鎮(zhèn)痛藥理研究20101211課件

鎮(zhèn)痛藥理研究實驗方法疼痛的生理、病理和藥學當代疼痛學之所以能夠發(fā)展，最重要的是得益于外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能可塑性變化概念的引入，從分子到腦功能全面地揭示病理痛信息跨突觸、跨膜和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導機制奠定了理論基礎，為臨床尋找高效、低毒、全安的鎮(zhèn)痛藥提供了導向。鎮(zhèn)痛發(fā)展簡史回顧(一)中醫(yī)對痛的認識痛為臨床的常見癥狀，是疾病發(fā)展到一定時期的表現(xiàn)，又是人體神經(jīng)抗御外邪自護自調(diào)的一種反應，身體的某一部受損，最終表現(xiàn)疼痛。中醫(yī)理論認為,“不通則痛”和“不榮則痛”則是一切疼痛發(fā)生的病理基礎。不通則痛”具體的病因病機又可與下面因素有關。①寒邪凝滯，陽氣不達，氣血不暢，經(jīng)氣閉阻則可致疼痛的發(fā)生。

《內(nèi)經(jīng)》認為“寒邪入經(jīng)二稽遲，泣而不行，客于脈中則氣不通，故卒然而痛…脈寒則縮卷，縮卷則絀急，則外引小絡，故卒然而痛….”，疼痛或緩或急，常有冷感，痛有定處，得溫痛減，或喜按，遇寒加?、陴鲅獌?nèi)阻每致絡脈不通，不通則痛。津不生血反為滯更加阻滯氣運行與生成，形成腫脹而痛，氣血瘀滯，脈搏道失榮，真氣難通，瘀血阻礙滯，臟虛腹實，氣血運行失常其常規(guī)，久病入絡，血液污穢，成毒敗血，損傷脈絡而痛。痛如針刺，痛有定處，拒按，夜間痛甚。③氣機郁滯而致的疼痛。疼痛性質(zhì)多為脹痛，痛無定處，遇情志刺激加重。④熱毒內(nèi)蘊，腑氣不通，六腑以通為用，以降為順，如腑氣通降失常，梗阻不通則產(chǎn)生疼痛，痛勢較劇，呈熱痛，得冷稍減。⑤痰濁阻滯臟腑經(jīng)絡或結(jié)聚四肢百骸，經(jīng)氣不利而致的痛，疼痛多為鈍痛、隱痛、脹痛、木痛等。《靈樞·五癃津液別》：“陰陽不和，則使液溢而下流于陰，髓液皆減而下，下過度則虛，虛故腰背痛而脛酸?！泵鞔_提出了虛可致痛的觀點?！缎l(wèi)生寶鑒》:“清陽之氣愈虧損，不能上榮….所以頭苦痛”?！顿|(zhì)疑錄》：“肝血不足則為筋攣….為目眩，為頭痛，為脅肋痛。為少腹痛，為疝痛諸證，凡此皆肝血不榮也”。一般而言，虛證常有寒化或熱化之趨勢，故除疼痛外，尚可兼有虛熱或虛寒的相應征象?！安粯s則痛”表現(xiàn)為隱隱作痛，綿綿不休，疲勞即劇，時作時止。中醫(yī)理論認為，心主神明。疼痛是一種感覺,一切疼痛又必須在“神”的參與下才能產(chǎn)生。《素問·靈臺秘典論》云：“心者，君主之官，神明出焉?！薄鹅`樞·本神》云：“所以任物者謂之心”?！秲?nèi)經(jīng)》強調(diào)：“刺肉無傷脈，脈傷則內(nèi)動心”。疼痛的定義國際疼痛學會（InternationalAssociationfortheStudyofPain,IASP）“疼痛是與實際或潛在的組織損傷相關聯(lián)的不愉快的感覺和情感體驗，或用組織損傷這類詞匯所描述的主訴癥狀”,“無交流能力決不能否定一個個體正有痛體驗和需要適當緩解疼痛治療的可能性”。疼痛應包括“痛知覺”（painperception），和“難受的”(unpleasant)的情感反應。包含機體內(nèi)在的主觀的、個人的、多維的體驗,它涉及心理、行為、情感、認知和感覺等內(nèi)容。鎮(zhèn)痛的目的意義嚴重的疼痛能引起休克或引起人體各個系統(tǒng)功能失調(diào)、免疫功能低下而誘發(fā)各種并發(fā)癥,甚者引發(fā)終身致痛性殘疾或危及病人的生命。及時施用鎮(zhèn)痛法能有效地緩解、減輕、控制和治療疼痛,預防劇烈疼痛誘發(fā)機體休克等癥狀的發(fā)生所造成對機體的嚴重傷害,有效地保護機體、促使疾病的康復。與疼痛相關的術語1.感覺閾受試者首次感覺到有刺感、溫熱感的最小刺激量。2.痛閾（painthreshold）受試者首次能夠識別引起痛覺的最小刺激量。在人的心理物理或動物實驗研究中，為了檢測痛閾或傷害性反應閾值，以能識別50%的刺激為痛刺激的強度定為閾值或?qū)⒛芤饌π苑磻?0%的刺激強度定為傷害性反應閾值。3.痛耐受水平（paintolerancelevel）是指受試者能夠忍受痛的最高水平，與痛閾一樣，也可用刺激強度測量，但不代表刺激強度。4.鎮(zhèn)痛或無痛（analgesia）是指在機體正?；虿±頎顩r下，痛刺激不能夠引起痛及痛反應。5.麻醉性鎮(zhèn)痛藥指藥物通過阻斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)痛覺沖動的突觸傳遞鎮(zhèn)痛的鎮(zhèn)痛藥。6.解熱鎮(zhèn)痛藥:指藥物通過阻斷外周痛覺感受器產(chǎn)生痛覺沖動而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的藥物。7.內(nèi)臟痛

(visceralpain)是由內(nèi)臟器官障礙所引發(fā)的,它包括由于阻塞或腫瘤所致的擴張、缺血、炎癥及腸系膜的牽拉等,能引起聯(lián)合癥狀,如發(fā)熱、惡心、不適和疼痛。內(nèi)臟痛覺是因感覺傳入神經(jīng)刺激內(nèi)臟器官活動的結(jié)果。臨床上極為普遍的癥狀，常伴有情緒反應和防御反應。10.纖維肌痛(FM)指非骨關節(jié)的廣泛平滑肌痛，并有觸痛點。美國風濕學會擬訂的診斷要點為：身體兩側(cè)廣泛痛(腰或腰以上的中軸線骨骼肌痛)超過3個月，T雙側(cè)觸痛，可能伴有頭痛、抑郁、焦慮、刺激性排便、自主神經(jīng)功能紊亂、神經(jīng)內(nèi)分泌改變等。11.復合性局部疼痛癥候群(CRPS型)，舊稱反射性交感神經(jīng)營養(yǎng)不良實為創(chuàng)傷后疼痛癥候群，表現(xiàn)為持續(xù)痛，有時有刺蜇痛,亦有書將其分為：炎癥性疼痛、神經(jīng)性疼痛、血源性疼痛、代謝性疼痛、免疫源性疼痛、心理性疼痛。其中炎癥性疼痛是慢性痛中最常見的原因之一，可表現(xiàn)為長期的酸痛，隱痛或定期及不定期的發(fā)作痛，有時可有明確的定位疼痛，有時則缺乏。12.炎癥炎癥是“各種內(nèi)源性、外源性刺激引起細胞損傷,同時引起伴有血管反應的結(jié)締組織的復合性反應”。依據(jù)炎癥持續(xù)時間,分為急性炎癥和慢性炎癥。前者通常病程為數(shù)天，以滲出液反應（蛋白成分多的細胞外液浸潤）和中性粒細胞反應主。后者的細胞成分以淋巴細胞和巨噬細胞為主，伴有組織壞死或組織修復環(huán)節(jié)之一的纖維化反應,病程趨亍復雜。其主要是以“病情經(jīng)過”來定義,疾病表現(xiàn)趨于多樣化。13.炎癥疼痛:組織炎癥或造型引起的炎癥模型均可引發(fā)痛閾敏化,產(chǎn)生疼痛,引起炎性疼痛。與疼痛有著密切相關,炎性疼痛,是由于炎癥引起組織腫脹、炎性滲出物壓迫神經(jīng)纖維末梢和強致痛性的致炎性介質(zhì)釋放直接作用于神經(jīng)末梢。如緩激肽、5-HT、前列腺素等能敏化傷害性感受器而誘發(fā)痛過敏(1),大鼠后肢足跖中部皮下注射角叉菜膠造成炎癥痛過敏(2),鏈脲佐菌素誘發(fā)大鼠糖尿病性神經(jīng)痛模型,其行為傷害性痛閾值明顯降低,表明糖尿病大鼠處于痛過敏狀態(tài)。14.痛敏(或痛覺過敏)hyperalgesia(或hyperesthesia）是指在組織或神經(jīng)損傷后，正常情況下,一定閾上痛刺激強度在損傷部位或損傷以外部位引起更強的疼痛?；?qū)π源碳ぎa(chǎn)生過強的疼痛反應。痛敏分為原發(fā)性痛敏（primaryhyperalgesia）和繼發(fā)性痛敏（secondaryhyperalgesia）痛敏只是感覺強度上的量變，但無感覺模式上的質(zhì)變。痛敏可能是外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)或功能改變的結(jié)果。16.中樞性疼痛(centralpain,CP)是指由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)本身傷病所造成的自發(fā)痛和對于外加刺激的過度疼痛反應,包括一種不愉快的觸物感痛(dysaesthesia)。17.自發(fā)痛(spontancouspain)指在沒有可見的刺激條件下產(chǎn)生的痛覺。18.神經(jīng)痛（neuralgia）是指疼痛沿著單根或多根外周神經(jīng)分布或放散。而神經(jīng)痛的使用較廣泛。19.神經(jīng)痛常由創(chuàng)傷或疾病所致的神經(jīng)根、神經(jīng)節(jié)、祌經(jīng)叢、祌經(jīng)干或其分支的原發(fā)或繼發(fā)性損害引起的異常疼痛。多見于頸肩腰腿痛等病證。是一種臨床常見的慢性痛?；蚴侵柑弁囱刂鴨胃蚨喔庵苌窠?jīng)分布或放散。神經(jīng)痛的使用較廣泛。20.神經(jīng)炎（neuritis）是指外周單根或多根神經(jīng)炎癥。只有在確定炎癥時才使用神經(jīng)炎。是指疼痛沿著單根或多根外周神經(jīng)分布或放散；只有在確定炎癥時才使用神經(jīng)炎。而神經(jīng)痛的使用較廣泛。21.神經(jīng)源性痛（neurogenicpain）是指由中樞或外周神經(jīng)原發(fā)性損傷、功能障礙或一過性激惹而引起的疼痛。22.傷害性痛（nociceptivepain）是在機體組織損傷或向機體施加具有造成組織損傷潛在性的傷害性刺激時所發(fā)生的一種疼痛。有生理性傷害性疼痛（physiologicalpain）、非生理性或稱病理性疼痛（pathologicalpain）。分為軀體性疼痛（somaticpain）和內(nèi)臟性疼痛（visceralpain）。軀體性疼痛有皮膚、黏膜部位的表淺痛（superficialpain）和骨骼肌、骨骼及關節(jié)等部位的深部痛（deeppain）。24.精神源性痛（painofpsychologicalorigin）是在機體無任何病理性異常時所表現(xiàn)的一種疼痛。它包括由精神妄想（delusion）或幻想（hallucination）、癔病（hysteria）、轉(zhuǎn)換（conversion，指由情緒轉(zhuǎn)換為軀體癥狀的過程）、疑病癥（hypochondriasis）或抑郁癥（depression）等精神性疾患所引起的疼痛。25.周圍神經(jīng)病理性疼痛(多發(fā)性神經(jīng)病痛)因小神經(jīng)纖維受累所致，見于糖尿病、血管炎、AIDS、尿毒癥、毒物和藥物中毒，以及淀粉樣變性。26.交感祌經(jīng)依賴性疼痛(SMP)和交感祌經(jīng)非依賴性疼痛(SIP)前者指如果交感神經(jīng)阻斷后疼痛減輕,而后者指若始疼痛不減輕。27.脊髓刺激(spinalcordstimulation,SCS)指通過放置硬膜外隙電極,提供電刺激作用于脊髓后根。鎮(zhèn)痛藥常用給藥途徑應采用擬推薦臨床應用的給藥途徑。給藥途徑一般采用二種,其中一種應與臨床相同。如確有困難可采用其他給藥途徑,但應說明困難的原和選用其他給藥途徑的理由。溶解性好的藥物,可注射給藥,但要排除非特異性反應。粗制劑或溶解性差的藥物,可使用單一的給藥途徑。注射給藥或離體實驗時應考慮到樣品中雜質(zhì)、不溶解始質(zhì)、無機離子及PH濃度等因素對實驗的干擾。(二)大鼠側(cè)腦室注射給藥大鼠乙醚麻醉后,固定于腦立體定位儀上。剪去頭部毛,切開皮膚,暴露顱骨。剝離附著在顱骨的組織,用脫脂酒精棉球擦干顱骨,在矢狀縫外2mm,冠狀縫后2mm兩平行線交點,用鉆頭打一個小孔,用固定于立體定位儀的微量注射器垂直植入孔內(nèi)4mm,每次注入不超過20ul/只,注射畢,停針20秒出針,用速凝牙托粉封口,15分進行測痛。多次給藥,可植入導管,用螺絲或速凝牙托粉澆注固定,術后4～5天進行實驗。取合格大鼠,隨機分組。(三)家兔側(cè)腦室注射給藥成年家兔,雌雄不拘。剪去手術野毛,碘酒、酒精消毒,于局部麻醉下,在冠狀縫離中線4mm處鉆孔,然后將一特制的家兔腦室套管(塑料)插入腦室,使套管的尖端位于側(cè)腦室,并固定于顱骨上。(四)腦內(nèi)神經(jīng)核團給藥(五)鞘內(nèi)注射給藥(六)蛛網(wǎng)膜下腔注射給藥(七)經(jīng)皮給藥(八)經(jīng)粘膜給藥一、小鼠扭體試驗(writhingtest)【原理】把一定容量和濃度的化學刺激物質(zhì)(醋酸溶液等)或鹽水注入小鼠腹腔內(nèi),由于刺激臟層和壁層腹膜,引起深的、大面積而持久的疼痛刺激，引起深部廣泛的腹膜炎造成腹壁肌肉緊張、炎性疼痛,致使小鼠出現(xiàn)典型的腹部肌肉收縮，同時伴有一側(cè)后肢外伸的軀體伸縮行為。即腹部內(nèi)凹、軀干與后肢伸張、臂部高起,身體扭曲等特征性的行為反應,稱之為扭體反應(writhingresponse)(圖20-2-1)。潛伏期為3～5分鐘,以注射醋酸溶液后15分鐘內(nèi)出現(xiàn)扭體反應頻率為高。

醋酸誘發(fā)廣泛的腹膜炎造成腹壁肌肉緊張有軀體痛的參與而導致的。醋酸所引起的傷害性反應,可能由于腹腔PH值降低而直接刺激傷害性傳入神經(jīng)纖維和促進炎癥遞質(zhì)合成引起的炎癥和疼痛,共同起作用。隨機分為對照組、廣西血竭組、嗎啡組。每組20只。對照組、廣西血竭組灌胃給藥、每天一次,連讀5天,于末次給藥后60分,嗎啡組一次腹腔注射30分鐘后，腹腔注射1％醋酸溶液10ml／kg后,觀察記錄注射醋酸溶液后20分內(nèi)出現(xiàn)扭體反應鼠數(shù)和扭體次數(shù)作為疼痛反應指標。并計算其均值、抑制扭體反應次數(shù)百分率(抑制%)

對照組扭體次數(shù)均值—藥物組扭體次數(shù)均值抑制%=------------------------------------------X100%對照組扭體次數(shù)均值

廣西血竭對小鼠醋酸扭體反應的影響

(x±s,n=20)組別劑量(g/kg)扭體動物數(shù)(%)扭體次數(shù)對照組20(100%)42.60±11.4廣西血竭組

14.420(100%)26.40±14.5*嗎啡組0.0053(15%)0.20±0.02**對照組

20(100%)39.10±12.8廣西血竭組7.220(100%)26.40±14.5*嗎啡組0.0053(15%)0.20±0.02**注意事項1.扭體試驗又稱為扭動試驗、腹部收縮試驗?？蓱枚喾N動物，以小鼠和大鼠最佳。2.己證明多種物質(zhì)腹腔注射可誘發(fā)小鼠扭體反應。但應用最普遍的是醋酸溶液3.Schmauss〔7〕提出了一個行為學評分標準，將扭體行為分為0～3四個等級,根據(jù)這個評分標準可以把行為學量化。因此，這種模型也成為評定其它模型的一個對照標準。4.腹腔注射生理鹽水可誘發(fā)小鼠(4%)、大鼠扭體(6%)反應,應注意。5.常用小鼠，亦用大鼠（費用高）小鼠扭體反應誘發(fā)劑種類誘發(fā)劑名稱濃度(%)用量(ml/只)醋酸溶液0.6～0.90.2(小鼠)0.5～2.5(大鼠)酒石酸銻鉀溶液0.050.2苯醌水溶液(飽和溶液)0.020.2緩激肽溶液0.001250.22-苯-1,4-苯甲酰苯醌(含有5%酒精水溶液)0.020.20.02%苯醌混懸于1%羧甲基纖維素溶液0.25PgE131.6ug烏頭堿、乙酰膽堿、高嶺土混懸液、酵母多糖溶液、五羥色胺、硫酸鎂等。5.醋酸濃度為1．1％時小鼠扭體最明顯，注射后3—5分鐘小鼠出現(xiàn)明顯的扭體反應。酸濃度為0．3％，不出現(xiàn)扭體反應，醋酸濃度為

1．9％時，小鼠活動減少。室溫在20～22℃扭體反應最典型,l6℃時小鼠扭體反應不穩(wěn)定，28℃時小鼠活動減少〔8〕。

6.誘發(fā)劑濃度及用量應通過預試驗確定。7.酒石酸銻鉀溶液務必于臨用時新配,放久效用減弱。8.對照組小鼠扭體反應次數(shù),一般在控制在25～30次為宜?！驹u價】1.小鼠扭體法是篩選鎮(zhèn)痛藥的常用方法之一,尢其是弱鎮(zhèn)痛藥的一種常規(guī)篩選試驗方法。適合于中樞和外周鎮(zhèn)痛藥的篩選研究,尤其用于外周鎮(zhèn)痛藥的評價。其試驗的作用強度和臨床鎮(zhèn)痛效果具有明顯的相關性。2.觀察記錄藥物抑制小鼠扭體鼠數(shù)或扭體次數(shù),以出現(xiàn)扭體鼠為陽性,不出現(xiàn)扭體鼠為陰性,計算其ED50,評價藥效作用強度。所反應藥效作用前者強,后者弱。3.己被許多學者所采用的一種操作簡單、敏感、方便、重復性好、經(jīng)濟實惠的實驗方法。4..扭體反應代表內(nèi)臟痛(緊張性病理性疼痛),亦是應用最為廣泛的內(nèi)臟痛模型之一。無刺激特異性。方法缺乏特異性,一些非鎮(zhèn)痛藥,如中樞抑制劑、阿托品、利多卡因等有抑制扭體反應,出現(xiàn)假陽性(應結(jié)合其他測痛方法),約有8％的動物不出現(xiàn)扭體反應，而且不能在同一個動物上觀察藥物的時效作用。家兔K

離子皮下透入致痛實驗(K+paintest)【原理】正常情況下，細胞膜內(nèi)外K+濃度相差極大。局部組織受損時，組織釋放的K+

為一種致痛物質(zhì)。當K+濃達到10～15mmol/L時即可致痛。由于輸入電流強度與K＋透入及其引起的疼痛反應呈正比，給藥后電流強度的變化直接反映受試藥物鎮(zhèn)痛作用強弱。當在一定強度直流電場作用下，飽和氯化鉀溶液可以經(jīng)不同部位皮膚透入動物體內(nèi)產(chǎn)生傷害性刺激，引起動物疼痛反應，以家兔縮腿，搖頭，掙扎、揚爪等反應作為痛閾指標,觀察受試藥物對家兔痛閾的影響。當給藥后,家兔上述反應消失或減弱。表明受試藥具有鎮(zhèn)痛效應。方法

選用體重1.5～2.0公斤家兔，雌雄不拘家兔置于固定器中。除去左耳尖部位毛。將浸泡飽和氯化鉀溶液的棉球置于耳尖部，把K＋-4型測痛儀的刺激電極置于棉球上并固定好，保持濕潤狀態(tài)。無關電極為針狀電極，插入后腿，并用生理鹽水濕潤紗布蓋上。以引起家兔搖頭或全身掙扎反應作為疼痛反應指標，記錄從通電開始至引起家兔痛反應的電流強度（mA數(shù)）作為痛閾值。給藥前測定痛閾二次，取其mA數(shù)均值作為基礎痛閾值。給藥后60分測痛，每10分鐘測痛一次，觀察2小時,計算給藥后痛閾值提高百分率，與對照比較,檢驗組間電流強度顯著性差異。必要時可測定其ED50值。大鼠法:測痛儀的輸出電極(正極)于尾部下1／3處用乳膠管固定,無關電極用鹽水紗布固定于尾根部，以甩尾(嘶叫、全身掙扎等)反應作為疼痛反應指標,記錄甩尾的電流強度(mA)作為嘶叫和運動痛閾，并計算出鎮(zhèn)痛指數(shù)。由于閾電流增加反映鎮(zhèn)痛藥效應強度和有效時程,與對照組比較,閾電流增長2倍以上可認為藥有鎮(zhèn)痛作用,或計算其ED50值。若痛閾測定用固定電流強度,記錄動物痛反應時間作為痛閾值,計算PMAP,以給藥后痛閾值超過基礎痛閾一倍為100%鎮(zhèn)痛。猴實驗以縮腿、掙扎為疼痛反應指標價昂貴,不宜用于藥物篩選【評價】本方法采用K+-4型測痛儀測痛,輸入電流強度與K＋透入及其引起的痛反應呈正比,閾電流增減反映藥物鎮(zhèn)痛作用強弱,并可以同時觀察其作用時程。操作方便，靈活、反應指標明確,直觀記錄，能準確測定痛閾值,結(jié)果重現(xiàn)性好,為常用測痛方法之一。廣泛用于研究鎮(zhèn)痛藥的效價強度和作用時程。為了進一步了解藥物作用方式并找到更適于人的治療量,在一種新化合物試用于臨床前還需要用猴進行實驗?！咀⒁馐马棥?.實驗必須在12hL/12hD光周期的恒溫(22～26oC)、恒濕、安靜的光控實驗室進行,實驗前7天將動物置于光控室飼養(yǎng)。2.每次實驗必須在同一時間進行。3.安放電極耳尖部位必須脫毛,電極必須固定牢，并經(jīng)常用生理鹽水保持濕潤狀態(tài)。4.輸入電壓必須穩(wěn)定。5.為了避免損傷，規(guī)定最強的電流為1．0mA為限。小鼠光輻射熱甩尾法

(tail-flicktest)【原理】小鼠光輻射熱甩尾法也叫光熱甩尾或光照甩尾。是將一束光照射到動物尾根1/3處,使鼠尾局部升溫,產(chǎn)生熱刺激,當其尾部受到傷害性刺激超過動物忍耐的痛閾時,動物出現(xiàn)明顯甩尾的躲避反應,是一種脊髓的屈曲反射。光輻射熱甩尾是急性傷害性知覺疼痛的測痛方法,反應體表痛,疼痛持續(xù)的時間長短不。以動物甩尾作為痛反應指標,記錄動物自光照射開始到甩尾反應的時間(潛伏期)作為疼痛閾值。根據(jù)動物痛閾值高低變化來判斷藥物的鎮(zhèn)痛效應。方法小鼠,雌雄兼用,體重18-22g。實驗前12小時禁食,不禁水。把小鼠裝入小鼠固定筒內(nèi)。尾部暴露于外，實驗前先用75%乙醇檫凈鼠尾，用黑墨汁涂于尾根部下1/3處作為光刺激點的標記。測痛時，使小鼠尾光刺激點與YLS-12A鼠尾光照測痛儀聚光燈燈孔重合,待動物安靜后進行測痛，以鼠尾受熱刺激出現(xiàn)甩尾作為疼痛反應指標。記錄小鼠從開始光照射到甩尾反應的潛伏期（TFL,s）作為痛閾值。預選基礎痛閾5～7秒小鼠供實驗用。取合格小鼠隨機分為對照組、OT-05B組(26μg、18μg/kg)、嗎啡組(陽性藥組,5mg/kg))。每組10只。各組給藥前連續(xù)測痛2次，取其均值作為給藥前基礎痛閾值。各組肌肉注射給藥后45分測痛,計算其均值及痛閾提高百分率,痛閾提高率%。給藥后TFL一基礎TFL痛閾提高率%=-------------------------------X100%

基礎TFL,與對照組比較,檢驗其組間顯著性差異。.對小鼠輻射熱甩尾痛閾值的影響組別劑量(X/kg)動物數(shù)藥前痛閾值(s)藥后痛閾值(s)痛閾提高%對照116.8±0.87.1±0.6OT-05B18μg127.3±0.97.9±1.48.2嗎啡5mg137.1±0.613.9±1.5**95.8對照147.0±0.67.2±0.8Te-05B26μg136.6±1.08.3±1.0*22.7【評價】1.熱刺激引起的疼痛與生長抑素有關。光輻射熱甩尾法試驗,是防御性的反射，主要在脊髓水平進行整合。是一種脊髓的屈曲反射,反應體表痛?？梢詼y定輕度麻醉的動物而不受動物運動協(xié)調(diào)性的影響。在實驗觀察中,動物的跑反應是大腦控制的復雜現(xiàn)象。甩尾法比熱板法具有優(yōu)越性。但必須引起注意,本法純粹是一種脊髓反射,骨骼肌松弛藥可能呈陽性結(jié)果。2.適用于篩選麻醉性鎮(zhèn)痛藥,但對弱鎮(zhèn)痛藥,如阿斯匹林則出現(xiàn)陰性結(jié)果。3.光輻射熱甩尾法試驗,終點指標直觀、明確,記錄潛伏期準確。設備簡單、操作方便,故常用。

4.甩尾反射法只能檢測簡單傷害性反射，而不能對動物意識性或目的性的反應進行客觀檢測。甩尾實驗最終的行為反應也較為復雜（如舔其后爪）。5.使用動物有小鼠、大鼠、,免或豚鼠。常用小鼠或大鼠,以甩尾潛伏期為痛反應指標。小鼠易得,經(jīng)濟、便于操作。大鼠每組不少于5只。免照射鼻部或嘴角,以引起甩頭潛伏期為痛反應指標,每次照射不超過30秒。當給藥后痛閾值提高大于基礎痛閾值的200%,停止照射,以200%作為最大值。豚鼠照射背部皮膚,以皮膚或肌肉抽搐顫動為痛反指標?！咀⒁馐马棥?/p>

1.試驗必須在標準等級實驗動物室進行,確保實驗環(huán)境條件的恒定性。確保實驗結(jié)果的的可靠性、重現(xiàn)性。2.實驗程序化,分組應注意體重、組間痛閾值的均勻性、試驗時間的一致性(避免時辰差異對實驗結(jié)果的影響)。3.控制刺激強度(光輻射熱),刺激強度應經(jīng)過預測,強度適當,用藥前的基礎痛閾值非常重要,刺激時間不宜大長,測定次數(shù)不宜大多,避免燙傷尾巴,影響實驗結(jié)果。4.為了確保光照射點的一致性,應用黑墨汁涂于尾端1/3處作為光刺激點的標記。同時增加吸熱度。測痛時，必須使小鼠光刺激點與光熱測痛儀聚光燈燈孔重合,并待動物安靜后進行。5.鼠尾表面積大,易散熱,尾溫度可能會影響實驗結(jié)果,室溫對甩尾潛伏期有明顯的影響,容易造成假陽性或假陰性,室溫一般為20～22oC。冷板誘發(fā)的痛覺超敏【原理】利用4℃金屬冷板作為刺激，誘發(fā)病理性痛模型動物出現(xiàn)以抬爪為主要表現(xiàn)的痛覺超敏（allodynia）現(xiàn)象，給藥后抬爪次數(shù)的變化可直接反映受試藥物鎮(zhèn)痛作用的強弱。.L5/L6脊神經(jīng)結(jié)扎模型小鼠的建立：選用8周齡雄性C57BL/6小鼠，在烏來糖（1200mg/kg,腹腔注射）的麻醉下手術分離并結(jié)扎小鼠右側(cè)L5和L6脊神經(jīng)制備坐骨神經(jīng)病理性痛模型小鼠。恢復兩周后進行模型篩選，凡是4℃金屬冷板刺激引起的小鼠5分鐘抬足次數(shù)大于10次可視為動物模型合格，可用于進一步的實驗實驗分組：將制備好的坐骨神經(jīng)痛模型小鼠隨機分為鹽水對照組，1.0×106U/kg干擾素-α注射組，2.5×106U/kg干擾素-α注射組和5.0×106U/kg干擾素-α注射組。模型小鼠疼痛行為學測定：將小鼠放在表面溫度為4±1℃的金屬冷板上，并罩在一個有機玻璃方盒或玻璃燒杯下，穩(wěn)定5分鐘，待小鼠探究活動基本消失后，利用手控計數(shù)器單盲法記錄小鼠損傷側(cè)腳掌5分鐘內(nèi)的抬足次數(shù)作為基礎痛閾，動物因活動或體位變化所引起的抬足不計入內(nèi)。然后將生理鹽水或干擾素-α一次腹腔注射給藥后15分鐘開始測痛，每隔15分鐘測痛一次，觀察90分鐘?！驹u價】本方法將實驗動物放在可以自由活動的環(huán)境下進行研究，最大限度地減少了人為因素給動物造成的壓力，且操作簡便，反應指標明確，可以準確地反映動物的痛覺行為。為常用測痛方法之一，廣泛用于研究痛覺行為異常、針刺鎮(zhèn)痛以及藥物對炎性痛和神經(jīng)病理性痛的鎮(zhèn)痛作用。該方法也可通過測量動物腳掌在空中的停留時間作為痛覺超敏指標，空中停留時間越短說明動物痛閾越高，空中停留時間越長說明動物痛閾越低。比較給藥前后動物腳掌在空中停留時間的變化可判定藥物的鎮(zhèn)痛作用。此外，也可利用0--4℃冷水代替冷板進行測定。在直徑20cm的玻璃容器中放入，深度約2cm左右的0--4℃冷水，將大鼠放入容器中，5分鐘后記錄大鼠在冷水中的抬足次數(shù)，記錄時間為5分鐘。【注意事項】①實驗必須在恒溫(22～26℃)、恒濕、安靜的隔音實驗室進行。②每次實驗在8:00-18:00進行，且最好保持在每天的同一時間段進行。③實驗前3天開始對測試動物進行冷板刺激，每天1次，每次10分鐘，使動物適應測試平臺并誘發(fā)穩(wěn)定的痛覺超敏。④由于4℃是一種非傷害性刺激，很少引起正常大鼠的抬足反應，因此該方法一般不以正常動物作為研究鎮(zhèn)痛藥物的受試動物。此外，一些神經(jīng)病理性痛動物模型，如坐骨神經(jīng)部分結(jié)扎模型等，往往不表現(xiàn)冷誘發(fā)的痛覺超敏現(xiàn)象，所以在利用這些模型研究鎮(zhèn)痛藥物的作用時也不宜采用此方法。丙酮誘發(fā)的痛覺超敏

【原理】利用丙酮揮發(fā)過程吸收熱量引起的冷刺激，誘發(fā)動物出現(xiàn)以縮足反應為主要表現(xiàn)的疼痛反應，給藥后縮足反應次數(shù)或潛伏期的變化可直接反映受試藥物鎮(zhèn)痛作用強弱。方法1．L5/L6脊神經(jīng)結(jié)扎模型大鼠的建立：依據(jù)Kim和Chung報道的方法。2．實驗分組：將制備好的L5/L6脊神經(jīng)結(jié)扎痛模型大鼠隨機分為鹽水對照組，2.5mg/kg嗎啡注射組，5.0mg/kg嗎啡注射組和10mg/kg嗎啡注射組。3．模型大鼠疼痛行為學測定：將模型大鼠放在金屬網(wǎng)架上，并罩在一個有機玻璃方盒內(nèi)，適應20分鐘后，利用連接有聚乙烯細管的注射器向模型大鼠腳跟滴一滴丙酮溶液（約20微升），觀察模型大鼠是否出現(xiàn)縮足反應。連續(xù)測量五次（時間間隔為2分鐘），如果模型大鼠出現(xiàn)縮足反應的次數(shù)超過三次，則認為該動物出現(xiàn)了明顯的冷誘發(fā)的痛覺超敏，以縮足反應的次數(shù)作為基礎閾值。然后將嗎啡一次皮下注射給藥后30分鐘開始測痛，每30分鐘測痛一次，觀察4小時?！驹u價】本方法采用丙酮誘發(fā)的縮足反應測痛，反應指標明確，可直觀記錄，為常用測痛方法之一，廣泛用于研究各種鎮(zhèn)痛藥物的效價強度和作用時程，以及藥物對炎性痛、癌性痛和神經(jīng)病理性痛的鎮(zhèn)痛作用研究。由于該方法每個時間點一般需多次重復測量，操作起來相對較復雜。此外，該方法也可通過記錄動物出現(xiàn)縮足反應的潛伏期作為痛覺超敏指標，測定5次取其平均值?！咀⒁馐马棥竣賹嶒瀾谑覝?20±1)℃、恒濕、安靜的隔音實驗室進行。②每次實驗在8:00-18:00進行，且最好保持在每天的同一時間段進行。③向動物腳掌滴加丙酮時注意不能觸到動物腳掌，以免人為引起縮足反應。④如果同時進行雙側(cè)腳掌的痛閾測定，應首先測定損傷對側(cè)腳掌。冷誘發(fā)的甩尾反射【原理】利用冷水浸尾誘發(fā)動物出現(xiàn)以甩尾反射為主要表現(xiàn)的疼痛反應，給藥后痛閾的變化可直接反映受試藥物鎮(zhèn)痛作用強弱。模型大鼠疼痛行為學測定首先將各組模型大鼠尾巴浸入0℃冰水中（5cm），記錄大鼠出現(xiàn)甩尾反射的潛伏期，重復測定3次（時間間隔為15秒鐘），取其平均值作為基礎痛閾。將藥物一次鞘內(nèi)注射給藥后55分鐘測定其甩尾反射的潛伏期?！驹u價】本方法采用0℃冰水誘發(fā)的甩尾反射進行測痛，操作簡便，無須特殊設備，反應指標明確，結(jié)果重現(xiàn)性好，為常用測痛方法之一，廣泛用于針刺鎮(zhèn)痛以及阿片類鎮(zhèn)痛藥物的效價強度和作用時程研究。【注意事項】①實驗必須在恒溫(22～26℃)、恒濕、安靜的隔音實驗室進行。②每次實驗在8:00-18:00進行，且最好保持在每天的同一時間段進行。③實驗前3天開始對測試動物進行冷水浸尾刺激，每天1次，使動物適應測試環(huán)境。④動物固定最好采用特制動物固定器，這樣可以保證每次測試過程動物的固定強度一致，減少因手抓力量不同所導致的結(jié)果差異。⑤每次實驗最少重復三次，取其平均值。電刺激小鼠甩尾法【原理】應用恒定的電壓或電流參數(shù)經(jīng)皮膚或電極刺激鼠尾出現(xiàn)疼痛反應,是由于興奮C纖維產(chǎn)生傳入放電引起的疼痛反應。以小鼠受刺激后出現(xiàn)甩尾、嘶叫作為痛反應指標,記錄其電壓或電流參數(shù)作為疼痛閾值,根據(jù)給藥前后痛閾的變化評價藥物效應。分別將小鼠放入小鼠固定器中，每次刺激前均用75％酒精擦洗鼠尾后，再用生理鹽水棉球涂擦小鼠尾根刺激區(qū)以增加皮膚導電性。實驗時將刺激電極(BL一410生物機能實驗系統(tǒng))放置于小鼠的尾根部，進行刺激：以程控方式輸出電刺激，刺激電壓根據(jù)預實驗從20V起，間隔2s以步幅

1v遞增刺激電壓強度，至小鼠開始出現(xiàn)掙扎、甩尾或抖尾、撕叫等痛反應，此時的電壓值為該鼠的痛閾值。先記錄給藥前小鼠出現(xiàn)痛反應的電壓作為基礎痛閾，隨后各組小鼠分別灌胃給藥1小時h后，將小鼠放入小鼠同定器中，按同法記錄小鼠出現(xiàn)痛反應的刺激閾值電壓,電刺激電壓為35V為限，電壓超過35V者均記為35V。按下式計算痛閾提高百分率。

藥后痛閾均值

-藥前痛閾均值痛閾提高百分率(%)=------------------------------×100%

藥前痛閾均值芎附正天軟膠囊對電刺激小鼠痛反應的電壓閾值的影響(x±s,n=10)

組別劑量(g/kg給藥前電壓(V)給藥后電壓(V)痛閾提高率(%)溶媒對照組PEG-400

24.7±1.9526.0±2.875.3阿斯林腸溶片0.1523.2±1.8727.2±2.3917.2芎附正天軟膠囊1.025.5±1.6529.1±3.41*14.1芎附正天軟膠囊0.525.8±2.6629.5±3.63*14.3芎附正天軟膠囊0.2524.9±1.6027.4±2.4110.0

[L1]【評價】電刺激鼠尾-嘶叫法是對組織施加短暫的可逃避的傷害性刺激，造成一種時相性急性疼痛，稱為急性實驗痛。反映體表痛。疼痛持續(xù)的時間也長短不一。一般認為動物嘶叫的整合中樞涉及高位腦干(如中腦)，能反應強、弱、鎮(zhèn)痛藥物的效應,但機體組織阻抗不易控制,敏感性不高,反應與動物的種族、品系、年齡、性別及基礎閾值等因素有關。由于本法有反射性因素,臨床無鎮(zhèn)痛作用的藥物可能呈陽性反應。不如機械刺激實驗方法嚴謹。設備簡單,痛反應指標明確,直觀記錄,方法可靠、重現(xiàn)性好?！咀⒁馐马棥?.電刺激鼠尾致痛法個體差異較大,應預選合格小鼠供實驗。于鼠尾刺激部位涂上薄層導電膠,以增加導電性能。2.電(方波)刺激是生理藥理最常用的實驗方法之一,而刺激儀功能的強弱、方波設定范圍的寬窄、波形的好壞、使用方便與否往往是實驗成敗的關鍵。3.刺激參數(shù)文獻報道不一。,必須經(jīng)預試驗確定最佳刺激參數(shù)。角叉菜膠誘發(fā)大鼠炎痛模型【原理】外周傷害性信息傳人可導致痛及痛過敏。大鼠右后掌足跖部皮下注射后角叉菜膠后，動物出現(xiàn)早期的痛反應和隨后的痛覺過敏,表現(xiàn)為局部迅速腫脹，動物出現(xiàn)反復抬腿，舔足、搖動后掌，后掌抬離盒底等自發(fā)痛行為。隨著炎癥介質(zhì)的釋放，加強炎癥,也增加對疼痛的敏感性，降低痛閾值，產(chǎn)生痛敏，對熱刺激的耐受性下降等。表明射角叉菜膠后，動物出現(xiàn)了炎性痛與痛過敏。伴隨這些行為變化及注射局部的炎癥反應，從3小時開始可持續(xù)到24小時。局部炎癥反應于24小時達高峰，之后自發(fā)痛行為自行消失。由此誘發(fā)大鼠炎痛模型，用于鎮(zhèn)痛藥的研究。【評價】注射角叉菜膠已用于制備多種組織炎癥模型。角叉菜膠皮下注射后3-24小時，大鼠處于一種穩(wěn)定的痛敏狀態(tài)，便于觀察藥效及作用時程。致炎大鼠分早期時相（2-6小時）和晚期時相（15-24小時）都表現(xiàn)為痛覺過敏。早期時相是由于周圍敏感引起，而晚期時相是中樞敏感引起。早期時相和晚期時相比較明確，是研究炎癥痛雙時相常用模型。己用于鎮(zhèn)痛藥作用效應、中樞和外周鎮(zhèn)痛藥的評價研究。【注意事項】1.角叉菜膠穩(wěn)定性強，在中性和堿性溶液中也很穩(wěn)定，即使加熱也不水解，但酸性溶液中比較容易發(fā)生酸水解作用,尤其是Ph4以下時。2.為了獲得穩(wěn)定、可靠的測定結(jié)果,實驗室溫在20～25℃，環(huán)境安靜,避免光線的干擾。調(diào)節(jié)輻射熱強度,使之恒定于一定水平,基礎痛閾在8～15秒，超過20秒終止照射,以避免損傷后腳掌皮膚組織。每次輻射熱照射的部位應保持一致(預先標定光斑落點范圍)。間隔時間要相對恒定。福爾馬林試驗【原理】將福爾馬林注射于大鼠后爪皮下，可提供一個持續(xù)的傷害性刺激，從而激發(fā)一種明顯的、彌散的、長時間持續(xù)的痛行為反應，即回縮或震搖及舔咬注射足現(xiàn)象，可模擬人類損傷后疼痛的某些特征。將福爾馬林溶液注射入大鼠一側(cè)足底皮下后產(chǎn)生兩個截然分開的疼痛時相，立即誘發(fā)出一持續(xù)0-5分鐘的自發(fā)縮足反射期（第1相）、抬足和舔足行為反應，然后是15-20分鐘的靜止期（靜止相），隨后又出現(xiàn)20-40分鐘的持續(xù)反應期（第2相），傷害性反射行為持續(xù)1小時左右停止。方法給藥后,用微量注射器于小鼠后足底皮下注射2%福爾馬林溶液6μl/只，立即把小鼠放入離實驗臺10cm高處玻璃板上的平底大燒杯，在燒杯下置一傾斜30度左右大鏡子,從鏡面上觀察小鼠痛反應，以小鼠注射福爾馬林后舔足反應作為痛反應指標(為福爾馬林直接刺激神經(jīng)引起的疼痛反應）。記錄0—5分小鼠累積舔足反應時間作為痛閾值,計算其均值,與對照組比較，檢驗其組間顯著性差異。OT-05B對小鼠福爾馬林致痛閾值影響(x±s)

組別劑量(μg/kg)舔后足時間(s)抑制鎮(zhèn)痛%對照69.62±22.25Te-05B18.661.01±17.3714.1對照69.49±15.06Te-05B46.658.14±12.71*16.55對照72.25±14.40嗎啡5mg/kg45.59±14.47**35.4【注意事項】1.福爾馬林能導致機體組織炎癥性持續(xù)性刺激,大鼠為10%0.0.05ml，但文獻中報道皮