基因工程的工具酶

本文格式為Word版，下載可任意編輯——基因工程的工具酶其次章基因工程的工具酶第一節(jié)用于基因工程的工具酶

一、限制性內(nèi)切酶（Endonucleosase）

（一）限制性內(nèi)切酶（Endonucleosase）的發(fā)現(xiàn)與分類

1）50年代初發(fā)現(xiàn)細(xì)菌能將外來DNA片段在某些專一位點(diǎn)上切斷，從而保證其不為外來噬菌體所感染，而其自身的染色體DNA由于被一種特別的酶所修飾而得以保護(hù)，這種現(xiàn)象叫做限制－修飾，它們由三個基因位點(diǎn)所控制：hsdR,hsdM,hsdS,十年后，人們搞清了細(xì)菌的限制與修飾分子機(jī)理：hsdR限制性內(nèi)切酶hsdM限制性甲基化酶hsdS控制兩個系統(tǒng)的表達(dá)

1968年Smith等人從流感嗜血桿菌株中分開出兩個類內(nèi)切酶，HindII和HindIII，為基因工程技術(shù)的誕生奠定了基礎(chǔ)。

截止到目前為止，已經(jīng)分開出400余種II類酶，搞清識別位點(diǎn)的有300種，商品化的約有一百種，而試驗(yàn)室常用的有二十種。

2）限制性核酸內(nèi)切酶可分為三大類：

I類能識別專一的核苷酸順序，并在識別點(diǎn)附近切割雙鏈，但切割序列沒有專一性。II類識別位點(diǎn)（回文序列）嚴(yán)格專一，并在識別位點(diǎn)內(nèi)將雙鏈切斷

III類識別位點(diǎn)嚴(yán)格專一（不是回文序列），但切點(diǎn)不專一，往往不在識別位點(diǎn)內(nèi)部。因此在基因工程中具有實(shí)用價(jià)值的是II類限制性內(nèi)切酶。（二）II類限制性內(nèi)切酶的命名及特性

命名原則：取屬名的第一個字母大寫，取種名的前兩個字母小寫，構(gòu)成基本名稱。該種中發(fā)現(xiàn)的不同的酶依照順序編號I,II,III等。如存在變種和品系，取變種或品系的一個字母。若酶存在于質(zhì)粒上，則需大寫字母表示非染色體遺傳因子。

如，HindIII從HaemophilusInfluenzued株中分開的第三個酶。EcoRI表示基因位于Escherichiacoli中的抗藥性R質(zhì)粒上。

（三）II類限制性內(nèi)切酶的底物識別順序及切割位點(diǎn)

絕大多數(shù)的II類限制性內(nèi)切酶在底物DNA上的識別順序長度為4，5，6堿基對，這些堿基對的順序呈回文結(jié)構(gòu)（Palindromic），而且切點(diǎn)就在其內(nèi)部，如EcoRI5'-GAATTC-3'。DNA被限制性內(nèi)切酶切開之后，浮現(xiàn)兩種斷口：鈍端（平端）如PvuII,AluI,EcoRV等粘端（粘性末端）如：EcoRI等

圖2-1限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的末端

（四）識別位點(diǎn)在DNA分子中的頻率

對于特定的限制性酶在DNA分子中的識別位點(diǎn)數(shù)目是可以計(jì)算的，四堿基的酶平均大約每256個核苷酸（44）有一個識別位點(diǎn)，而六堿基的酶大約4096（46）個核苷酸有一個識別序列，計(jì)算是在假定核苷酸隨機(jī)排列的狀況下進(jìn)行的。實(shí)踐中這種方法不完全正確，如λDNA長49kb，對于六堿基的酶應(yīng)當(dāng)有12個切割位點(diǎn)，實(shí)際上要少一些，如BglII只有6個，BamHI只有5個，而SalI只有2個。二、甲基化酶

在專一位點(diǎn)上甲基化，與限制性內(nèi)切酶相對應(yīng)。（一）大腸桿菌中的甲基化酶

dam甲基化酶:可在5'GATC3'序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基，這樣可使一些識別順序中含有5'GATC3'的限制性內(nèi)切酶不能切割來自大腸桿菌的DNA如BclI（TGATCA），但BamHI（GGATAA）則不會由于N6A的甲基化而失去活性，由于這兩種酶對底物的特異性不同。dcm甲基化酶此酶在序列5'CCAGG3'或5'CCTGG3'中的胞嘧啶C5上引入甲基，受其影響的限制性內(nèi)切酶是EcoRII。

（二）甲基化酶在基因工程中用途

大量II類限制性內(nèi)切酶，都存在著相對的甲基化酶，它們可修飾限制酶識別順序中的第三位腺嘌呤上，封閉酶切位點(diǎn)，從而使其免受切割。如：M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）的甲基轉(zhuǎn)移到EcoRI識別順序中的第三位腺嘌呤上，從而使DNA免受EcoRI的切割。三、T4-DNA連接酶（T4-DNALigase）

來源于T4噬菌體感染的大腸桿菌，連接修復(fù)3'端羥基和5'端磷酸基因，脫水形成3'-5'磷酸二酯鍵

連接雙鏈DNA上的單鏈缺口（Nick），因此亦可連接限制內(nèi)切酶所產(chǎn)生的粘性末端連接RNA模板上的DNA鏈缺口

連接平頭雙鏈DNA速度很慢，在高濃度的底物和酶的作用下方可進(jìn)行，這屬于分子之間的連接.

圖2-2連接酶的作用方式

四、核酸酶

作用:降解磷酸二酯鍵分為：外切酶內(nèi)切酶

（一）Bal31(來自于細(xì)菌Alteromonasespejiana)單鏈特異的核酸內(nèi)切酶活性，雙鏈特異的內(nèi)切酶活性。依靠于Ca2+用途：

構(gòu)建限制酶圖譜產(chǎn)生末端缺失突變DNA超螺旋線性化（二）E.coli外切酶III

只降解DNA分子的一條鏈，產(chǎn)生單鏈的DNA分子。（三）S1核酸酶（來源于米曲霉菌）特性：

1.降解單鏈DNA或RNA，降解DNA的速度大于降解的速度2.降解發(fā)生的方式為內(nèi)切和外切

3.酶切活性需4.0-4.5pH環(huán)境，Zn2+激活

4.酶量過大時(shí)會降解雙鏈核酸，由于雙鏈降解活性比單鏈低75000倍

（四）DNaseI:來自于牛胰腺,既可以降解單鏈也可以降解雙鏈，沒有特異性，產(chǎn)生單核苷酸或短鏈五、聚合酶

（一）DNA聚合酶I5’-3’聚合酶活性3’-5’外切酶活性5’-3’外切酶活性核酸內(nèi)切酶活性

可以被枯草桿菌蛋白酶水解成：Klenow片段和N端具5’-3’外切酶活性的分子。

圖2-3DNA聚合酶I（二）Klenow酶

該酶無5'-3'外切活性，保存了5'-3'聚合活性及3'-5'外切活性，基因工程中利用該酶：修復(fù)限制性內(nèi)切酶造成的5'突出的粘性末端標(biāo)記DNA探針

催化cDNA其次條鏈的合成末端終止法測序

圖2-4Klenow酶的作用方式（三）T4DNA聚合酶

與Klenow酶相像，外切酶活性更高。體外誘變反應(yīng)中效率很高。（四）T7DNA聚合酶測序酶

（五）TaqDNA聚合酶耐高溫，主要用于PCR反應(yīng)。（六）逆轉(zhuǎn)錄酶：將mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNAAMV逆轉(zhuǎn)錄酶（鳥類成髓細(xì)胞性白血病病毒）DNA聚合酶活性RNaseH活性DNA內(nèi)切酶活性核酸結(jié)合活性

M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（Moloney鼠白血病病毒）兩種逆轉(zhuǎn)錄酶的區(qū)別肽鏈的組成

禽酶2條肽鏈，具聚合酶和很強(qiáng)的RNaseH活性鼠酶1條，較弱的RNaseH活性反應(yīng)的最適溫度

禽酶42°C，二級結(jié)構(gòu)豐富RNA，禽酶效率高

反應(yīng)的最適pH值禽酶pH8.3鼠酶pH7.6六、DNA修飾酶

有大量的修飾酶，主要的有以下幾種：

1）堿性磷酸酯酶（來自于大腸桿菌或小牛腸道）可以去掉DNA分子的5‘端的磷酸基團(tuán)。2）polynucleotidekinase:來自于T4侵染的大腸桿菌，在5’端增加磷酸基團(tuán)。3）末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltansferase）來自于小牛胸腺組織，在DNA分子的3‘端增加一個或多個脫氧核苷酸。4）Topoisomerase改變共價(jià)閉合雙鏈DNA分子的結(jié)構(gòu)

其次節(jié)DNA的切割反應(yīng)

一、緩沖系統(tǒng)的組成

II類酶的酶活條件：Tris-HClPH7.5,25-50mM；10mMMgCl2；NaCl0-150mM；DTT1mM根據(jù)不同酶對鹽離子要求不同，可將緩沖液分為以下三種狀況：高鹽：100-150mM中鹽：50-100mM低鹽：0-50mM二、酶切操作

DNA量的確定，參與酶量的確定，發(fā)應(yīng)體積的確定（20μl），反應(yīng)時(shí)間的確定，1-1.5hr，一般為37℃，但也有例外，如TaqI在65°C時(shí)活性最高。

單位限制性內(nèi)切酶定義為：在最正確緩沖系統(tǒng)和20μl體積中反應(yīng)1小時(shí)，完全水解1μgDNA所需的酶量。三、酶切結(jié)果分析（一）酶切片段的檢測

1）通過凝膠電泳分開，根據(jù)分子量分開。根據(jù)凝膠的濃度可以分開不同分子量的片段，聚丙烯酰胺凝膠電泳可以分開1-300bp的分子。

2）DNA分子的檢測a.染色EB，DNA分子小于25ng，很難檢測到b.放射性自顯影,可以監(jiān)測少到2ngDNA分子。（二）估計(jì)DNA分子的大小

根據(jù)DNA分子的遷移率，可以用公式計(jì)算出分子量D=a-b(logM)D是移動的距離，M是分子量，a,b是恒量但隨著電泳條件的改變而改變。也可以根據(jù)已知大小的片段進(jìn)行比較，誤差約在5%左右。四、多酶聯(lián)合酶解

對于對濃度要求一致的酶，原則上可以同時(shí)酶解；對于對濃度要求不同的酶，可以：1.低鹽濃度的酶先切，后補(bǔ)加NaCL

2.一種酶切后，換緩沖液，加5mMNaAc0.1體積，2體積乙醇，冰浴5min，4℃離心10min，枯燥

五、定位酶切位點(diǎn)

建立酶切圖譜需要一系列的酶。

首先確定每一種酶切后產(chǎn)生的分子量和片段的數(shù)目；然后進(jìn)行雙酶切；

比較酶切和雙酶切的結(jié)果，繪制酶切圖譜；

含混的位點(diǎn)可以通過部分酶切解決，可以短時(shí)間的酶切或者在4°C條件下進(jìn)行。六、限制性內(nèi)切酶的star活性

在PH不適合，或甘油濃度過高≥10%時(shí)，限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)會出現(xiàn)非專一性，因此應(yīng)確保酶的體積為總體積的十分之一以下。

第三節(jié)DNA片段的連接

重組DNA分子構(gòu)建的最終一步是連接，通過連接酶完成。相對而言，鈍端的連接效率較低，

因此一般提高DNA濃度的方法增加接觸的機(jī)遇。而粘性末端的連接效率較高，由于兩個粘性末端可以通過氫鍵堿基互補(bǔ)配對。這種暫時(shí)的、堿基配對結(jié)構(gòu)可以提高連接的效率。在分子克隆的連接方式主要有以下幾種：一、連接方式

（一）一致粘性末端的連接來源:一致的酶同尾酶問題:

極性有兩種可能

同尾酶連接后，不能用任何一種酶酶切。稱為“焊死〞。（二）平頭末端的連接

粘性末端--分子內(nèi)部連接，平頭末端--分子間的連接。提高連接效率的方法：加大酶用量（10倍）加大平頭末端底物的濃度

參與10%PEG（8000），促進(jìn)分子間的有效作用參與單價(jià)陽離子，150-200mMNaCl提高反應(yīng)溫度

平頭連接同樣存在兩種極性（三）不同粘性末端的連接突出5'末端

Klenow補(bǔ)平，或S1核酸酶切平，然后平頭連接突出3'末端

T4-DNApol切平，然后平頭連接突出末端不同

Klenow補(bǔ)平，或S1核酸酶切平

連接后，可能恢復(fù)限制性位點(diǎn)，甚至還可能產(chǎn)生新的位點(diǎn)。XbaI與HindIII（XbaI恢復(fù)），XbaI與EcoRI（均保存），BamHI與BglII（產(chǎn)生ClaI位點(diǎn)）

（四）人工粘性末端的連接5'突出的末端

外源片段先用Klenow補(bǔ)平；然后用TdT補(bǔ)加polyC；載體片段也用Klenow補(bǔ)平，加polyG，退火不經(jīng)連接即可轉(zhuǎn)化。目的是：不使酶切位點(diǎn)遭遇破壞。3'突出的末端

外源片段先用TdT加polyG；載體片段加polyC；然后退火；再用Klenow補(bǔ)齊；連接平頭末端

可直接用TdT補(bǔ)加末端，但以加polyA/T為佳。這樣稍微加熱，AT區(qū)就會出現(xiàn)單鏈區(qū)域，然后用S1核酸酶水解即可回收片段（五）粘端與平端的連接

linker:人工合成的、含有限制性內(nèi)切酶識別序列的、短的雙鏈DNA片段。–連接的效率較高

–酶切時(shí)可能破壞DNA分子的完整。

adaptor：人工合成的、具有粘性末端寡聚核苷酸。

圖2-5linker的連接方式

（六）粘性末端的更換

在DNA片段上某一酶切口處換成另一種酶切口

–BamHI酶切片段用Klenow補(bǔ)平，或用S1酶切平；連接一段linker或Adaptor，使之產(chǎn)生EcoRI粘性末端。這樣BamHI切口就換成了EcoRI切口。