選基因文庫5.利用噬菌體表面顯示技術(shù)分離目的cDNA克隆噬菌體表面顯示技術(shù)：也稱噬菌體展示技術(shù)，將外源蛋白質(zhì)或多肽的基因插入到絲狀噬菌體外殼蛋白質(zhì)基因的信號肽后，與噬菌體外殼蛋白融合表達(dá)，展示在噬菌體顆粒的表面，借助于固體基質(zhì)上附著的抗體、受體等分子與靶分子的親和力，篩選目的蛋白?！茄芯康鞍踪|(zhì)相互作用的一種重要方法。６.利用酵母雙雜合系統(tǒng)分離目的cDNA克隆酵母雙雜交技術(shù)原理利用轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4的特性而建立的。GAL4GAL4由兩個結(jié)構(gòu)域組成：N端的DNA結(jié)合域(DB)C端的轉(zhuǎn)錄激活域(AD)酵母雙雜交技術(shù)研究蛋白質(zhì)之間的相互作用是細(xì)胞內(nèi)實驗，即不需提純蛋白便可研究蛋白的相互作用，消除了提純過程引起的蛋白變性，因而研究的是有生物活性的蛋白與蛋白之間的相互作用，反映了體內(nèi)的真實作用情況。大規(guī)模酵母雙雜交技術(shù)的局限性酵母雙雜交篩系統(tǒng)雖因其優(yōu)點而廣泛用于研究蛋白質(zhì)相互作用，但也有其自身固有的缺點，如實驗設(shè)計、結(jié)果處理和分析時都要考慮的假陽性和假陰性問題。假陰性產(chǎn)生的原因●細(xì)胞定位特性出現(xiàn)假陰性結(jié)果：分泌蛋白難以檢測；●蛋白未能正確修飾和折疊；●有的蛋白對酵母菌株有毒性或抑制菌株生長●BD-X的自激活作用；●一些AD-Y融合蛋白中的Y可能結(jié)合BD或啟動子附近序列或蛋白，并能激活轉(zhuǎn)錄；●BD-X與AD-Y并非通過BD-X－Y-AD直接激活轉(zhuǎn)錄，而是通過第3種蛋白或多蛋白的復(fù)合體把X、Y募集到一起，然后激活轉(zhuǎn)錄；●非特異BD-X－Y-AD相互作用，因為有的蛋白表面具有成簇的疏水氨基酸或其它可引起X、Y非特異作用的結(jié)構(gòu)；假陽性產(chǎn)生的原因二、利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增目的基因PCR技術(shù)的基本原理：1.套式PCR技術(shù)(nestedPCR)巢式PCR（nestedPCR），是指利用兩套PCR引物（巢式引物）對進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在第一輪擴(kuò)增中，外引物用以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，此產(chǎn)物在內(nèi)引物的存在下進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。2.反向PCR技術(shù)(inversePCR)未知序列已知序列3.錨定PCR(anchoredPCR)RACE:rapidamplificationofcDNA,是以mRNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈,然后用PCR技術(shù)擴(kuò)增出從某個特定為點到3‘和5’端之間的未知核苷酸序列,對應(yīng)成為3‘RACE和5’RACE.Oligo(dT)n錨定引物4.不對稱PCR(asymmetricPCR)5.長程PCR(longandaccuratedPCR,LAPCR)6.逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)7.AluPCR三、利用差式分析法分離目的基因克隆1.mRNA差別顯示技術(shù)（DD-PCR）mRNA差別顯示技術(shù)的原理和基本程序２.代表性差別分析技術(shù)（１）傳統(tǒng)的減法雜交技術(shù)——從表達(dá)目的基因的組織中提取mRNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與無目的基因表達(dá)的組織中提取的mRNA雜交形成cDNA-mRNA雙鏈分子，通過層析去掉雜交分子后，留下的單鏈cDNA中含有目的基因。逆轉(zhuǎn)錄無目的基因表達(dá)的組織中提取的mRNA表達(dá)目的基因組織中提取的mRNA（２）基因組DNA的代表性差別分析技術(shù)檢測DNA驅(qū)趕DNA檢測DNA驅(qū)趕DNA（３）cDNARDA３．抑制性減法雜交技術(shù)（SSH）四、DNA插入誘變分離目的基因1.轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法２.T-DNA標(biāo)簽法五、應(yīng)用基因定位克隆技術(shù)分離篩選目的基因1.基因定位克隆的基本步驟２.染色體步查法分離目的基因（chromosomewalking）六、標(biāo)簽測序法分離目的基因1.表達(dá)序列標(biāo)簽法（EST）是指基因序列中一段能特異地標(biāo)記或表征基因的序列，通常它含有足夠的結(jié)構(gòu)信息以顯示出該基因與其它基因的差異，長度為100-500bp。２.基因表達(dá)序列分析法（SAGE）：（1）從轉(zhuǎn)錄物某一特定位置上分離得到一段9-10kb的寡核苷酸引物，該引物含有確定一個獨(dú)特轉(zhuǎn)錄物的足夠信息，可以代表此轉(zhuǎn)錄物的特異性；（2）多個序列標(biāo)簽?zāi)芤藻^定酶識別為點序列相隔連成雙標(biāo)簽序列的多聯(lián)體。生物素-oligo(dT)七、基因的酶法合成第四節(jié)基因的突變與修飾一、隨機(jī)誘變1.盒式誘變（cassettemutagenesis）2.化學(xué)誘變３