心肌損傷血液生化標(biāo)志物檢測中微流控芯片的運(yùn)用,醫(yī)學(xué)技術(shù)論文

心肌損傷血液生化標(biāo)志物檢測中微流控芯片的運(yùn)用,醫(yī)學(xué)技術(shù)論文急性心肌梗死〔Acutemyocardialinfarction,AMI〕、慢性心力衰竭和動脈粥樣硬化等心血管疾病是嚴(yán)重危害人類健康的常見疾病。實(shí)現(xiàn)快速的早期診斷和有效治療干涉，對拯救心血管疾病患者的生命具有重要意義。隨著臨床檢驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)展，心肌損傷的血液生化標(biāo)志物，從以檢測酶活力為主的肌酸激酶等酶學(xué)檢驗(yàn)，發(fā)展到以檢測蛋白質(zhì)為主的多種心肌損傷標(biāo)志物，診斷價值逐步提高。當(dāng)前，這些具有高度特異性和敏感性的心肌損傷標(biāo)志物檢測指標(biāo)普遍應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室診斷，為心血管疾病的臨床準(zhǔn)確診斷、鑒別診斷和判定治療效果提供重要根據(jù)?，F(xiàn)前階段，針對心肌損傷標(biāo)志物分析檢測的主要方式是基于抗原抗體的免疫反響，其優(yōu)勢在于免疫分析具有較高的選擇性和靈敏度，但常規(guī)方式方法也存在著檢測時間周期長等局限。研究顯示，AMI發(fā)病3h是拯救瀕死心肌梗死病人的黃金時間，若發(fā)病6h后才得到救治，死亡率將增加10%~12%[1].至今，檢測方式方法的局限性、基層醫(yī)院的現(xiàn)在狀況、糖尿病并發(fā)癥以及患者的自我防護(hù)意識欠缺等因素是我們國家心血管疾病患者發(fā)病率居高不下的重要原因。因而，迫切需求發(fā)展建立適于快速、簡便的高敏感性心肌損傷標(biāo)志物的方式方法，為快速早期診斷和心肌梗塞等心血管疾病有效預(yù)防提供重要手段。微流控芯片是近年發(fā)展起來的一種新興技術(shù)，具有微尺度液體流動可控、低試劑消耗、分析速度快、多功能集成和高通量等獨(dú)特優(yōu)勢，已經(jīng)在生命科學(xué)的多個領(lǐng)域顯示出應(yīng)用前景，包括快速生物分析[2~6],生化檢驗(yàn)[7,8],病原體檢測[9]等。本文著重介紹近年來微流控芯片在心肌損傷標(biāo)志物檢測方面的應(yīng)用進(jìn)展，以期為重大疾病監(jiān)測和快速醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)提供一種重要潛在平臺。2心肌標(biāo)志物概述心肌損傷標(biāo)志物主要有心肌肌鈣蛋白T〔TroponinT,cTnT〕、心肌肌鈣蛋白I〔TroponinI,cTnI〕、肌紅蛋白〔Myoglobin,Myo〕、肌酸激酶同工酶〔Creatinekinaseisoenzyme,CK-MB〕、B型尿鈉肽〔B-typena-triureticpeptide,BNP〕和超敏C反響蛋白〔C-reactiveprotein,CRP〕等。對于隱匿性的心血管疾病，血清中有關(guān)標(biāo)志物的動態(tài)變化則具有特殊價值。心肌損傷的早期標(biāo)志物主要有CRP、Myo和BNP,在心肌損傷的早期即可出現(xiàn)異常增高。CRP是肝臟合成的一種急性時相反響蛋白，其異常增高反響動脈本身內(nèi)在性炎癥和組織損傷與AMI梗死面積的大小有關(guān)[10].Myo在心肌細(xì)胞質(zhì)含量豐富，AMI發(fā)作1~2h后，心肌遭到受損，Myo能夠愈加迅速地釋放到血液循環(huán)中，其濃度在6~9h后到達(dá)峰值，是AMI診斷的早期最靈敏的指標(biāo)[11].BNP是由心肌細(xì)胞合成的具有生物學(xué)活性的天然激素，主要在心室表示出，留神肌細(xì)胞遭到刺激，BNP快速合成并釋放入血液中，在心力衰竭的早期診斷、監(jiān)測病程進(jìn)展等方面有重要的臨床意義。固然CRP,Myo和BNP在心肌細(xì)胞損傷早期有較高的靈敏度，但三者在輔助心血管疾病診斷時缺乏特異性。CRP是血管炎癥的標(biāo)志物，在炎癥、創(chuàng)傷和腫瘤浸潤時其血清濃度都會顯著升高。Myo同樣存在于骨骼肌中，骨骼肌損傷、創(chuàng)傷、腎功能衰竭等疾病，都可導(dǎo)致其升高。升高的血漿BNP濃度也并不一定由心力衰竭引起，某些心臟病、腎功能衰竭、肝硬化等可以使血漿BNP濃度升高。所以CRP、Myo和BNP對冠狀動脈綜合征、心力衰竭及AMI具有較重要的危險性預(yù)測和輔助診斷價值，但不具有確診價值，還需要結(jié)合特異性高的心肌損傷標(biāo)志物監(jiān)測，如心肌酶譜中的CK-MB和心肌肌鈣蛋白cTn.CK-MB主要存在于心肌中，對判定心肌損傷具有高度特異性。正常人血清中CK-MB含量極少〔低于總活性5%〕,留神肌受損時釋放入血。AMI發(fā)病后3~8h,CK-MB即開場升高，在發(fā)病12~24h到達(dá)峰值。在無AMI并發(fā)癥情況下，CK-MB濃度3d后恢復(fù)至正常，而在有AMI梗死的情況下，CK-MB濃度則一直保持高濃度值。CK-MB的檢測，對斷定AMI梗死發(fā)生的時間、面積、部位、梗死的擴(kuò)展及有無心肌灌注均具有一定的價值[10].心肌肌鈣蛋白是存在于心肌內(nèi)的蛋白質(zhì)，根據(jù)構(gòu)造和功能不同可劃分為3種亞型，即cTnT,cTnC和cTnI.華而不實(shí)cTnT和cTnI只存在心肌組織中，故在臨床廣泛用于檢測心肌損傷。由于cTnI對心肌損傷的特異性極高，且僅存在于心肌收縮蛋白的細(xì)肌絲上，是心肌損傷的特異標(biāo)志物，一旦檢測到cTnI,即表示清楚病人已出現(xiàn)不可逆的心肌損害，不會因骨骼肌或其它組織的損害而出現(xiàn)假陽性[9].總體而言，聯(lián)合檢測心肌酶譜、Myo,cTnI及CRP對診斷心血管疾病、療效觀察及預(yù)后判定等將具有重要的臨床價值，能為臨床醫(yī)師及時搶救和診治病人提供快速有效的根據(jù)。3微流控芯片心肌標(biāo)志物檢測原理當(dāng)前，利用微流控芯片進(jìn)行心肌標(biāo)志物檢測大多依靠芯片上的免疫分析原理，即將微流控芯片與常規(guī)的免疫分析方式方法相結(jié)合，通過芯片微尺度通道的流體控制和抗原抗體反響來完成快速的免疫反響。以芯片為載體的免疫分析具有試劑耗量少、分析時間短、易于集成、自動化等特點(diǎn)。當(dāng)前，微流控免疫分析芯片材料主要以單晶硅片、玻璃、石英和有機(jī)聚合物材料及紙基材料等為主。根據(jù)作用介質(zhì)的均一性，芯片免疫分析包括兩種基本類型，均相免疫分析和非均相免疫分析。3.1均相微流控免疫分析均相微流控免疫是指免疫試劑和底物在微流控系統(tǒng)同一液相介質(zhì)中進(jìn)行的抗原-抗體復(fù)合物構(gòu)成、實(shí)時分離檢測的分析方式方法。該方式方法集成了微流控芯片多路流體控制與芯片快速電泳分離特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)對抗原-抗體復(fù)合物的同步化快速分離及檢測。Koutny等[13]建立了血清中可的松的免疫測定方式方法，利用電動力驅(qū)動液流，實(shí)現(xiàn)芯片外抗原-抗體復(fù)合物與游離的抗原、抗體的分離，因而僅為部分意義上的微流控芯片免疫分析。Wang等[14]在玻璃芯片上先進(jìn)行抗原、酶標(biāo)記抗體混合反響，然后經(jīng)電泳分離后，在分離通道下游電化學(xué)檢測鼠免疫球蛋白。均相微流控免疫分析節(jié)省了抗體固定和洗滌等步驟，且液流操作方便，有利于實(shí)現(xiàn)多種心肌標(biāo)志物的并行檢測和集成分析。3.2非均相微流控免疫分析與均相微流控免疫分析相比，非均相微流控免疫則是將抗原〔或抗體〕固定在微流控芯片固相載體外表，經(jīng)過特異性免疫反響，目的抗體〔或抗原〕結(jié)合在固相載體外表即構(gòu)成抗原-抗體復(fù)合物。由于在不同介質(zhì)中構(gòu)成抗原-抗體復(fù)合物，一般通過常規(guī)清洗可完成抗原-抗體復(fù)合物與游離抗原抗體的分離。非均相微流控免疫方式方法能夠用于心肌標(biāo)志物的分析檢測，華而不實(shí)用于抗原〔或抗體〕固定的固相載體種類較多，包括芯片通道外表[15~17]、微珠[18~20]、電極外表[21,22]及多聚物薄膜材料[23,24]等。本研究組以具有蛋白吸附功能的聚二甲基硅氧烷、紙基材料及玻璃通道外表為固定載體進(jìn)行酶聯(lián)免疫分析，建立了一系列基于多通道的人免疫球蛋白G酶聯(lián)免疫吸附反響檢測體系[8,25,26].相對于均相微流控免疫分析，非均相微流控免疫分析速度更快，抗體消耗量更少，也更有利于實(shí)現(xiàn)陣列式、集成化的心肌標(biāo)志物檢測。但是由于該方式包含第二抗體的反響步驟和多步洗滌經(jīng)過，增加了微流控芯片的操作流程，對實(shí)際操作提出了較高要求。4微流控芯片心肌標(biāo)志物檢測方式方法以微流控芯片為平臺的心肌標(biāo)志物免疫分析通常發(fā)生在微米尺寸的微構(gòu)造中，因而對檢測方式方法的要求比傳統(tǒng)免疫檢驗(yàn)更為嚴(yán)格。與之相匹配，需要發(fā)展靈敏度高、響應(yīng)速度快、微型化和集成化的檢測方式方法。電化學(xué)檢測法和光學(xué)檢測法是當(dāng)前最常用的檢測方式〔表1〕.4.1電化學(xué)檢測電化學(xué)檢測是通過電極將反響液中與待測物含量相關(guān)的化學(xué)信號轉(zhuǎn)化為電信號，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對待測物組分檢測的一種分析方式方法。電化學(xué)檢測的主要優(yōu)勢是靈敏度高、選擇性好、裝置簡單且體積小。隨著微電極加工技術(shù)的發(fā)展，研究者經(jīng)常采用一些特殊技術(shù)結(jié)合電化學(xué)檢測方式方法來到達(dá)痕量檢測。Wang等[24]利用自組裝單層膜技術(shù)結(jié)合電化學(xué)檢測方式方法，通過檢測電勢變化而測定樣本中的Myo和血紅蛋白。Zhou等[27]利用量子點(diǎn)標(biāo)記抗體結(jié)合方波溶出伏安法〔Sequarewavestrippingvoltammetry,SWASV〕同時檢測了兩種心肌標(biāo)志物cTnI和CRP.當(dāng)cTnI和CRP分別在0.01~50g/L和0.5~200g/L范圍內(nèi)時，檢測電流與檢測物濃度具有較好的線性一致性。Abad等[21]加工了具有多個電極的環(huán)丙烯聚合物微流控芯片，可同時獨(dú)立檢測6個樣本，檢出限分別達(dá)0.017ng/mL,靈敏度大大超過傳統(tǒng)手段。電化學(xué)檢測技術(shù)與微流控芯片相結(jié)合，將進(jìn)一步減少待測樣本消耗量，縮短分析時間，增加反響靈敏度，易于發(fā)展成為潛在的心肌標(biāo)志物即時診斷平臺。除此之外，為克制心肌標(biāo)志物檢測需要輔助昂貴檢測設(shè)備的限制，近年來，研究者開發(fā)了一些輕便、成本低、實(shí)用性廣，并可定量的檢測裝置。Wang等[22]將能辨別Myo抗原的DNA適配體片段與能催化并將蔗糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖的轉(zhuǎn)化酶結(jié)合，構(gòu)成功能化的DNA傳感器。使用者能夠用血糖儀量化血液樣本中Myo的含量，檢