第高效液相色譜法演示文稿

第高效液相色譜法演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有43頁\編輯于星期四優(yōu)選第高效液相色譜法現(xiàn)在是2頁\一共有43頁\編輯于星期四

表20-1HPLC法與經(jīng)典LC法性能對比

經(jīng)典LC

HPLC固定相一般規(guī)格特殊規(guī)格固定相粒度(μm)75～5003～10粒度分布(RSD)20～30％＜5％柱長（cm）10～1003～25（分析型）柱內(nèi)徑（cm）2～50.3～0.46柱入口壓強(qiáng)(MPa)0.001～0.12～40柱效（理論塔片數(shù)/m）10～1003×104～8×104樣品用量(g)1～1010-6～10-4分析所需時間(h)1～200.05～0.5裝置非儀器化儀器化現(xiàn)在是3頁\一共有43頁\編輯于星期四二、HPLC與GC差別相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測主要差別：分析對象的差別和流動相的差別1．分析對象

GC：能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品，高沸點、熱穩(wěn)定性差、離子型等樣品不可檢測占有機(jī)物的20%

HPLC：溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品均可檢測用途廣泛，占有機(jī)物的80%現(xiàn)在是4頁\一共有43頁\編輯于星期四2．流動相差別GC：流動相為惰性氣體組分與流動相無親合作用力，只與固定相作用

HPLC：流動相為液體流動相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善分離度增加了因素，對分離起很大作用流動相種類較多，選擇余地廣流動相極性和pH值的選擇也對分離起到重要作用選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動相可以增大分離選擇性3．操作條件差別

GC：加溫操作

HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬小）現(xiàn)在是5頁\一共有43頁\編輯于星期四三、高效液相色譜儀流程圖1．貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)）2．高壓泵（輸液泵）3．進(jìn)樣裝置4．色譜柱——分離5．檢測器——分析6．廢液出口或組分收集器7．記錄裝置現(xiàn)在是6頁\一共有43頁\編輯于星期四續(xù)前四、HPLC的特點和應(yīng)用

“三高”“一快”“一廣”高柱效——n=104片/米，柱效高（遠(yuǎn)高于一般LC）高靈敏度高選擇性分析速度快應(yīng)用范圍廣泛（可分析80%有機(jī)化合物）現(xiàn)在是7頁\一共有43頁\編輯于星期四第二節(jié)基本理論和條件選擇熱力學(xué)理論：塔板理論——平衡理論動力學(xué)理論：速率理論——Vander方程一、塔板理論二、速率理論三、HPLC法中分離條件的選擇基礎(chǔ)現(xiàn)在是8頁\一共有43頁\編輯于星期四一、塔板理論現(xiàn)在是9頁\一共有43頁\編輯于星期四二、速率理論（與GC對比）

1.現(xiàn)在是10頁\一共有43頁\編輯于星期四2）渦流擴(kuò)散項A及其影響2.討論：

1）流動相流速對HPLC板高的影響（與GC對比）next現(xiàn)在是11頁\一共有43頁\編輯于星期四圖示back現(xiàn)在是12頁\一共有43頁\編輯于星期四續(xù)前3）傳質(zhì)阻抗項及其影響

固定相傳質(zhì)阻抗CS：因固定液膜厚度df極小，固定相傳質(zhì)阻抗CS可以忽略流動相傳質(zhì)阻抗Cm：靜態(tài)流動相傳質(zhì)阻抗CSm：在固定相微孔內(nèi)的滯留的流動相產(chǎn)生的傳質(zhì)阻抗傳質(zhì)阻抗項與流動相的粘度及柱溫有關(guān)現(xiàn)在是13頁\一共有43頁\編輯于星期四圖示現(xiàn)在是14頁\一共有43頁\編輯于星期四降低板高的途徑有：（1）小粒度（dp小）、均勻的球形化學(xué)鍵合相（A、C?。?，勻漿法裝柱（2）低粘度流動相（C小），如甲醇（乙醇與甲醇的理化性質(zhì)相似卻無毒,但25℃時粘度是甲醇的2倍）（3）流速不宜過快（1ml/min），（Cu?。?）增加柱長L，可增加n，但同時也增加tR,

增加分析時間，一般不可取的。

（5）柱溫適當(dāng)，如室溫25℃左右現(xiàn)在是15頁\一共有43頁\編輯于星期四現(xiàn)在是16頁\一共有43頁\編輯于星期四第三節(jié)各類高效液相色譜法

HPLC法分類：按固定相聚集狀態(tài)：液-液色譜法（LLC）液-固色譜法（LSC）按分離機(jī)理：分配色譜法（partitionchromatography）吸附色譜法（adsorptionchromatography）離子交換色譜法（IEC）空間排阻色譜法（SEC）

化學(xué)鍵合相色譜法（BPC）親和色譜法（AC）膠束色譜法（MC）手性色譜法（CC）基本類型色譜法現(xiàn)在是17頁\一共有43頁\編輯于星期四一、液固吸附色譜法（LSC）

liquid-solidadsorptionchromatography

流動相為液體，固定相為固體吸附劑

1．分離機(jī)制：利用溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面吸附活性中心能力的差異

分離前提：K不等或k不等現(xiàn)在是18頁\一共有43頁\編輯于星期四2.影響容量因子k的因素

在色譜柱一定（S與Vm一定）及柱溫一定時，k與溶質(zhì)、溶劑的性質(zhì)有關(guān)。在吸附色譜法中，硅膠是最常用的吸附劑，故以硅膠為例討論

⑴硅膠與溶質(zhì)分子的親合力順序（容量因子序）：飽和烴＜芳烴＜有機(jī)鹵化物＜醚＜酯≈醛≈酮＜醇≈胺＜羧酸與硅膠親合力大的溶質(zhì)，k大，tR‘（或tR）大，晚出柱⑵流動相的極性常用流動相以烷烴為底劑，加入適當(dāng)極性調(diào)整劑組成二元或多元溶劑系統(tǒng)流動相系統(tǒng)極性越大，洗脫力越強(qiáng)，容量因子ｋ越小，tR越小。調(diào)整溶劑的極性，可以控制組分的保留時間?，F(xiàn)在是19頁\一共有43頁\編輯于星期四續(xù)前（3）固定相硅膠的活性5.其他固定相：高分子多孔小球：YSG

原理：吸附+分配特點：柱選擇性好，峰形好，柱效低適用：分離弱極性化合物3.適用：分離極性化合物硅膠吸水量↑，LSC→LLC硅膠含水量較小，吸附色譜硅膠極性較大硅膠含水量>17%，硅膠失活→載體，吸附的水→固定液，分配色譜4．出柱順序：硅膠極性較大，強(qiáng)極性組分后出柱，弱極性組分先出柱現(xiàn)在是20頁\一共有43頁\編輯于星期四二、液液分配色譜法（LLC）1．分離機(jī)制：利用組分在兩相中溶解度的差異2．固定相：載體+固定液（物理或機(jī)械涂漬法）缺點：系統(tǒng)內(nèi)部壓力大，易流失，不實用

3．正相色譜——固定液極性>流動相極性（NLLC）

極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱適于分離極性組分4.反相色譜——固定液極性<流動相極性（RLLC）

極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱適于分離非極性組分現(xiàn)在是21頁\一共有43頁\編輯于星期四三、化學(xué)鍵合相色譜法（BPC）（一）化學(xué)鍵合相（二）反相鍵合相色譜（reversedbondedphasechromatography,RBPC）（三）正相鍵合相色譜（normalbondedphasechromatography,NBPC）（四）離子對色譜（五）離子抑制色譜（了解）現(xiàn)在是22頁\一共有43頁\編輯于星期四（一）化學(xué)鍵合相定義：利用化學(xué)反應(yīng)將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體表面，而構(gòu)成化學(xué)鍵合相1．分離機(jī)制：分配+吸附（以LLC為基礎(chǔ)）2．特點：

1）不易流失

2）熱穩(wěn)定性好

3）化學(xué)性能好，pH介于2~8范圍內(nèi)溶液中不變質(zhì)

4）載樣量大

5）適于梯度洗脫

6）應(yīng)用范圍廣（正相、反相、離子對色譜等）現(xiàn)在是23頁\一共有43頁\編輯于星期四（二）反相鍵合相色譜法1、分離機(jī)理：疏溶劑理論為代表溶質(zhì)的保留機(jī)理是溶質(zhì)分子與極性溶劑分子間的排斥力，促使溶質(zhì)分子與鍵合相的烴基發(fā)生疏水締合。2、影響因素溶質(zhì)分子中非極性部分的總表面積，k，tR

鍵合相中烴基的總表面積，k，tR

洗脫液表面張力（含水量↑），k，tR

3.反相色譜中影響溶質(zhì)保留的因素：（1）反相鍵合的烴基鏈長；（2）有機(jī)溶劑的比例；（3）流動相的pH；（4）流動相的鹽濃度。現(xiàn)在是24頁\一共有43頁\編輯于星期四續(xù)前4．流動相極性與k的關(guān)系：流動相極性↑，洗脫能力↓，k↑，組分tR↑5．出柱順序：極性大的組分先出柱極性小的組分后出柱6．適用：非極性~中等極性組分（HPLC80%問題）現(xiàn)在是25頁\一共有43頁\編輯于星期四（三）正相鍵合相色譜法

1、固定相：極性鍵合相如氰基（－CN）、氨基（－NH2）鍵合硅膠。（經(jīng)典：水飽和的硅膠）2、流動相：類似與以硅膠為固定相的吸附色譜法非極性或弱極性溶劑加極性調(diào)整劑如烷烴加醇類。（與水不混溶的溶劑）3、分離機(jī)制：溶質(zhì)分子與固定相之間定向作用力、誘導(dǎo)力、或氫鍵作用力現(xiàn)在是26頁\一共有43頁\編輯于星期四續(xù)前4．流動相極性與k的關(guān)系：流動相極性↑，洗脫能力↑，組分tR↓，k↓5．出柱順序：結(jié)構(gòu)相近組分，極性小的組分先出柱極性大的組分后出柱6．適用：氰基鍵合相與硅膠的柱選擇性相似（極性稍?。┓蛛x物質(zhì)也相似氨基鍵合相與硅膠性質(zhì)差別大，堿性分析極性大物質(zhì)、糖類等現(xiàn)在是27頁\一共有43頁\編輯于星期四（四）反相離子對色譜法（IPC或PIC）反相色譜中，在極性流動相中加入離子對試劑，使被測組分與其中的反離子形成中性離子對，增加k和tR，以改善分離模型1）離子對試劑：烷基磺酸鈉→分析堿四丁基季胺鹽→分析酸2）影響k的因素離子對試劑的種類：碳鏈長度增加，溶質(zhì)的k增大；流動相的pH：有利于組分和離子對試劑離子化時（離子對的形成），組分的k值最大固定相、流動相性質(zhì)（同一般RP-HPLC）。3）適用：較強(qiáng)的有機(jī)酸、堿現(xiàn)在是28頁\一共有43頁\編輯于星期四反相離子對色譜法模型33++()+3s3(+固定相：弱極性+()+B)+B+H+BHRSONaRSO+Na+BHRSORSO)BH離子對mB+ABAmA(s流動相：極性通式現(xiàn)在是29頁\一共有43頁\編輯于星期四（五）反相離子抑制色譜在反相色譜中，通過加入緩沖溶液調(diào)節(jié)流動相pH值，抑制組分解離，增加其k和tR，以達(dá)到改善分離的目的1）離子抑制劑：弱酸、弱堿性物質(zhì)或pH一定的緩沖溶液2）k的影響因素：選擇流動相：應(yīng)同時考慮極性及pH值酸性物質(zhì)——加入酸HActR↑，k↑

堿性物質(zhì)——加入堿NH3·H2OtR↑，k↑調(diào)節(jié)pH范圍：3.0~8.0

pH>8.0破壞鍵合相與載體的結(jié)合

pH<3.0腐蝕柱子3）適用：弱酸、弱堿物質(zhì)

pH=3~7弱酸；pH=7~8弱堿；兩性化合物現(xiàn)在是30頁\一共有43頁\編輯于星期四第四節(jié)固定相一、固定相——要求：顆粒細(xì)、均勻、球形、耐高壓

1.液-固色譜固定相硅膠：薄殼型；無定形全多孔硅膠(YWG)；球形全多孔硅膠（YQG）

2.化學(xué)鍵合相：利用化學(xué)反應(yīng)將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體表面，而構(gòu)成化學(xué)鍵合相非極性鍵合相：十八烷基鍵合相（ODS或C18）是最常用的非極性鍵合相。中等極性鍵合相極性鍵合相正相色譜反相色譜吸附色譜現(xiàn)在是31頁\一共有43頁\編輯于星期四

第五節(jié)流動相（溶劑系統(tǒng)）對流動相的要求：與固定相不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。pH介于2~8范圍內(nèi)。對試樣有適宜的溶解度。使k在1~10范圍內(nèi)（可用范圍）或2~5（最佳范圍），

k小，tR小；k大，tR大，峰寬變大；與檢測器相適應(yīng)。例如用紫外檢測器時，選用截止波長小于檢測波長的溶劑。純度高，粘度小。低粘度流動相如甲醇﹑乙腈等可以降低柱壓，提高柱效。

現(xiàn)在是32頁\一共有43頁\編輯于星期四（一）流動相對分離的影響（分離方程式）現(xiàn)在是33頁\一共有43頁\編輯于星期四（二）流動相的極性和選擇性流動相的極性（強(qiáng)度）正相色譜：溶劑極性越強(qiáng)，洗脫能力越強(qiáng)反相色譜：極性弱的溶劑洗脫能力強(qiáng)流動相的選擇性不同種類的溶劑，分子間的作用力不同，故選擇性不同吸附色譜：同經(jīng)典LC，二元或三元的有機(jī)溶劑，粘度小正相色譜：同吸附色譜法反相色譜：水-有機(jī)溶劑，粘度小，無UV吸收常用水-甲醇或水-乙腈現(xiàn)在是34頁\一共有43頁\編輯于星期四續(xù)前

（三）洗脫方式1）等度洗脫（恒組成溶劑洗脫）——類似GC的等溫度洗脫以固定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫組分（一個泵）具有方法簡便、重復(fù)性好、色譜柱易再生等優(yōu)點。對于成分復(fù)雜的樣品，往往不能兼顧某些性質(zhì)相差很大組分的分離要求2）梯度洗脫：——類似GC的程序升溫在一定分析周期內(nèi)不斷變換流動相的種類和比例，即不斷改變其極性（兩個泵）。適于分析極性差別較大的復(fù)雜組分縮短分析周期；提高分離效果；改善峰形；增加檢測靈敏度有時引起基線漂移、重復(fù)性較差現(xiàn)在是35頁\一共有43頁\編輯于星期四峰的鑒別：1．苯；2．氯苯；3．對二氯苯4．1，2，3三氯苯；

5．1，3，5三氯苯；6．1，2，4三氯苯；

7．1，2，3，4四氯苯；8．1，2，4，5四氯苯；

9．五氯苯；10.六氯苯（a）梯度洗脫兩種洗脫方式的比較（b）等度洗脫現(xiàn)在是36頁\一共有43頁\編輯于星期四（四）溶劑系統(tǒng)選擇的一般原則RBPC流動相極性越強(qiáng)，洗脫能力越弱，溶質(zhì)的k越大（1）溶劑種類：水+甲醇、水+乙腈（2）溶劑比例：水的比例增加，使k增大（3）溶劑pH：影響弱酸、弱減的離解流動相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱堿k變小選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題：（1）盡量使用高純度試劑（色譜純）作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子（3）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積?，F(xiàn)在是37頁\一共有43頁\編輯于星期四一、輸液系統(tǒng)高壓輸液泵恒壓泵：流量精度不穩(wěn)恒流泵（常用）：在輸送流動相過程中流量恒定。