舊版PFGE脈沖場(chǎng)電泳技術(shù)培訓(xùn)4CHEF故障排除20140224課件

脈沖場(chǎng)電泳技術(shù)（PFGE）培訓(xùn)

王彤宇培訓(xùn)部

Mar-2014CHEF脈沖場(chǎng)電泳的故障排除PFGETroubleShooting排除PFGE凝膠故障比較復(fù)雜，涉及到多種因素:

實(shí)驗(yàn)室各自的技巧和技能

實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和設(shè)備條件

試劑

水質(zhì)

實(shí)驗(yàn)過程中意外的干擾和分心（一）PFGE技術(shù)故障排除的一般考慮因素想一想，對(duì)照上次成功的實(shí)驗(yàn)，有哪些因素變化了？過程方面：儀器設(shè)備試劑耗材人力因素考慮操作規(guī)程中的所有步驟，自檢式提問是否故障源自于其中某一個(gè)環(huán)節(jié)？考慮和觀察凝膠的每片區(qū)域，試圖識(shí)別其中某個(gè)區(qū)域可能同失敗的原因有關(guān)聯(lián)要做到這些，操作者必須對(duì)每一步驟的的目的很熟悉，以及對(duì)每一步錯(cuò)誤的操作可能帶來的潛在后果明晰（一）PFGE技術(shù)故障排除的一般考慮因素（二）模糊一片的條帶(FuzzyorSmearyBands)Smearybandsaffectingsamplesaloneorsamples&standard分析：這是很典型的假象造成原因是蛋白酶消化或核酸內(nèi)切酶切割不完全.只有小膠塊的外周邊緣接觸到酶，得到了消化，而中心區(qū)域的樣品卻未被處理到位，所以樣品電泳結(jié)果象個(gè)“盒子”改進(jìn)建議：

小膠塊做薄點(diǎn)；降低制作小膠塊的瓊脂糖濃度酶處理時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)采用新鮮酶試劑增加酶的濃度（二）類似現(xiàn)象或稱為BoxShapedBands（三）歪曲的條帶(DistortedBands)現(xiàn)象：液體樣品加載到梳孔中，如果出現(xiàn)長(zhǎng)方形寬闊條帶或是【形，往往由于頂部的凝膠比底部冷卻快的原因，所以條帶會(huì)傾斜Liquidsamplesloadedtothetopofthewellproduceawidesquarebandordoubletwithsides(anopensquareshape).Thisiscausedbythetopofthegelbeingcoolerthanthebottomofthegelsothatthebandrunsataslant.（三）歪曲的條帶DistortedBands微微歪曲的條帶------電極方面的問題（三）歪曲的條帶DistortedBands歪曲的條帶-----加樣方面的問題（四）樣品沒有往下方向遷移

SamplesNotMigratingDowntheGel樣品沒有進(jìn)入凝膠:如果標(biāo)準(zhǔn)樣品遷移正常的話,有可能樣品在前處理時(shí)沒有酶解完全

電極問題–檢測(cè)電流，電線連接，電泳時(shí)電極上的氣泡，轉(zhuǎn)換電場(chǎng)方向時(shí)…樣品雖然進(jìn)入了凝膠，但在中途停了下來:瓊脂糖類型和濃度?主機(jī)電源參數(shù)有否變化?(比如,輸入電壓值，電流值?)緩沖液類型和濃度?檢查電路連接是否完好.在編有多套固定參數(shù)模塊的方案中，儀器為第2套步驟自設(shè)的電壓值為0.6V/cm.用戶注意需要為第1套和第2設(shè)置電壓值（四）樣品遷移方向錯(cuò)誤

SamplesMigratetotheWrongDirection原因可能是程序錯(cuò)誤，尤其在含有多狀態(tài)參數(shù)組合的程序中出錯(cuò)。因?yàn)閙ulti-state模式要求輸入與垂直方向的夾角，一SamplesarenotgoinginthecorrectdirectionintheCHEFMapper,theproblemmaybeaprogrammingerrorwhileintheMulti-Statemode.Themulti-statemodewillaskforananglefromthevertical,ratherthantheincludedangle.So,forexample,theresearchermistakenlyprogramsin120degrees,thenthesamplewillruninthewrongdirectionata30degreeangle.（四）樣品遷移方向錯(cuò)誤

SamplesMigratetotheWrongDirection樣品條帶整體偏向左側(cè)或右側(cè)，可能的原因：電極斷裂Brokenelectrodeorelectrodes.某對(duì)電極的電位有差異電泳槽的電子部分由問題，比如，在槽蓋的電插座上未連接通，靠這部分通路連接主機(jī)電源部分建議測(cè)量電極對(duì)的電壓/電流（拆、揭開電泳槽面,24對(duì)電線）（四）樣品遷移方向錯(cuò)誤

SamplesMigratetotheWrongDirectionTopofgel(wells)BottomofgelLadders（四）樣品遷移方向錯(cuò)誤

SamplesMigratetotheWrongDirection（四）樣品遷移方向錯(cuò)誤

SamplesMigratetotheWrongDirection樣品條帶整體偏向左側(cè)或右側(cè)，可能的原因：有時(shí)緩沖液循環(huán)回路有問題，由于瓊脂糖碎片堵塞引起循環(huán)問題建議凝膠放穩(wěn)在膠框架內(nèi)，以免電泳是飄移；使用儀器原配膠框，自制的框不能太厚而阻擋電流使用擋膠條，沖洗清潔整個(gè)管路和接口（四）樣品遷移方向錯(cuò)誤

SamplesMigratetotheWrongDirection樣品條帶向外歪斜，可能的原因：緩沖液量不夠，沒有蓋沒凝膠，梳孔使用時(shí)間長(zhǎng)了，產(chǎn)生彎曲弧度，兩側(cè)由于瓊脂糖碎片堵塞引起循環(huán)問題建議加入大約2.1-2.2升緩沖液；把梳齒反過來安裝在固定架上。(五)蛋白酶K消化步驟不完全

沒加Sarcosyl(十二烷基肌氨酸鈉）(五)蛋白酶K消化后沒有充分洗膠塊以去除碎片雜質(zhì)

Sameplugswashed6XwithTESmearingandincompleterestrictionresultingfrominsufficientwashing,1stfigureshowsplugswashed4timeswithTE,2ndshowsplugswashed6timeswithTE.Plugswashed4XwithTE10Units20Units40UnitsIncompletedigestionduetolowenzymeconcentrationresultsinghostbands.Byincreasingenzymeconcentrationto40unitscompletedigestionwasachieved.Ghostbands建議:

多用TE洗2次小膠塊

確保體系中加入足夠的酶---增加酶單位

確認(rèn)DNA濃度沒有過高，從第一步減少菌體液開始，或者切小點(diǎn)、薄點(diǎn)的小膠塊（六）限制性核酸內(nèi)切酶步驟問題Troubleshooting----RestrictionStepsCompleteDigestion建議:(continued):

配置酶切預(yù)混液的內(nèi)切酶和緩沖液必須高質(zhì)量---注意保存條件，不能使用過期的酶孵育時(shí)間過長(zhǎng)(過夜），就出現(xiàn)了“星暈狀---StarActivity）現(xiàn)象；同樣的酶（Ascl)反應(yīng)2小時(shí)，則沒有*Barany,F.(1988)Gene68,149AscIApaIAscIApaISame

plugsre-testedovernightincubation2hourincubation（六）限制性核酸內(nèi)切酶步驟問題Troubleshooting----RestrictionStepsWithoutthioureaWiththiourea（六）限制性核酸內(nèi)切酶步驟問題依賴于硫尿處理或無法分型的菌株Tris-緩沖液在電泳過程中產(chǎn)生的一些氧化物質(zhì)，某些菌體本身在酸性緩沖液中容易降解，硫尿作為一種還原劑能中和氧化物質(zhì)，改善條帶分型或一片模糊拖尾現(xiàn)象用于對(duì)某些難以進(jìn)行條帶分型的菌株適用。Thesameplugswereusedinbothgels.Lanes3,4,6,7,8and9arethiourea-dependent.建議:

在凝膠中加上陽(yáng)性對(duì)照

–用曾經(jīng)驗(yàn)證過的，依賴于硫尿幫助分型的菌株DNA樣品小膠塊.用了這個(gè)陽(yáng)性對(duì)照后，證明無法分型的原因同其它，如制膠塊，試劑等無關(guān)。只是系統(tǒng)中需要硫尿如果DNA質(zhì)量不好,DNA將滯留在孔內(nèi)，即使加入硫尿也無濟(jì)于事.加入50μM

thiourea(i.e.10mg/ml母液取873ml)直接加入到(0.5XTBE)，然后電泳.

只在少部分菌株分型中需要，并非常用Useonlywhenneeded(withknownstrainsorsuspectedserotypes)andnotroutinely.小心:硫尿是變性劑，使用和丟棄時(shí)格外小心，須按照有毒有害廢品管理規(guī)范處理（六）限制性核酸內(nèi)切酶步驟問題依賴于硫尿處理或無法分型的菌株Oldculture48hrs

Freshculture18hrsPFGEgelfromfreshcultureshowsnosmearingandallbandsaredistinct.Lysedcellsarepresentin48houroldcultures(sameorganism),characterizedbysmearsonthePFGEgel(bluearrow).Potentialproblems:Unduestresstobacterialcellspriortocastingtheplugcancausecelllysis,leadingtoDNAdegradationandischaracterizedby“smearing”onthegel.Recommendations:Growculturesonnon-selectivemediaUsefreshculturesgrownfor14–18hoursatappropriatetemperatureandconditionsDonotletculturessitatroomtempformorethananhourbeforemakingcellsuspensionsDonotstoreculturesat4CbeforemakingcellsuspensionsDonotuseculturesgrownformorethan18hours(containlysedcells)DoNOTcentrifugeorvortexcellsuspensionsDoNOTleavebacterialcellsuspensionsatroomtempforextendedperiodsoftimepriortocastingplugs（七）

起始的菌體懸液質(zhì)量Preparingcellsuspension（八）制作包埋菌體的小膠塊步驟

1%1.4%1.2%1.6%1.8%SSSWhenagaroseisreheated,waterevaporatesandtheagaroseconcentrationincreases,resultinginplugsthatdonothavetheexpectedagarosepercentage.Reheatingtheagarose6timesincreasedtheconcentrationfrom1%to2%.S=standardPotentialproblems:AgarosethatistoohotmaydamagethecellsAgarosethickensandsolidifiesasitcools,makingpipettingdifficultandleadingtoanunevendistributionofcellswithinplugsRecommendations:Equilibratemeltedagaroseto50–54oCandkeepwarmwhilecastingplugs.Limitmechanicalforce(pipetting)whenmixingmeltedagarosewithcellsuspensions.Donotre-useplugagarosemorethan3or4times.Repeatedheatingresultsinlossoffluidandincreasestheagaroseconcentration.反復(fù)熔化包埋用瓊脂糖濃度增加2.0%Exposuretime:Tooshort=difficultyvisualizingfaint,bottombandsToolong=Increasedbackground,lossofdistinctionbetweencloselymigratingbandsIncreasingexposuretimeUnder-exposed(6sec