質(zhì)粒提取方法課件

質(zhì)粒三種提取方法的比較基因工程原理與技術實驗部分：質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子,大小從1-200kb不等,為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子,并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細菌、放線菌和真菌細胞中，它具有自主復制和轉(zhuǎn)錄能力,能在子代細胞中保持恒定的拷貝數(shù),并表達所攜帶的遺傳信息。

在細菌細胞內(nèi),共價閉環(huán)質(zhì)粒以超螺旋形式存在。在提取質(zhì)粒過程中，除了超螺旋DNA外，還會產(chǎn)生其它形式的質(zhì)粒DNA。如果質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂,分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力,形成松馳型的環(huán)狀分子,稱開環(huán)DNA(OpencircularDNA,簡稱ocDNA)；如果質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂,則形成線狀DNA(LinearDNA)。當提取的質(zhì)粒DNA電泳時,同一質(zhì)粒DNA其超螺旋形式的泳動速度要比開環(huán)和線狀分子的泳動速度快。實驗目的：1、學會小量制備質(zhì)粒DNA的堿裂解方法、煮沸法、小量一步提取法這三種質(zhì)粒DNA的提取方法。2、三種方法的比較，能夠根據(jù)不同的實驗目的選擇合適的方法。閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會分離，復性快；DNA雙鏈變性DNA單鏈復性強堿中性染色體線性DNA和或有缺口的質(zhì)粒DNA變性后雙鏈分離，難以復性而形成纏繞的結(jié)構，與蛋白質(zhì)—SDS復合物結(jié)合在一起，在離心的時候沉淀下去。變性煮沸法：將細菌懸浮于含TritonX-100和能消化細胞壁的溶菌酶緩沖液中，然后加熱到100℃使其裂解。加熱除了破壞細胞壁外，還有助于解開DNA鏈的堿基配對，并使蛋白質(zhì)和染色體DNA變性。但是，閉環(huán)質(zhì)粒DNA彼此不會分離，這是因為他們的磷酸二酯骨架具有互相纏繞的拓撲結(jié)構，當溫度下降后，閉環(huán)DNA的堿基又各自就位，形成超螺旋分子，離心除去變性的染色體核蛋白質(zhì)，就可從上清中回收質(zhì)粒DNA從細菌中分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個基本步驟:1、培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增

2、收集和裂解細胞

3、分離和純化質(zhì)粒DNA材料、設備及試劑一、材料

含卡那酶素的E.coliDH5α，1.5ml塑料離心管(又稱eppendorf管),離心管架。

二、設備

微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，臺式高速離心機，恒溫振蕩搖床，高壓蒸汽消毒器(滅菌鍋)，渦旋振蕩器，電泳儀，瓊脂糖平板電泳裝置和恒溫水浴鍋等。三、試劑

1、LB液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani)：稱取蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeastextract)5g，NaCl10g，溶于800ml去離子水中，用NaOH調(diào)pH至7.5,加去離子水至總體積1升,高壓下蒸氣滅菌20分鐘。

2、LB固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中每升加12g瓊脂粉,高壓滅菌。

3、氨芐青霉素(Ampicillin,Amp)母液：配成50mg/ml水溶液,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4、溶菌酶溶液：用10mmol/LTris·Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分裝成小份(如1.5ml)保存于-20℃,每一小份一經(jīng)使用后便予丟棄。

5、3mol/lNaAc(pH5.2)：50ml水中溶解40.81gNaAc·3H2O,用冰醋酸調(diào)pH至5.2,加水定容至100ml,分裝后高壓滅菌,儲存于4℃冰箱。

6、溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高壓滅菌15分鐘,儲存于4℃冰箱。7、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH(臨用前用5-10mol/LNaOH母液稀釋)，1％SDS。

8、溶液Ⅲ：5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml,并高壓滅菌。溶液終濃度為:K+3mol/L,Acˉ5mol/L。操作步驟

一、細菌的培養(yǎng)和收集

將含有質(zhì)粒菌種接種在LB固體培養(yǎng)基(含50μg/mlAmp)中,37℃培養(yǎng)12-24小時。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5mlLB液體培養(yǎng)基(含50μg/mlKan)中,37℃振蕩培養(yǎng)約12小時至對數(shù)生長后期。

二、質(zhì)粒DNA少量快速提取

質(zhì)粒DNA小量提取法對于從大量轉(zhuǎn)化子中制備少量部分純化的質(zhì)粒DNA十分有用。這些方法共同特點是簡便、快速，能同時處理大量試樣,所得DNA有一定純度,可滿足限制酶切割、電泳分析的需要。

（一）、煮沸法將振蕩過夜培養(yǎng)的細菌1.5ml

，于8000r/min離心1min，棄上清液。將沉淀回溶于350μLSTET(0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris·Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)，5%TritonX-100。)中。加入25μL溶菌酶(10mg/mL)，放入沸水中40s，立即于10000r/min離心10min。吸出上清移至另一個Eppendolf

管中或用已滅菌的牙簽小心地將沉淀去除，加入40μL2.5mol/LNaAc（PH5.2）和420μL冰凍的異丙醇，振蕩混勻，室溫放置5min。

12000g，離心5min，棄上清液，用70%乙醇洗滌兩次，然后將離心管倒扣在吸水紙上，使盡量干燥。用20μL無菌水溶解沉淀，于－20℃凍存試驗步驟：（二）、堿裂解法

1、取1.5ml培養(yǎng)液倒入1.5mleppendorf管中,4℃下10000rpm離心5min。

2、棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘,使液體流盡。

3、菌體沉淀重懸浮于150μl溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩),室溫下放置5-10分鐘。

4、加入新配制的溶液Ⅱ300μl,蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次,以混勻內(nèi)容物(千萬不要振蕩),冰浴5分鐘。

5、加入227μl預冷的溶液Ⅲ,蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩10秒,使沉淀混勻,冰浴中5-10分鐘,4℃下12000g離心5-10分鐘。

6、上清液移入干凈eppendorf管中,加入等體積的酚/氯仿(1:1),顛倒混勻,4℃下12000g離心5分鐘，重復一次。

7、將水相移入干凈eppendorf管中,加入0.6-1倍體積的異丙醇,顛倒混勻靜置10分鐘，然后12000g離心10分鐘。

8、棄上清,將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出,加入100ul70％乙醇洗沉淀兩次。

9、吸除上清液,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,室溫干燥。

10、將沉淀溶于20-50μl無菌水中，儲于-20℃冰箱中。

取0.5ml細菌過夜培養(yǎng)物，置1.5ml的Eppendolf管中加入0.5ml的氯仿：異戊醇，用振蕩器最大速度振蕩1min，充分混勻。12000g，離心5min，取上清移至另一個Eppendolf管中，加入500μl異丙醇混勻，立即12000g，