第三章谷氨酸生產(chǎn)菌的特征、育種及擴(kuò)大培養(yǎng)1

目錄contents1234谷氨酸生產(chǎn)菌的主要特征●國(guó)內(nèi)谷氨酸生產(chǎn)菌及其比較●谷氨酸生產(chǎn)菌在發(fā)酵過(guò)程中的形態(tài)變化●谷氨酸發(fā)酵的代謝控制育種策略●5利用生物工程技術(shù)選育谷氨酸生產(chǎn)菌●6菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)及種子的質(zhì)量要求

●現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四第一節(jié).谷氨酸生產(chǎn)菌的主要特征一、現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌的分類

現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌主要是棒狀桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬及節(jié)桿菌屬中的細(xì)菌。

1.棒狀桿菌屬(Corynebacterium)直到微彎的桿菌，一端膨大呈棒狀，折斷分裂形成“八”字形或柵狀排列。葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸，G+現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四2短桿菌屬(Brevibacterium)

短的不分枝直桿菌。多數(shù)從葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸，不發(fā)酵乳糖。G+3小桿菌屬(Microbacterium)

形態(tài)與棒狀桿菌相似。發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸弱，主要產(chǎn)乳酸。G+現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四4節(jié)桿菌屬(Arthrobacterium)

培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞形態(tài)變化較大球菌桿菌，桿菌球菌。

G+

G-,G-

G+

能液化明膠，從碳水化合物產(chǎn)酸極少或不產(chǎn)酸?，F(xiàn)在是4頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四二、谷氨酸棒狀桿菌基因組研究進(jìn)展谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032GenBankNC-004369現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四目前應(yīng)用發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸常用的微生物僅有兩大類:一類為細(xì)菌,多采用乳酸菌,另一類為根霉。根霉可以直接利用淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)L-乳酸,但是產(chǎn)酸量低,副產(chǎn)物多,轉(zhuǎn)化率低。Sauer等構(gòu)建了包含乳桿菌L-乳酸脫氫酶基因的畢氏酵母,它利用木糖發(fā)酵,初始濃度為100g/L，生產(chǎn)L-乳酸達(dá)到58g/L，比利用葡萄糖產(chǎn)生乳酸的水平高?；蚬こ逃N（重組DNA技術(shù)）現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四三、現(xiàn)有谷氨酸生成菌的主要特征（1）細(xì)胞形態(tài)球形、棒狀以及短桿狀。（2）G+，無(wú)芽孢、無(wú)鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)。（3）需氧型、生物素缺陷型微生物。（4）脲酶強(qiáng)陽(yáng)性（5）不分解淀粉、纖維素、油脂、酪蛋白以及明膠。（6）發(fā)酵中菌體發(fā)生明顯的形態(tài)變化，同時(shí)發(fā)生細(xì)胞膜滲透性的變化。（7）CO2固定反應(yīng)酶系活力強(qiáng)。現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四（8）異檸檬酸裂解酶活力弱，乙醛酸循環(huán)弱。（9）α-酮戊二酸氧化能力微弱。（10）NADPH2進(jìn)入呼吸鏈能力弱。（11）檸檬酸合成酶、烏頭酸梅、異檸檬酸脫氫酶以及谷氨酸脫氫酶活力強(qiáng)。（12）能利用醋酸，不能利用石蠟。（13）具有向環(huán)境中泄露谷氨酸的能力。（14）不分解利用谷氨酸，并能耐高濃度的谷氨酸，產(chǎn)谷氨酸5%以上?，F(xiàn)在是9頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四第二節(jié)國(guó)內(nèi)谷氨酸生產(chǎn)菌及其比較1、形態(tài)特征短桿至小棒狀，有時(shí)微彎曲，兩端鈍圓，不分枝，呈多種形態(tài)。單個(gè)、成對(duì)及“V”字形排列。

G+。胞內(nèi)有橫隔。不運(yùn)動(dòng)。無(wú)芽孢。一、北京棒桿菌(AS1299)的形態(tài)和生理特征現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四2、培養(yǎng)特征普通肉汁瓊脂平板：菌落圓形，24h白色，48h淡黃色，中央隆起，表面濕潤(rùn)、光滑，有光澤，邊緣整齊且呈半透明狀，無(wú)黏性，不產(chǎn)生水溶性色素?，F(xiàn)在是11頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四3、生理特征★對(duì)氧的要求：好氧及兼性厭氧?！锱c溫度的關(guān)系：菌株26~37℃培養(yǎng)生長(zhǎng)良好，不耐高溫，41℃生長(zhǎng)較弱。★pH的影響：Ph5~10均能生長(zhǎng)，最適pH6~7.5?！镞€原硝酸鹽：反映強(qiáng)烈?！锸锱Ｄ膛囵B(yǎng)：7d后微產(chǎn)堿?！锊凰獾矸?，不分解纖維素。★對(duì)尿素的耐力，2.6%以上生長(zhǎng)受抑制?！镫迕冈囼?yàn)：強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)?！锂a(chǎn)酸物質(zhì)的測(cè)定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖迅速產(chǎn)酸。★生長(zhǎng)因素試驗(yàn)：生物素是必需生長(zhǎng)因素。硫胺素明顯促生長(zhǎng)?，F(xiàn)在是12頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四二、鈍齒棒桿菌(AS1542)的形態(tài)和生理特征1、形態(tài)特征短桿至棒狀，有時(shí)微彎曲，兩端鈍圓，不分枝。單個(gè)、成對(duì)及“V”字形排列。折斷分裂。

G+。胞內(nèi)有橫隔。不運(yùn)動(dòng)。無(wú)芽孢?，F(xiàn)在是13頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四2、培養(yǎng)特征普通肉汁瓊脂平板：菌落圓形，近草黃色，表面濕潤(rùn)、光滑，無(wú)光澤，邊緣頓齒狀，較薄，半透明，無(wú)黏性，不產(chǎn)生水溶性色素。現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四★對(duì)氧的要求：兼性厭氧。★與溫度的關(guān)系：菌株20~37℃培養(yǎng)生長(zhǎng)良好，不耐高溫，42℃不生長(zhǎng)。★pH的影響：pH6~9生長(zhǎng)良好，pH10生長(zhǎng)微弱，pH4~5已不能生長(zhǎng)?！镞€原硝酸鹽：反映強(qiáng)烈?！锸锱Ｄ膛囵B(yǎng)：7d后微產(chǎn)堿。★水解淀粉，不分解纖維素?！飳?duì)尿素的耐力，2.6%以上生長(zhǎng)受抑制?！镫迕冈囼?yàn)：強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)?！锂a(chǎn)酸物質(zhì)的測(cè)定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖、水楊苷、七葉靈等迅速產(chǎn)酸?！锷L(zhǎng)因素試驗(yàn)：生物素是必需生長(zhǎng)因子。3、生理特征現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四三、天津短桿菌(T613)的形態(tài)和生理特征典型的短桿狀，有時(shí)微彎曲，兩端稍鈍圓，不分枝。單個(gè)、成對(duì)及“V”字形排列。折斷分裂。

G+。不運(yùn)動(dòng)。無(wú)芽孢。1、形態(tài)特征現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四2、培養(yǎng)特征★普通肉汁瓊脂平板：菌落圓形，淺黃色，表面濕潤(rùn)、光滑，隆起，邊緣整齊，較薄，半透明，無(wú)黏性，不產(chǎn)生水溶性色素。現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四3、生理特征★對(duì)氧的要求：好氧及兼性厭氧?！锱c溫度的關(guān)系：菌株26~37℃培養(yǎng)生長(zhǎng)良好，75℃處理10min不再生長(zhǎng)?！飌H的影響：pH6~10生長(zhǎng)良好，pH5生長(zhǎng)微弱，pH4和pH11已不能生長(zhǎng)?！镞€原硝酸鹽：反映強(qiáng)烈?！锊凰獾矸?，不分解纖維素?！飳?duì)尿素的耐力，5%以上生長(zhǎng)受抑制?！镫迕冈囼?yàn)：強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)?！锂a(chǎn)酸物質(zhì)的測(cè)定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖、水楊苷、七葉靈★生長(zhǎng)因素試驗(yàn)：生物素是必需生長(zhǎng)因子。硫胺素是促生長(zhǎng)作用。現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四四、北京棒桿菌(7338)與鈍齒棒桿菌(B9)的比較后提取容易，收率較高，質(zhì)量較好分泌色素較多現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四2.5天津短桿菌(T613)與鈍齒桿菌(B9)的比較

T613感染噬菌體時(shí)，不能換用B9，調(diào)換7338.現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四第三節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌在發(fā)酵過(guò)程中的形態(tài)變化

斜面和一、二級(jí)種子在不同培養(yǎng)條件下，細(xì)胞形態(tài)基本相似。斜面培養(yǎng)的菌體較細(xì)小,一、二級(jí)種子比斜面菌體大而粗壯,革蘭氏染色深。多為短桿至棒桿狀,有的微呈彎曲狀,兩端鈍圓,無(wú)分枝;細(xì)胞排列呈單個(gè)、成對(duì)及“V”字形,有柵狀或不規(guī)則聚塊;分裂的細(xì)胞大小為0.7～0.9*1.0～3.4um。由于生物素充足,繁殖的菌體細(xì)胞均為谷氨酸非積累型細(xì)胞。一、種子的菌體形態(tài)現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四二、谷氨酸發(fā)酵不同階段的菌體形態(tài)

長(zhǎng)菌型細(xì)胞：發(fā)酵0-8h或0-10h。短桿至棒狀，有的微彎曲狀，細(xì)胞單個(gè)、成對(duì)及V字形排列。轉(zhuǎn)移期細(xì)胞：發(fā)酵8-18h或10-20h。細(xì)胞開(kāi)始伸長(zhǎng)、膨大。在生物素貧乏的條件下，從谷氨酸非積累型轉(zhuǎn)變成谷氨酸積累型。轉(zhuǎn)移期有長(zhǎng)菌型細(xì)胞，也有產(chǎn)酸型細(xì)胞?，F(xiàn)在是22頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四產(chǎn)酸型細(xì)胞：發(fā)酵16-20h后。細(xì)胞為含磷脂不足的異常狀態(tài)，呈伸長(zhǎng)、膨大、不規(guī)則狀，缺乏V字形排列。發(fā)酵后期，細(xì)胞較長(zhǎng)，呈有明顯的橫隔的多節(jié)細(xì)胞，產(chǎn)酸高。過(guò)量生物素，不同階段的細(xì)胞形態(tài)則基本上沒(méi)有明顯的變化。菌體較粗壯，類似于長(zhǎng)菌型細(xì)胞。典型的異常發(fā)酵，長(zhǎng)菌體、耗糖快、耗尿素快、發(fā)酵周期短、低酸或不產(chǎn)酸?，F(xiàn)在是23頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四三、谷氨酸發(fā)酵感染噬菌體后的菌體形態(tài)

發(fā)酵前期感染噬菌體后,菌體細(xì)胞明顯減少,細(xì)胞不規(guī)則,發(fā)圓、發(fā)胖,缺乏"Ｖ"字形排列,有明顯的細(xì)胞碎片,嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)拉絲、拉網(wǎng),互相堆在一起,幾乎找不到完整的菌體細(xì)胞,類似蛛網(wǎng)或魚(yú)翅狀。

現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四在發(fā)酵中、后期感染噬菌體后,菌體細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,邊緣不整齊,有的邊緣似乎有許多毛刺狀的東西,有細(xì)胞碎片?，F(xiàn)在是25頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四第四節(jié)、谷氨酸發(fā)酵的代謝控制育種一、日常菌種工作

1、定期分純1-2個(gè)月分離純化一次現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四2、小劑量誘變刺激用紫外線（10-20s）處理，可以淘汰生長(zhǎng)微弱的菌株，并能激發(fā)溶原性噬菌體，使挑出來(lái)的菌產(chǎn)酸高、生長(zhǎng)旺盛、無(wú)噬菌體感染?，F(xiàn)在是27頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四3、高產(chǎn)菌制作安瓿管育種后分純的高產(chǎn)菌種需保存到安瓿管中，防止菌種變異?，F(xiàn)在是28頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四二、選育耐高滲透壓菌種耐高糖突變株選育在含20-30%葡萄糖的平板上生長(zhǎng)好的突變株。耐高谷氨酸突變株選育在含15-20%味精的平板上生長(zhǎng)好的突變株。耐高糖、高谷氨酸突變株選育在含20%葡萄糖、15%味精的平板上生長(zhǎng)好的突變株?，F(xiàn)在是29頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四三、選育不分解利用谷氨酸的突變株選育以谷氨酸為唯一碳源菌體不長(zhǎng)或生長(zhǎng)微弱的突變株。四、選育細(xì)胞膜滲透性好的突變株

生物素亞適量吐溫-60青霉素溫度敏感株現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四五、選育強(qiáng)化CO2固定反應(yīng)的突變株六、選育減弱乙醛酸循環(huán)的突變株七、選育強(qiáng)化三羧酸循環(huán)中從檸檬酸到

α-酮戊二酸代謝的突變株八、選育解除谷氨酸對(duì)谷氨酸脫氫酶反饋調(diào)節(jié)的突變株九、選育強(qiáng)化能量代謝的突變株耐谷氨酸、谷氨酸結(jié)構(gòu)類似物、谷氨酰胺抗性突變株現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四第五節(jié)利用生物工程新技術(shù)選育谷氨酸生產(chǎn)菌一、應(yīng)用原生質(zhì)體融合技術(shù)現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四鈍齒棒桿菌B9(細(xì)胞個(gè)體大、易于提??；產(chǎn)酸率低)天津短桿菌TG-866(產(chǎn)酸率高)融合子F263(細(xì)胞個(gè)體大、產(chǎn)酸率高)現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四二、應(yīng)用轉(zhuǎn)化法現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四三、應(yīng)用轉(zhuǎn)導(dǎo)法現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四四、應(yīng)用重組DNA技術(shù)現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四第六節(jié)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)和種子的質(zhì)量要求一、菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的目的

接種量的需要

菌種的馴化

縮短發(fā)酵時(shí)間、保證生產(chǎn)水平現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四二、菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的過(guò)程現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四1、斜面菌種的培養(yǎng)培養(yǎng)基：葡萄糖0.1%，蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化鈉0.25%，酵母膏0.5%，瓊脂2%，培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于菌體的生長(zhǎng)，原料比較精細(xì)。生長(zhǎng)斜面要求：32℃，生長(zhǎng)18-24小時(shí)，生長(zhǎng)良好，所使用斜面連續(xù)傳代不超過(guò)3次現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有44頁(yè)\編輯于星期四2.一級(jí)種子培養(yǎng)（搖瓶）培養(yǎng)條件：于1000ml三角瓶中，裝液200-250ml,32℃

培養(yǎng)12小時(shí)。培養(yǎng)基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米漿2.5%，

K2HPO40.1%，F(xiàn)eSO42mg/k,MnSO42mg/kgPH7.0培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于菌體的生長(zhǎng)，所使用的原