植物離體培養(yǎng)育種課件

植物離體培養(yǎng)育種§1植物離體培養(yǎng)發(fā)展簡史、意義和生物學(xué)原理組織培養(yǎng)的概念組織培養(yǎng)（Tissueculture）是指用無菌方法使植物體的離體器官、組織和細(xì)胞在人為提供的條件下生長和發(fā)育的所有培養(yǎng)技術(shù)的總稱，也稱之為離體培養(yǎng)（Invitroculture）。利用植物體的器官、組織或細(xì)胞，通過無菌操作接種于人工配制的培養(yǎng)基上，在一定的光照和溫度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使之生長發(fā)育的技術(shù)稱為組織培養(yǎng)類別－依外植體的不同劃分

胚胎培養(yǎng)

（embryoculture）未成熟或成熟了的胚器官培養(yǎng)（organculture）根尖、莖尖、子葉、葉片、葉原基、花原基、或花果的未熟部分組織培養(yǎng)或愈傷組織培養(yǎng)（狹義，tissueculture）維管束形成層、貯藏薄壁組織及愈傷組織等細(xì)胞培養(yǎng)

單個(gè)游離細(xì)胞（分離出的體細(xì)胞/花粉細(xì)胞/卵細(xì)胞）原生質(zhì)體培養(yǎng)

除去細(xì)胞壁的原生質(zhì)體植物組織培養(yǎng)是二十世紀(jì)發(fā)展起來的新技術(shù)，近三十年來由于組織培養(yǎng)基礎(chǔ)理論研究的深入，發(fā)展極為迅速，發(fā)表的文獻(xiàn)浩如煙海，幾乎以植物為研究對象的各個(gè)分支學(xué)科都在廣泛進(jìn)行組織培養(yǎng)。發(fā)展簡史1838-1839年，德國科學(xué)家Schleide

和Schwann發(fā)表了細(xì)胞學(xué)說，奠定了組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)。1902年，德國植物學(xué)家Haberlandt

根據(jù)細(xì)胞學(xué)說，提出單個(gè)細(xì)胞的植物細(xì)胞全能性（totipotency）理論。1904年，Hanning

最先成功地培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚。1922年，Knudson采用胚培養(yǎng)法獲得大量蘭花幼苗。1934年，White用番茄根尖建立起第一個(gè)活躍生長的無性繁殖系，從而使非胚器官的培養(yǎng)首先獲得成功。植物組織培養(yǎng)在技術(shù)上的發(fā)展研究材料范圍逐步擴(kuò)大培養(yǎng)方法逐步完善培養(yǎng)基不斷改進(jìn)實(shí)驗(yàn)手段逐步完備胚、胚軸、子葉、幼苗、莖尖、根、葉等；動物細(xì)胞+植物細(xì)胞/微生物原生質(zhì)體固體培養(yǎng)發(fā)展到液體振蕩或旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)、液滴培養(yǎng)、雙層培養(yǎng)、包埋培養(yǎng)White培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基、MT培養(yǎng)基等植物組織培養(yǎng)在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用倍性育種：花藥培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)突變體篩選：愈傷組織培養(yǎng)創(chuàng)造新種質(zhì)：細(xì)胞融合克服胚敗育：胚培養(yǎng)植物性藥物和生物制品的生產(chǎn)組織培養(yǎng)的意義

胚胎培養(yǎng)主要克服遠(yuǎn)緣雜交中胚不能在種子中正常發(fā)育而早期敗育的問題。胚珠和子房培養(yǎng)進(jìn)行試管內(nèi)受精和雜種胚的分化成長，以克服不育性和不親和性等障礙。細(xì)胞及組織培養(yǎng)進(jìn)行優(yōu)良單系的快速繁殖，自交不親和系、雄性不育系的無性繁殖，突變體的誘導(dǎo)與分離及種質(zhì)的保存和運(yùn)輸?shù)确矫妗；ㄋ幖盎ǚ叟囵B(yǎng)單倍體育種，加速獲得純二倍體。原生質(zhì)體培養(yǎng)進(jìn)行體細(xì)胞雜交、核移植和核置換等工作。按培養(yǎng)方法：固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、看護(hù)培養(yǎng)、微室培養(yǎng)、包埋培養(yǎng)等按培養(yǎng)過程：初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)組織培養(yǎng)的類型生物學(xué)原理

植物的再生作用：植物的根、莖、葉等器官、組織和細(xì)胞都具有再生成完整植株的能力。其是無性繁殖的基礎(chǔ)，它是受內(nèi)源激素調(diào)控的。人工控制和調(diào)整培養(yǎng)基成分，可使其發(fā)育成完整的植株。細(xì)胞的分化和形態(tài)發(fā)生：指細(xì)胞在分裂過程中發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能方面的改變，從而在植物個(gè)體發(fā)育過程中形成各類組織和器官，完成整個(gè)生活周期。植物細(xì)胞的全能性（totipotent）：是指植物每個(gè)細(xì)胞都具有該植物體的全部遺傳信息和發(fā)育成完整植株的能力。原理：生物體的每一個(gè)細(xì)胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)，都有發(fā)育成為完整個(gè)體所必需的全部基因，從理論上講，生物體的每一個(gè)活細(xì)胞都應(yīng)該具有全能性。差異：（1）受精卵的全能性最高（2）受精卵分化后的細(xì)胞中，體細(xì)胞的全能性比生殖細(xì)胞的低。潛在全能性的原因：基因表達(dá)的選擇性科學(xué)研究表明，處于離體狀態(tài)的植物活細(xì)胞，在一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件的作用下，就可能表現(xiàn)出全能性，發(fā)育成完整的植株。人工條件下實(shí)現(xiàn)的這一過程，就是植物組織培養(yǎng)。生物學(xué)原理

植物細(xì)胞全能性的表達(dá)

脫分化（dedifferentiation)：將來自已分化組織的已停止分裂的細(xì)胞從植物體部分的抑制性影響下解脫出來，恢復(fù)細(xì)胞的分裂活性。

再分化（redifferentiation):經(jīng)脫分化的組織或細(xì)胞在一定的培養(yǎng)條件下可有轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N不同細(xì)胞類型的能力。植物組織培養(yǎng)特點(diǎn)培養(yǎng)條件可以人為控制組織培養(yǎng)擺脫了大自然中四季、晝夜的變化以及災(zāi)害性氣候的不利影響，且條件均一，對植物生長極為有利，便于穩(wěn)定地進(jìn)行周年培養(yǎng)生產(chǎn)。生長周期短，繁殖率高植物組織培養(yǎng)是由于人為控制培養(yǎng)條件，根據(jù)不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培養(yǎng)條件，因此生長較快?？傮w來說成本低廉，且能及時(shí)提供規(guī)格一致的優(yōu)質(zhì)種苗或脫病毒種苗。管理方便，利于工廠化生產(chǎn)和自動化控制植物組織培養(yǎng)是在一定的場所和環(huán)境下，人為提供一定的溫度、光照、濕度、營養(yǎng)、激素等條件，既利于高度集約化和高密度工廠化生產(chǎn)，也利于自動化控制生產(chǎn)。技術(shù)用途快繁：人工種子、莖尖培養(yǎng)脫毒：微芽嫁接、莖尖培養(yǎng)克服雜交不親和：花藥培養(yǎng)、細(xì)胞融合種質(zhì)資源保存和交換：愈傷組織培養(yǎng)、莖尖培養(yǎng)MS培養(yǎng)基它是1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。特點(diǎn)是無機(jī)鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適，可滿足植物的營養(yǎng)和生理需要。它的硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基為高，廣泛地用于植物的器官、花藥、細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。有些培養(yǎng)基是由它演變而來的。B5培養(yǎng)基是1968年由Galmborg等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。其主要特點(diǎn)是含有較低的銨，這可能對不少培養(yǎng)物的生長有抑制作用。從實(shí)踐得知有些植物在B5培養(yǎng)基上生長更適宜，如雙子葉植物特別是木本植物。一、目前國際上流行的培養(yǎng)基及特點(diǎn)§2植物離體培養(yǎng)需要的基本條件

包括無機(jī)成分和有機(jī)成分。無機(jī)成分包括大量元素和微量元素。有機(jī)成分主要包括糖類、維生素、氨基酸和酰胺類、含氮堿基、生長調(diào)節(jié)劑、自然復(fù)合物（如水解蛋白、酵母提取物、果肉和果汁等）以及其他成分如瓊脂等。培養(yǎng)基的基本成分

植物對無機(jī)鹽類的需求具有廣泛的一致性，偶然加以變動。一般多采用蔗糖。維生素中最關(guān)鍵的是B1，一般用量為0.1-0.4毫克/升。氨基酸和酰胺只用于某些組織培養(yǎng)，而在器官增殖階段加入腺嘌呤也可能是需要的。關(guān)鍵的有機(jī)成分主要是激素和細(xì)胞分裂素。培養(yǎng)基成分的性質(zhì)激素細(xì)胞分裂素赤霉素生長素促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化不定芽6-BA、KT、ZA、2iP誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂和根的分化IBA、IAA、NAA、2,4-DIBA、IAA和IAA誘導(dǎo)生根，2,4-D誘導(dǎo)愈傷組織抑制愈傷組織形成，促進(jìn)芽的形成GA3

幾種激素的配制方法生長素細(xì)胞分裂素赤霉素95%的酒精或0.1mol/L的NaOH或KOH0.5或1mol/L的HCl+微熱溶于水，pH5.7但不穩(wěn)定，用95%的酒精I(xiàn)AA母液（stocksolution）每周制備新鮮備用，容易見光分解（幾天內(nèi)），也容易被植株組織在幾小時(shí)到幾天內(nèi)分解。生長素110-120C穩(wěn)定保存1小時(shí)，但I(xiàn)AA可以被低pH、光、氧和過氧化物破壞。NAA和2,4-D比IAA穩(wěn)定。CTK母液可以在冰箱中保存幾個(gè)月，在長時(shí)間的實(shí)驗(yàn)中，也可能被分解。KT和ZT在120C處理1小時(shí)仍能穩(wěn)定存在，BA100C時(shí)20分鐘。在堿性條件下，GA變成無活性的異構(gòu)體，在強(qiáng)酸性環(huán)境和高溫下，GA也變成無活性的形式。GA熱不穩(wěn)定，114C處理20分鐘降低其活性達(dá)90%，母液需制備新鮮的，并且采用過濾滅菌。激素配比模式生長素與細(xì)胞分裂素的比例決定著發(fā)育的方向，是愈傷組織、長根還是長芽。如為了促進(jìn)芽器官的分化，應(yīng)除去或降低生長素的濃度，或者調(diào)整培養(yǎng)基中生長素與細(xì)胞分裂素的比例。高有利于根的形成和愈傷組織的形成;適中有利于根芽的分化;低有利于芽的形成;生長素/細(xì)胞分裂素生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用甚微，一般用mg／L表示濃度。在組織培養(yǎng)中生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用濃度，因植物的種類、部位、時(shí)期、內(nèi)源激素等的不同而異，一般生長素濃度的使用為0.05-5mg／L，細(xì)胞分裂素0.05—10mg／L。

GrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantletsNosucrose(0%)Sucrosereducedto1%Sucroseincreasedto5%Theexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurface

Veryfewshootshavedevelopedontheexplant.Norootsandnocallus.Shootsdevelopedonedgesofuppersurface,andsomerootdevelopmenthasoccuredShootshavedevelopedoverthesurfaceoftheexplant,alongwithrootsfromthelowersurface.TheresultiscomparablewiththecontrolmediumtissuecultureintheAfricanVioletNoBAP

BAPreducedto0.1mg.l-1

NoNAAPoorshootdevelopmentandnoroots.ExtensivecallusgenerationPoorshootdevelopmentandnorootsNAAreducedto0.1mg.l-1

Morebalanceddevelopmentofrootsandshoots.However,undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplantProfusedevelopmentofrootsandareducednumberofshoots.UndifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplantNoBAP

BAPreducedto0.1mg.l-1

NoNAAPoorshootdevelopmentandnoroots.ExtensivecallusgenerationPoorshootdevelopmentandnorootsNAAreducedto0.1mg.l-1

Morebalanceddevelopmentofrootsandshoots.However,undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplantProfusedevelopmentofrootsandareducednumberofshoots.Undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplant有機(jī)物質(zhì)(Vitaminsandaminoacids)VitB1VitB6VitB3VitB5肌醇CHLHMEYE硫胺素鹽酸吡哆醇煙酸泛酸鈣水解酪蛋白(caseinhydrolysate)水解乳蛋白(lactoalbuminhydrolysate)麥芽提取物(maltextract)酵母浸出物(yeastextract)促進(jìn)細(xì)胞對培養(yǎng)基的反應(yīng)固化劑（gellingagent）瓊脂來于seaweed對植物組織有一定的生理作用用量一般為7-10g/L，即0.7-1%（W/V）太大，培養(yǎng)基過硬；太小，培養(yǎng)基不易凝固不同品牌的瓊脂對外植體的反應(yīng)也不一樣。其它gellingagent：Gelrite（脫乙酰吉蘭糖膠）：透明，Pseudomanas種發(fā)酵產(chǎn)物（多糖）成分穩(wěn)定。碳源營養(yǎng)物質(zhì)滲透壓穩(wěn)定劑類型蔗糖、葡萄糖、果糖、山梨醇、麥芽糖、淀粉等濃度2-5%（W/V）低濃度適合于原生質(zhì)體培養(yǎng)高濃度適合于胚和花藥培養(yǎng)作用蔗糖長時(shí)間高溫處理會發(fā)生焦糖化，形成蛋白黑素，抑制細(xì)胞生長pH計(jì)培養(yǎng)基的pHpH值：5.5~6<5.5：theagarwillnotgelproperly>6：thegelmaybetoofirm滅菌后pH會降低0.6-1.3培養(yǎng)材料降低pH：產(chǎn)生有機(jī)酸，N利用測定方法pH試紙pH計(jì)pH調(diào)整方法1N的HCl和NaOH在加入agar前調(diào)pH培養(yǎng)基的選擇和配制選擇擇材料和種類而異參考前人的研究MS培養(yǎng)基最為基本：高濃度的N、K和NH4+自己試驗(yàn)配制配母液（Stocksolution)取樣加成分測pHok母液的配制大量元素微量元素濃縮10倍（量加大10倍）在配制1L培養(yǎng)培養(yǎng)基時(shí)，只取100ml濃縮100倍（量加大100倍）在配制1L培養(yǎng)培養(yǎng)基時(shí)，只取10ml以KNO3為例1L培養(yǎng)基需要量為19g。在配制母液時(shí)，增加10倍量，為190g。在母液中的濃度為190g/L，即0.19g/ml在配制培養(yǎng)基時(shí)，取10ml，10ml×0.19g/ml=19g無菌室培養(yǎng)室和接種室室內(nèi)滅菌可用2%新潔爾敏擦洗75%乙醇噴霧UV照射20分鐘培養(yǎng)基滅菌方法高溫高壓蒸氣滅菌過濾滅菌121°C，1.1kg/cm2,15-20分鐘，時(shí)間過長，培養(yǎng)基成分易變性失效在高溫高壓下易分解的培養(yǎng)基和激素類器皿和接種工具的滅菌解剖刀、鑷子、剪刀等工具采用干熱滅菌法，用烘箱滅菌，120°C時(shí)1小時(shí)外植體的滅菌原則充分滅菌，但不能損傷外植體不同外植體，滅菌要求不一樣常用方法75%乙醇氯化汞（升汞）次氯酸鈉表面殺菌，具濕潤和殺菌作用，浸30秒常用濃度0.1%處理5-10分鐘，有殘毒濃度2-10%，時(shí)間15-30分鐘，對植物無害

培養(yǎng)所需環(huán)境條件

光照強(qiáng)度：一般而言，愈傷組織的形成并不需要光照；培養(yǎng)前期1000-4000lx，后期10000lx。光照時(shí)數(shù)：不同培養(yǎng)的組織其光照時(shí)間不同，如煙 草愈傷組織采用1000lx16小時(shí)/日培養(yǎng)；而花椰菜組織培養(yǎng)則以4000lx9小時(shí)/日光照為宜。

光質(zhì)：一般采用日光燈作為光源。組織培養(yǎng)中關(guān)鍵的器官形成作用，是種光形態(tài)發(fā)生現(xiàn)象，是受光敏色素控制的。

溫度：一般習(xí)慣將培養(yǎng)物置于恒溫下，通常應(yīng)用的溫度為25OC左右。光§3

通過花藥及花粉培養(yǎng)的單倍體育種單倍體植物在育種上的意義概念：凡是具有配子體的染色體數(shù)的植物稱為單倍體植物。單倍體≠一倍體，是一個(gè)“半倍體”。單倍體在自然界普遍存在，1922年發(fā)現(xiàn)了曼陀羅的單倍體植株，但自然發(fā)生率很低（0.002~0.02%）。人工誘導(dǎo)單倍體在育種上的用途從單倍體的染色體加倍即可獲得純合的二倍體，也可獲得純合的多倍體，育種途徑快速。有利于遠(yuǎn)緣雜種新類型的培育和穩(wěn)定。單倍體植物與誘變育種相結(jié)合，可以加速誘變育種的進(jìn)程。花藥及花粉培養(yǎng)工作的進(jìn)展起始于20世紀(jì)40年代，最初研究目的是調(diào)節(jié)和控制從花粉母細(xì)胞到成熟花粉的生長發(fā)育。大約經(jīng)過半個(gè)世紀(jì)的發(fā)展，通過花藥和花粉培養(yǎng)誘導(dǎo)形成單倍體植物，目前在世界范圍內(nèi)已得到普及，已從170多種植物成功地誘導(dǎo)形成花粉起源植株或愈傷組織，以茄科、十字花科蔬菜作物研究居多。在曼陀羅、番茄、麝香百合、銀杏、煙草、矮牽牛等植物上都較早誘導(dǎo)成功單倍體植物?；ㄋ幒突ǚ叟囵B(yǎng)技術(shù)1. 花藥培養(yǎng)技術(shù)流程圖切下花蕾消毒10分鐘沖洗兩次花藥接種培養(yǎng)愈傷組織或胚狀體再生培養(yǎng)完整植株

花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù)花粉培養(yǎng)的花粉分離和培養(yǎng)方法機(jī)械分離培養(yǎng)法（包括液體培養(yǎng)基培養(yǎng)法和固體培養(yǎng)基培養(yǎng)法）；散落花粉（shedpollen）培養(yǎng)法?；ㄋ幣囵B(yǎng)和花粉培養(yǎng)之比較統(tǒng)計(jì)表明，通過花藥培養(yǎng)獲得單倍體的植物種類或品種較多；設(shè)備上要求簡單?；ǚ叟囵B(yǎng)有花藥培養(yǎng)不能比擬的優(yōu)點(diǎn)——完全排除了花藥組織的干擾，避免花粉與花藥組織的體細(xì)胞形成分裂和增殖的競爭，更有利于花粉植株的形成，所誘導(dǎo)形成的胚狀體、愈傷組織及植株均來自花粉，可省略對其鑒定的程序；在誘導(dǎo)形成單倍體的同時(shí)，若結(jié)合突變體篩選和進(jìn)行基因操作研究時(shí)，花粉培養(yǎng)更具優(yōu)勢。花藥培養(yǎng)技術(shù)1964年Guha&Maheshwari南洋金花花藥培養(yǎng)發(fā)育成胚；1967年Bourgin&Nitsch花藥培養(yǎng)獲得煙草植株；花藥培養(yǎng)方法：

接種了花藥的培養(yǎng)基一般在24-27OC，光照為2000lx，每天14小時(shí)培養(yǎng)。大約經(jīng)過20-30天，即可發(fā)現(xiàn)花藥開裂，長出愈傷組織或釋放出胚狀體。將愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，便可以進(jìn)一步分化再生出完整植株來?；ㄋ幉牧系倪x取

選材關(guān)鍵在于選取花粉處于合適發(fā)育期的花藥，離體培養(yǎng)后才能啟動花粉發(fā)育。實(shí)踐表明，從減數(shù)分裂期至雙核期的花藥，均有可能誘導(dǎo)離體孤雌發(fā)育。大多數(shù)園藝植物的花藥培養(yǎng)，成功率最高的時(shí)期為單核期，或單核中晚期?；ㄋ幣囵B(yǎng)技術(shù)步驟選幼年樹花蕾取下花蕾3-5度低溫冷處理3-10天取花藥鏡檢消毒接種培養(yǎng)再生花粉培養(yǎng)

50年代開始裸子植物花粉培養(yǎng)，獲得愈傷組織；

50、60年代被子植物花粉培養(yǎng)失??；

1974年Nitsch等次曼陀羅和煙草花粉獲得植株花粉培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)從少量花粉獲得大量花粉植株；避免花藥壁產(chǎn)生的體細(xì)胞愈傷組織干擾，直接觀察小孢子發(fā)育過程；花粉培養(yǎng)技術(shù)步驟藥壁向花粉提供營養(yǎng)物質(zhì)；通過藥壁吸收、貯存和轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中的外源物質(zhì)選幼年樹花蕾取下花蕾（鏡檢）預(yù)培養(yǎng)數(shù)天取花藥接種分離花粉低溫預(yù)處理消毒過濾離心再生影響花藥（粉）培養(yǎng)的因素供體基因型差異和發(fā)育差異

甜椒、天竺葵旺盛植株，早期花蕾花藥（花粉）的生理狀態(tài)花粉發(fā)育期四分體期、小孢子早期、中期和晚期（單核靠邊期）、有絲分裂期和雙核花粉期利用花粉和花藥培養(yǎng)于育種時(shí)，需足量供選擇單倍體植株。故如何提高誘導(dǎo)形成率十分重要。培養(yǎng)條件很關(guān)鍵。培養(yǎng)前低溫預(yù)處理培養(yǎng)基與培養(yǎng)方式的影響花藥、花粉培養(yǎng)前和培養(yǎng)初期的短期高溫、低溫、離心、減壓等。3-5C3-10天，提高小孢子反應(yīng)能力：曼陀羅、天仙子、柑桔花藥培養(yǎng)采用最多的培養(yǎng)基為MS。我國科學(xué)工作者研制的N6和馬鈴薯培養(yǎng)基；液體懸浮培養(yǎng)比固體培養(yǎng)基好；細(xì)胞分裂素有利于花粉胚形成；早期要求高蔗糖濃度：5-10%再生植株倍性和單倍體植株的保存及其加倍

在通過花藥培養(yǎng)獲得的再生植株中，除單倍體植株外，非單倍體出現(xiàn)的頻率與植物種類、再生途徑以及培養(yǎng)基的成分有關(guān)。一般來說，在通過胚狀體途徑獲得的再生植株中，其單倍體植株占有率較高。但種類不同也存在差異。例如從煙草花藥再生植株幾乎全部是單倍體植株，而在大白菜和油菜上，單倍體植株則分別占74%和22%。在經(jīng)過愈傷組織、器官分化途徑所獲得的再生植株中，倍性變化更為常見。如在水稻的花藥培養(yǎng)中，再生植株的倍性變化為x~5x。1.再生植株的倍性隨著培養(yǎng)基中植物激素濃度的增加也會降低從中再生植株的單倍體占有率。為什么有此倍性變化？單倍體植株當(dāng)然來自花粉。二倍體或多倍體植株則較復(fù)雜，可能是花粉的自然加倍，可能來自花藥組織的體細(xì)胞及其變異。鑒定方法：觀察后代遺傳性狀是否分離；同工酶分析；分子標(biāo)記技術(shù)等。花粉培養(yǎng)再生的植株倍性也有變化，但由于操作上完全排除了體細(xì)胞的干擾，形成二倍體或多倍體均來自花粉的自然加倍。所以，可直接用于育種實(shí)際。2.單倍體植株的保存和加倍單倍體植株不能正常結(jié)實(shí)，為了保持所獲得的單倍體材料，常用的方法是將無菌苗的莖尖培養(yǎng)在無激素或低濃度激素的培養(yǎng)基上并定期轉(zhuǎn)移。然而，單倍體非最終育種目標(biāo)，需要染色體加倍。方法有：A.單倍體植株組織培養(yǎng)再生切取單倍體植株的莖、葉等組織進(jìn)行培養(yǎng)，可獲加倍植株。B.人工處理誘導(dǎo)加倍常用秋水仙素處理，洗靜后轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)基中誘導(dǎo)植株再生。具體方法有——培養(yǎng)細(xì)胞的處理；試管小苗的處理；頂芽、腋芽處理；花軸處理等?！?組織和器官培養(yǎng)組織和器官培養(yǎng)是植物離體培養(yǎng)中研究最早和比較廣泛的。1904年就有十字花科的蘿卜、辣根的胚培養(yǎng)苗問世。莖尖培養(yǎng)近年發(fā)展快，觀賞植物如蘭花、非洲菊和經(jīng)濟(jì)作物如甘蔗采用組織培養(yǎng)進(jìn)行生產(chǎn)性的大量繁殖。果樹上利用莖尖和腋芽培養(yǎng)進(jìn)行砧木的快速繁殖，如蘋果矮化砧的1莖尖，8月可繁殖60000株。石刁柏、花椰菜、木立花椰菜等快繁，比傳統(tǒng)方法大大提高繁殖系數(shù)。自交不親和系也可通過組織培養(yǎng)方式大量繁殖，可免蕾期授粉之人工和防止自交衰退。無性繁殖作物的“無病苗”生產(chǎn)，據(jù)此取得重大進(jìn)展。馬鈴薯、芋、大蒜、姜、柑橘等莖尖脫毒。組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行種質(zhì)資源的保存可節(jié)省空間，方法簡便，繁殖潛力大，避免田間種植的天然雜交，結(jié)合低溫和超低溫的冷凍貯藏，對于保存遺傳資源和運(yùn)輸、交換都很方便。組織培養(yǎng)技術(shù)的主要階段組織和器官培養(yǎng)技術(shù)包括實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)、建造和設(shè)備；培養(yǎng)基的配制；表面滅菌和接種；試管苗出瓶移栽及后期管理。整個(gè)過程分三個(gè)階段：1.無菌培養(yǎng)的建立主要考慮選擇外植體、培養(yǎng)基和環(huán)境條件的性質(zhì)。2.培養(yǎng)再生植株利用誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織和利用莖尖培養(yǎng)誘生不定新梢等途徑。3.準(zhǔn)備將再生植株移栽入土包括新梢插條的生根、植株的鍛煉和使植株由異樣狀態(tài)變?yōu)樽责B(yǎng)狀態(tài)。是指植物某一器官的全部或部分或器官原基的培養(yǎng)，包括莖段、莖尖、球莖、葉片、子葉、花序、花瓣、子房、花藥、花托、果實(shí)、種子等。此處指形成層組織、分生組織、表皮組織、薄壁組織和各種器官組織以及愈傷組織的培養(yǎng)。器官培養(yǎng)（Organculture）組織培養(yǎng)（Tissueculture）莖尖培養(yǎng)1、類型小莖尖：大莖尖：材料體積小，不帶葉原基的培養(yǎng)難，成苗所需時(shí)間長，體積大的則易于成功。2、作用無性系快速繁殖；培養(yǎng)無病毒苗，品種改良；理論基礎(chǔ)研究10-100m的莖尖分生組織（脫毒）幾十mm莖尖或更大的芽（快繁）3、建立無菌材料及培養(yǎng)健康植株上選健壯的枝梢去葉片用自來水沖洗

再生培養(yǎng)MS培養(yǎng)基75%酒精1分鐘次氯酸鈉5-10分鐘0.1%升汞4、莖尖培養(yǎng)的發(fā)育方向腋芽萌發(fā)脫分化后產(chǎn)生胚狀體脫分化后直接產(chǎn)生不定器官脫分化后形成愈傷組織離體繁殖建立懸浮系或分化胚狀體及不定芽影響發(fā)育方向的因素外植體大小培養(yǎng)條件培養(yǎng)基生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度微形外植體或分生組織易產(chǎn)生愈傷組織細(xì)胞分裂素和生長素的配比是關(guān)鍵技術(shù)上的問題愈傷組織往往經(jīng)過多次繼代以后，其分化器官的能力日衰,甚至喪失；如何使愈傷組織分化的植株保持遺傳性的穩(wěn)定性。污染、褐變與玻璃化真菌污染長孢子真菌污染長孢子污染的情況細(xì)菌污染長菌落細(xì)菌污染長菌落初代培養(yǎng)外植體的褐變

外植體褐變是指在接種后，其表面開始褐變，有時(shí)甚至?xí)拐麄€(gè)培養(yǎng)基褐變的現(xiàn)象。它的出現(xiàn)是由于植物組織中的多酚氧化酶被激活，而使細(xì)胞的代謝發(fā)生變化所致。在褐變過程中，會產(chǎn)生醌類物質(zhì)，它們多呈棕褐色，當(dāng)擴(kuò)散到培養(yǎng)基后，就會抑制其他酶的活性，從而影響所接種外植體的培養(yǎng)。褐化褐變的主要原因①植物品種在不同品種間的褐變現(xiàn)象不同。多酚氧化酶活性上的差異。因此，在培養(yǎng)過程中應(yīng)該有所選擇，對不同的品種分別進(jìn)行處理。②生理狀態(tài)由于外植體的生理狀態(tài)不同，所以在接種后褐變程度也有所不同。一般幼齡期的植物材料褐變程度較淺，成年的植株采收的外植體，由于含醌類物質(zhì)較多，因此褐變較為嚴(yán)重。幼嫩的組織在接種后褐變程度并不明顯，老熟的組織較為嚴(yán)重。③培養(yǎng)基成分濃度過高的無機(jī)鹽會使某些觀賞植物的褐變程度增加，此外，細(xì)胞分裂素的水平過高也會刺激某些外植體的多酚氧化酶的活性，從而使褐變現(xiàn)象加深。④培養(yǎng)條件不當(dāng)如果光照過強(qiáng)、溫度過高、培養(yǎng)時(shí)間過長等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速被培養(yǎng)的外植體的褐變程度。減輕褐變現(xiàn)象發(fā)生的方法①選擇合適的外植體一般來說，最好選擇生長處于旺盛的外植體，這樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。②合適的培養(yǎng)條件無機(jī)鹽成分、植物生長物質(zhì)水平、適宜溫度、及時(shí)繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。③使用抗氧化劑在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸、PVP等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的褐變現(xiàn)象。另外，使用0.1%-0.5%的活性炭對防止褐變也有較為明顯的效果。④連續(xù)轉(zhuǎn)移對容易褐變的材料可間隔12~24h的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過連續(xù)處理7-l0d后，褐變現(xiàn)象便會得到控制或大為減輕。繼代培養(yǎng)時(shí)材料的玻璃化實(shí)踐表明，當(dāng)植物材料不斷地進(jìn)行離體繁殖時(shí)，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會呈半透明水漬狀，這種現(xiàn)象通常稱為玻璃化。它的出現(xiàn)會使試管苗生長緩慢、繁殖系數(shù)有所下降。玻璃化為試管苗的生理失調(diào)癥。因?yàn)槌霈F(xiàn)玻璃化的嫩莖不宜誘導(dǎo)生根，因此，使繁殖系數(shù)大為降低。在不同的種類、品種間，試管苗的玻璃化程度也有所差異。當(dāng)培養(yǎng)基上細(xì)胞分裂素水平較高時(shí)，也容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。在培養(yǎng)基中添加少量聚乙烯醇、脫落酸等物質(zhì)，能夠在一定程度上減輕玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生.

呈現(xiàn)玻璃化的試管苗，其莖、葉表面無蠟質(zhì)，體內(nèi)的極性化合物水平較高，細(xì)胞持水力差，植株蒸騰作用強(qiáng)，無法進(jìn)行正常移栽。這種情況主要是由于培養(yǎng)容器中空氣濕度過高，透氣性較差造成的，其具體解決的方法為：增加培養(yǎng)基中的溶質(zhì)水平，以降低培養(yǎng)基的水勢；減少培養(yǎng)基中含氮化合物的用量；增加光照；增加容器通風(fēng)，最好進(jìn)行CO2施肥，這對減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象有明顯的作用；降低培養(yǎng)溫度，進(jìn)行變溫培養(yǎng)，有助于減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生；降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素含量，可以考慮加入適量脫落酸。§5體細(xì)胞雜交概念

體細(xì)胞雜交是通過化學(xué)和物理方法使不同植物的原生質(zhì)