基因工程試驗

本文格式為Word版，下載可任意編輯——基因工程試驗

1.動物細胞DNA提取原理是什么?

答：先用SDS裂解細胞，使染色體離析，蛋白質變性，釋放出核酸。然后用等體積酚/氯仿/異戊醇抽提，使蛋白質變性沉降到酚與水相的界面，DNA則留在水相中，離心后在上清液中參與醋酸鈉和兩倍體積無水乙醇，除去多糖物質和沉淀DNA，然后離心后沉淀用70%乙醇洗滌，最終用ddH2O溶解沉淀DNA，－20℃保存。2.DNA提取中用到了哪些試劑？有什么作用？

EDTA:二價金屬離子螯合劑，螯合Mg2+，抑制DNA酶活性。由于Mg離子是DNA酶的輔因子。

SDS:一種陰離子去污劑，在高溫（55℃—65℃）條件下能裂解細胞，使染色體離析，蛋白質變性，釋放出核酸。酚:使蛋白質變性。

氯仿:作為除雜劑，除去糖、脂等雜質；加速有機相與液相分開；抽提核酸溶液中殘留的酚。乙丙醇:作為消泡劑；降低DNA的水溶性，讓DNA從溶液中析出；有利于分層，使離心后的上層含DNA水相，中間的蛋白質相及下層有機溶液相維持穩(wěn)定。無水乙醇:降低DNA的水溶性，沉淀DNA。

醋酸納:調PH，中和Tris-Buffer，形成中性環(huán)境，利于DNA沉淀。Tris-Buffer（PH8.0）:提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞。70％乙醇:清洗溶液中離子及其他雜質。

NaCl:提供高鹽環(huán)境，使DNA溶解于液相中。2.有機溶劑使用本卷須知？

答：①有機溶劑的容器，不管是否在使用中，都應順手蓋緊。②盡可能在通風位置工作，以避免吸入有機溶劑的蒸汽。③盡可能避免皮膚直接接觸。3.PCR原理？

答：將目的基因DNA在高溫（94℃）下解鏈成為單鏈模板;人工合成的一對與目的基因兩側序列相互補的寡核苷酸引物在低溫（40~60℃）下分別與變性的目的基因片段兩側的兩條鏈的部分序列互補結合；在中等溫度（65~75℃）下，由耐熱的DNA聚合酶(Taq酶）將dNTP

，，，

中的脫氧單核甘酸加到引物3-OH末端，并以此為起點，沿著模板以5→3方向延伸，合成一條新的互補鏈。

4.PCR類型？反轉錄PCR怎么做的?

答：反向PCR、巢式PCR、錨定PCR、數(shù)字PCR、RT-PCR、實時熒光定量PCR、免疫捕獲PCR等。

RT-PCR的原理：提取組織或細胞中的總RNA，以ployA（A）+選擇性RNA為模板采用oligo(dT)、隨機引物或基因特異性的引物GSP經(jīng)反轉錄酶的作用從RNA合成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，獲得目的基因或檢測基因表達。5.PCR影響因素？

答：引物；模板；DNA聚合酶；Mg2+；底物；反應緩沖液。6.PCR體系有什么物質？作用？

答：①引物：是兩段與待擴增目的DNA序列側翼片段具有互補堿基特異性的寡核苷酸，使

，

DNA聚合酶以其3-OH末端為起點合成互補鏈，決定了特定基因的擴增。

②模板：提供DNA復制的模板，模板DNA可以是單鏈分子，也可以是雙鏈分子。

，

③TaqDNA聚合酶：將dNTP中的脫氧單核甘酸加到引物3-OH末端，并以此為起點，沿

，，

著模板以5-3方向延伸，合成一條新的互補鏈。

④底物dNTPmix：4種脫氧核苷酸，提供PCR反應的原料和能量。

⑤反應緩沖液：反應緩沖液一般含有Tris-HCl、KCl和適當?shù)腗g2+。Mg2+是DNA聚合酶的激活劑，Tris-HCl起緩沖作用，KCl有利于引物的退火。7.怎樣提高PCR產(chǎn)物的特異性？

引物:a.典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。b.選擇GC含量為40％到60％或GC含量映像模板GC含量的引物。c.設計5'端和中間區(qū)為G或C的引物。這會增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。d.避免引物對3'末端存在互補序列，這會形成引物二聚體，抑制擴增。e.避免3'末端富含GC。設計引物時保證在最終5個核苷中含有3個A或T。f.避免3'末端的錯誤配對。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。g.避免存在可能會產(chǎn)生內(nèi)部二級結構的序列，這會破壞引物退火穩(wěn)定性。

Mg2+:濃度尋常為0.5—2.0mmol/l，過高或過低均影響產(chǎn)物的特異性。模板:模板量應適合，過量則可能增加非特異性。

延伸時間:應適合，時間過長會導致產(chǎn)物非特異性增加。

循環(huán)次數(shù):一般為30個（25—30個）周期，假使循環(huán)次數(shù)過高，會增加非特異性產(chǎn)物及其繁雜度。

8.PCR都有哪些酶可以用？

答：TaqDNA聚合酶；TthDNA聚合酶；Vent聚合酶；PfuDNA聚合酶。見試驗書69頁。9.T4DNA連接酶連接的原理？答：T4DNA連接酶作用機制：酶先與ATP形成酶-AMP共價復合物，再與DNA作用、AMP

，，，

轉移至DNA缺口5-磷酸基上形成焦磷酸鍵而活化5-磷酸基，然后再與3-羥基形成磷酸酯鍵，完成連接過程。

10.PCR產(chǎn)物與T載體怎樣連接的？

答：PMD18-T質粒0.5uL，PCR產(chǎn)物4.5uL，2×solution（含T4DNA連接酶）5uL，混勻后16℃水浴過夜。

11.DNA用試劑盒是怎么回收純化得到的？

答：依據(jù)吸附柱中的硅膠膜在高鹽濃度下特異性吸附DNA，在低鹽濃度下可被洗脫的原理。依照100mg膠塊參與700uL溶膠液的比例，55℃溶膠。將溶化的膠溶液轉移到吸附柱中，離心后倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入同一收集管，加漂洗液離心洗滌，重復漂洗一次，去掉廢液后放回吸附柱空轉，盡量去除多余溶液。再將吸附柱放入新的收集管中參與洗脫液，靜置離心后去掉吸附柱，即為純化產(chǎn)物。12.DNA回收的本卷須知?

答:①參與的膠塊溶化液的量要足量，保證膠能完全溶解，避免堵塞硅膠模

②確保WB液中已經(jīng)參與了酒精

③把膠液倒入柱子后要靜止2min以后再離心，使DAN完全吸附于膜上④洗脫液要滴在膜中央，以充分洗脫結合在膜上的DNA。⑤將離心后的洗脫液倒掉后，要在空離心。13.連接為何在16℃？

答：由于黏性末端的DNA雙鍵間有氫鍵的作用，溫度過高使氫鍵不穩(wěn)定，但連接的最適溫度恰為37℃，所以經(jīng)綜合考慮，采用16℃較為適合。14.載體與目的基因連接時各自的量有什么講求？

答：連接時外源基因的量要多一些，載體的量要少一些，這樣碰撞的機遇就會多，否則載體自身環(huán)化就嚴重，一般載體DNA與目的基因連接采用1:(1-3）的比。連接酶的用量不宜過

多。

15.Cacl2制備感受態(tài)原理？

答：將細胞培養(yǎng)至OD600為0.4-0.6后放入冰浴中使其中止生長，然后將菌株置于低溫預處理的低滲Cacl2溶液中，即造成細胞膨脹，細胞通透性發(fā)生暫時性的改變，從而極易與外源DNA相黏附并在細胞表面形成復合物16.轉化？感受態(tài)?以及其的影響因素？

答：轉化：是將外源DNA分子引入受體細胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段。

感受態(tài)：指宿主細胞最易接受外源DNA片段并實現(xiàn)轉化的一種生理狀態(tài)，它是由宿主菌的遺傳性所決定，同時也受菌齡；外界環(huán)境因子等的影響。

影響因素：細胞的生長狀態(tài)和密度、CaCl2處理時間、熱擊時間、感受態(tài)細胞的保存期、質粒DNA的質量和濃度、試劑的質量、防止雜菌和雜DNA的污染、整個操作均需在冰上進行，不能離開冰浴，否則細胞轉化率將會降低。

17.制備感受態(tài)的方法有哪些？(大腸桿菌、農(nóng)桿菌、酵母）（1）大腸桿菌感受態(tài)制備方法：CaCl2法制備

（2）農(nóng)桿菌感受態(tài)制備：CaCl法制備，類似于大腸桿菌的方法。將正在生長的農(nóng)桿菌細

胞參與到低滲的CaCl溶液中，0oC下處理便會使細菌細胞膜的透性發(fā)生改變，此時的細胞浮現(xiàn)出感受態(tài)。制備好的農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞迅速冷凍于—70oC可保存相當一段時間而不會對其轉化率有太大影響。

（3）酵母感受態(tài)制備：

18.熱擊轉化的原理？

答：利用CaCl2處理感受態(tài)宿主細胞，然后通過熱擊法處理，即置于42℃高溫60—90s，細胞布朗運動猛烈，膜滾動性加強，由于感受態(tài)細胞細胞膜有受傷，DNA進入細胞，然后降溫在培養(yǎng)基上生長，表達足夠的蛋白質，以使能在抗生素的平板上生長菌落。19.藍白斑篩選的原理？

答:大量載體都帶有一個大腸桿菌DNA的短區(qū)段，包含β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控區(qū)和N端146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點（MCS），這種載體適合轉入可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的受體細胞。宿主和質粒單獨編碼的片段僅是β-半乳糖苷酶的部分序列，單獨存在時沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成具有酶活性的蛋白質，即為互補。由互補而產(chǎn)生的lacZ+細菌在誘導劑IPTG（異丙基-β-D硫代半乳糖苷）的作用下，在無色底物X-Gal存在時產(chǎn)生藍色沉淀底物，使菌落顯藍色。假使外源DNA插入到質粒的多克隆位點后，無法實現(xiàn)互補，使得帶有重組質粒菌落形成白色菌落。

20.LB的配方

答：LB培養(yǎng)基：1％胰化蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％Nacl。即10g胰化蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化鈉溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH調至7.2在補足水至1L。固體培養(yǎng)基在LB培養(yǎng)基中添加1.5％~2％瓊脂，121℃滅菌20min備用。21.滅菌的過程？

121℃，滅菌20min。首先往高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)添適量水，然后把培養(yǎng)基放入鍋內(nèi)，鍋蓋對稱擰緊。待壓力升至0.05MPa時，開啟排氣閥，排完氣后，關閉排氣閥。待壓力再次升至0.1MPa時，開始計時，直至升至0.15MPa時關閉電源開關。待壓力將至0.1MPa時，開啟電源開關，升至0.15MPa時關閉電源。如此循環(huán)，20分鐘后，關閉電源，直到壓力降至0時，開啟排氣閥，最終開啟鍋蓋取出培養(yǎng)基。22.涂板前在LB上37℃1h？

答：質粒只有在大腸桿菌中跟隨其復制，使拷貝數(shù)增加，轉錄翻譯出足夠的酶，才具有抗性。23.轉化常見方法？

答:大腸桿菌：化學轉化法、電擊法。動植物細胞：顯微注射法、農(nóng)桿菌轉化法、基因搶法。24.質粒DNA提取原理？

答：基于環(huán)狀質粒DNA相對分子質量小，易于復性的特點。在熱或堿性條件下DNA分子雙鏈解開，若此時將溶液置于復性條件下，變性的質粒分子能在較短的時間內(nèi)復性而染色體DNA不能復性。經(jīng)過離心除去變性的染色體DNA和蛋白質雜質沉淀，上清液中的DNA分子則利用無水乙醇與鹽凝聚形成沉淀。

25.溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ有什么作用？成分是什么？

答：solutionⅠ：含葡萄糖，Tris-Hcl（PH8.0），RNA酶和EDTA。葡萄糖使懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子底部；Tris-Hcl（PH8.0)提供一個適當?shù)腜H環(huán)境；EDTA螯合二價金屬離子，抑制DNase的活性;RNA酶降解RNA。

solutionⅡ：含NaOH和SDS。NaOH使染色體DNA氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開而變形形成雜亂無章的片段，同時使質粒DNA的大部分氫鍵發(fā)生斷裂；SDS用于溶解細胞膜上的脂肪和蛋白質。

solutionⅢ：含NaAc或KAc（PH4.8），用于中和solutionⅡ中的堿性溶液，使得質?？梢詮托?，而染色體DNA則不能復性，從而經(jīng)離心后把質粒分開出來。26.TAKARA公司都有哪些產(chǎn)品？有什么用途？（酶、載體類型等）27.限制性內(nèi)切酶識別、切割有什么特點？

答：識別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)特別的核苷酸序列。其切口有兩種類型：平末端和黏性末端。

28.星號活性的影響因素?

答：甘油體積分數(shù)過高（>5%）；酶過量（>100u/uL）；離子濃度低（8.0）等。

29.T載體的結構？（從大連寶生物下載說明書閱讀。)

T載體是一種高效克隆PCR產(chǎn)物(TA的克隆)的專用質粒載體，為線性化載體，線性化后兩側3'端各多出一個脫氧胸苷酸(T)，無需酶切可直接與游離A末端的PCR產(chǎn)物連接，屬于非定向克隆。

30.酶切體系有哪些成分？答：10uLddH20；2uL10×buffer(高鹽緩沖液Hbuffer；中鹽緩沖液Mbuffer；低鹽緩沖液Lbuffer)；7uL質粒DNA；作用于目的基因兩端的酶切位點的限制性內(nèi)切酶兩個各0.5uL。31.為什么膠塊能在溶膠液中溶解？

答：試驗中所使用到的凝膠回收試劑盒，作用是從瓊脂糖凝膠中回收純化DNA片段，采用了獨特的凝膠溶化液BufferGM，其具有較強的緩沖性能并含有PH指示劑，便利判斷溶液的PH值，是否與DNA制備膜結合，其溶解能力很強，無需加熱，在室溫(15-25°C)條件下可快速溶解凝膠。32.影響連接的因素？

答：1.連接酶的用量：酶濃度越高反應速度越快，產(chǎn)量也高，但連接酶是保存在50%的甘油中的，甘油濃度過高會影響連接效果。2.作用的時間與溫度:一般采用16℃，連接12-16h，由于雖然DNA連接酶的最適溫度是37℃，但在37℃時，黏性末端之間的氫鍵結合是不穩(wěn)定的，它不足以抵御熱破碎作用，而反應時間是依據(jù)溫度而定的，所以綜合考慮后采用16℃連接12-16h。3.底物濃度:一般采用提高DNA的濃度來增加重組的比例，但底物濃度過高。反應體積太小，連接效果也很差。

33.回收DNA中空轉有什么作用？

答：去除吸附柱中多余溶液及雜質，保證DNA的純度。34.復制型載體有哪些系列？表達型載體分哪些？

復制型載體：質粒載體，粘粒載體，噬菌體載體，人工染色體。

表達型載體：大腸桿菌表達載體，利用T7噬菌體啟動子的表達載體，表達融合蛋白的表達載體，分泌型表達載體，大腸桿菌/革蘭氏陽性菌穿梭載體，大腸桿菌/酵母菌穿梭載體，隨機插入突變載體，基因插入/基因敲除。

35.目的基因鑒定有哪些方法？是如何實現(xiàn)的？

（1）檢測轉基因生物染色體上的DNA上是否插入了目的基因。

采用DNA分子雜交技術，先將轉基因的基因組提取出來；把目的基因的DNA片段用放射性同位素做標記作為探針；使探針與基因組DNA雜交，假使出現(xiàn)雜交帶，則說明目的基因已插入染色體DNA中。

（2）檢測目的基因是否轉錄出了mRNA。

采用DNA與RNA雜交技術。從轉基因生物中提取mRNA,把目的基因的DNA片段用同位素標記作為探針；使探針與mRNA雜交，假使出現(xiàn)雜交帶，就說明目的基因轉錄出了mRNA。（3）檢測目的基因是否翻譯出了蛋白質。

從轉基因生物中提取蛋白質，用相應抗體（先進行同位素標記）進行抗原—抗體雜交；假使出現(xiàn)雜交帶，說明目的基因已形成蛋白質產(chǎn)品。（4）個體生物學水平的鑒定

將轉基因的產(chǎn)品與自然產(chǎn)品作比較，以確定是否轉入目的基因。36.Amp、Kan篩選的原理？答：質粒具有氨芐青霉素抗性或卡那霉素抗性，轉化了這些質?；蛑亟M質粒的大腸桿菌寄主可以在含有氨芐青霉素或卡那霉素的培養(yǎng)基上生長，而非轉化子則不能生長。從而篩選出含有重組載體的細胞。

37.瓊脂、瓊脂糖的區(qū)別？

答：瓊脂是由瓊脂糖和瓊脂果膠組成的，瓊脂是一種固化劑，本身不提供任何營養(yǎng)，是一種高分子的碳水化合物，僅溶于熱水，主要用于細胞培養(yǎng)。

瓊脂糖是從瓊脂中提取的一種多糖，由半乳糖及其衍生物構成，不帶電荷，主要用于凝膠電泳，凝膠過濾。

38.內(nèi)切酶不同末端連接形成幾種鍵？分別有幾個答：內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生的粘性末端進行連接形成兩個3'-5'磷酸二酯鍵和若干互補堿基對之間的氫鍵，若酶切產(chǎn)生的平末端進行連接，形成兩個3'-5'磷酸二酯鍵。39.怎樣研究一個基因的功能？

(1)在基因庫中查找該基因的同源基因或同源物種的該類基因，根據(jù)他們的功能對欲研究基因的功能作大體的推測。

(2)尋覓該基因缺失型的個體，或對生物個體進行該基因的基因敲除，將其與正常含有該基因的個體進行比對，根據(jù)對該基因的功能的推測進行相應的性狀，生理方面的差異的觀測。

(3)利用基因工程技術對生物個體進行該基因的過表達操作，再將其與正常個體和基因缺失型個體進行比照，根據(jù)性狀或生理功能的差異從而確定該基因的功能。

《基因工程》期末總結

2023級生工（七）班王俊

1.基因漂泊：轉基因生物的外源基因通過花粉傳授等途徑擴散到其他物種并轉入、整合到其他生物的基因組中，使得其他生物或產(chǎn)品混雜有轉基因成分，完成自然界基因庫的混雜和污染。

2.基因工程：基因工程是在分子生物學和分子遺傳學綜合發(fā)展基礎上，通過在分子水平上對基因或基因組進行改造，使物種獲得新的生物性狀的一種嶄新技術。p1

3.質粒：是細菌中獨立于染色體外，能進行自我復制的，雙鏈，共價閉合環(huán)狀DNA分子，少數(shù)為線形。p16

4.電泳：帶電顆粒在電場作用下，向著與其自身所帶電性相反的電極移動。

5.PCR：聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction）,是一種類似于細胞內(nèi)DNA的自然復制過程，利用半保存復制的原理，以待擴增的DNA為模板，在體外由引物介導的酶促合成特異DNA片段。（試驗教材p64）

6.半定量PCR：半定量PCR是通過RT—PCR最終產(chǎn)物電泳后電泳條帶的明暗來間接反應出原始模板的豐度的PCR技術。

7.反轉錄PCR：（RT—PCR）將RNA的反轉錄和cDNA的聚合酶鏈擴增相結合的技術。其原理是提取組織或細胞中的總RNA，以poly(A)+選擇性RNA作為模板，采用oligo(dT)，隨機引物或基因特異性的引物GSP（genespecialprimer）經(jīng)反轉錄的作用從RNA合成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，從而獲得目的基因或檢測基因表達。

8.實時熒光定量PCR：通過對PCR擴增反應中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測，從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。P21

9.引物：兩段與待擴增目的DNA序列側翼片段具有互補堿基特異性的寡核苷酸。（試驗教材P65）

10.RACE：cDNA末端快速擴增技術（rapidamplificationofcDNAends）。主要通過PCR技術由已知的部分cDNA序列來獲取完整的cDNA的5`和3`端序列。最終，從兩個有相互重疊序列的3`和5`—RACE產(chǎn)物中獲得全長cDNA,或者通過分析RACE產(chǎn)物的3`和5`端序列，合成響應引物擴增出全長cDNA。P43

11.western印跡：即蛋白質印跡雜交，將電泳分開后的組織或細胞總蛋白從凝膠轉移到固體支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特異性抗體檢測某特定抗原的一種蛋白質檢測技術。

12.基因文庫：是指通過克隆方法保存在適當宿主中的某一生物體DNA分子的總和，這些插入分子片段和載體連接在一起，代表某種生物的全部基因組序列或全部mRNA序列。P44

13.分子雜交：不同的DNA片段之間，DNA片段與RNA片段之間，RNA片段之間，假使彼此間的核苷酸排列順序互補也可以復性，形成新的雙螺旋結構。這種依照互補堿基配對而使不完全互補的兩條多核苷酸相互結合的過程稱為分子雜交。14.星號活性：在某些條件下，一種特異性識別順序的限制性性內(nèi)切酶在酶切同一種DNA片段時會產(chǎn)生新的酶切位點而得到不同的酶切片段的酶活性叫做星號活性。15.藍白辬篩選：大量載體都帶有一個大腸桿菌DNA的短區(qū)段，包含β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控區(qū)和N端146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點（MCS），這種載體適合轉入可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的受體細胞。宿主和質粒單獨編碼的片段僅是β-半乳糖苷酶的部分序列，單獨存在時沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成具有酶活性的蛋白質，即為互補。由互補而產(chǎn)生的lacZ+細菌在誘導劑IPTG（異丙基-β-D硫代半乳糖苷）的作用下，在白色底物X-Gal存在時產(chǎn)生藍色沉淀底物，使菌落顯藍色。假使外源DNA插入到質粒的多克隆位點后，無法實現(xiàn)互補，使得帶有重組質粒菌落形成白色菌落。16.目的基因：在基因工程實踐中，研究者所感興趣和想研究的基因就是目的基因。17.Taq聚合酶：從溫泉中的水生棲熱菌中分開出TaqDNA聚合酶。該酶具有5`→3`聚合酶活性以及依靠于聚合作用的外切酶活性，不存在3`→5`外切酶活性，是一種耐熱的依靠于DNA的DNA聚合酶。P55

18.轉化：重組質粒DNA分子導入受體細胞的過程稱為轉化。P69

19.啟動子：啟動子是一段位于結構基因5`端上游區(qū)，基因轉錄起始所必需的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA確鑿地相結合并具有轉錄起始的特異性。20.限制酶：（限制性內(nèi)切酶）是能夠識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周邊切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。（限制：限制外源DNA進入；內(nèi)切：切DNA內(nèi)堿基）

21.限制性內(nèi)切酶：一類能夠針對特定核苷酸序列進行特定位點的切割，產(chǎn)生特定的粘性末端或平末端的酶。P51

22.載體：把攜帶外源基因進入受體細胞的這種工具叫做載體。在基因工程中，最常用到的是質粒載體。P57

23.感受態(tài)細胞：是指最易接受外源DNA片段并實現(xiàn)其轉化的一種生理狀態(tài)的細胞。（試驗教材P153）

24.轉基因技術：轉基因技術是將人工分開和修飾過的基因導入到生物體基因組中，由于導入基因的表達，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾，這一技術稱之為轉基因技術（Transgenetechnology）。

25.轉基因食品：又稱基因改良食品或基因工程食品，是利用基因工程技術將一些微生物、動物或植物的基因植入另一種微生物、動物或植物中，接受的一方面由此獲得了一種它所不能自然擁有的品質。P138

26.粘性末端：經(jīng)酶切后，切口處留下沒有配對的單鏈尾巴即為粘性末端。粘性末端可以分為5`磷酸突出的末端，3`羥基突出的末端。(試驗教材P136)

27.DNA連桿：連桿又叫銜接物，是指用化學法合成的由10～12個核苷酸組成，具有一個或數(shù)個限制性酶識別位點的寡核苷酸片段。P6828.基因藥物：基因工程藥物是指用現(xiàn)代基因重組技術對基因進行克隆，通過重組DNA導入大腸桿菌、酵母或動物細胞成功構建工程菌株或細胞株，在工程菌株、細胞中所表達產(chǎn)生的新型藥物包括細胞因子、激素、溶血栓藥物、疫苗、抗體、反義RNA及基因治療藥物等多種難治疾病的基因工程藥物。P14829.基因診斷：基因診斷即DNA診斷或分子遺傳學診斷，是指利用標本中的DNA或RNA作為檢測

對象進行疾病診斷的方法。P161

30.基因治療：基因治療是指通過基因水平的改變來治療疾病的方法。P168

31.T-DNA：它是在農(nóng)桿菌侵染細胞時，從Ti質粒上切割下來轉移到植物細胞的一段DNA，與腫瘤形成有關，包括左邊界和右邊界。

32.農(nóng)桿菌：從土壤中分開出來的革蘭氏陰性菌，主要有兩種：根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌，其中研究最多也最完全的是根癌農(nóng)桿菌，他能將自身Ti質粒的一段DNA（T-DNA）轉移到植物細胞中，從而使至于受傷部位形成冠癭瘤。

1.基因工程在各領域中的應用(舉例說明)(教材P6～P11)

(1)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應用：在大田作物、園藝作物中應用，如培育作物新品種、品質改良、作物增產(chǎn)、防除雜草、防治病蟲害等。

(2)在林木花卉中的應用：在花卉產(chǎn)業(yè)中為定向育種提供了技術保障。(3)在畜牧業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)中的應用：轉基因牛，豬，魚等動物獲得優(yōu)良性狀。

(4)工業(yè)領域中的應用：影響最為深遠的為食品工業(yè)，基因工程技術涉及在食品領域中的作用目前涉及對食品資源的改造、新產(chǎn)品的開發(fā)、食品添加劑的生產(chǎn)以及食品衛(wèi)生檢測等方面。(5)在醫(yī)藥衛(wèi)生領域中的應用：通過基因工程技術生產(chǎn)制造基因工程藥物，現(xiàn)已成功開發(fā)了人血球蛋白、干擾素、乙肝疫苗等令人鼓舞的新藥。

(6)在環(huán)境保護領域中的應用：采用基因工程的方法可對不同菌株中的特異性降解基因進行修飾、累加、轉移，提高微生物凈化環(huán)境的能力，吞噬和分解多種污染環(huán)境的物質。

2.基因工程中研究一個基因能有哪些技術運用到其中？(1)DNA的提取技術

a.基因組DNA提?。篊TAB法，SDS法等b.質粒DNA提?。簤A裂解法、煮沸法

c.線粒體、葉綠體DNA的提?。翰钏匐x心結合SDS裂解法

(2)DNA的凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(3)基因擴增技術：PCR（聚合酶鏈式反應）

LP-PCR、錨定PCR、RT-PCR、熒光實時定量PCR技術等(4)DNA印跡雜交技術：Southern雜交

(5)DNA核苷酸序列的測定技術：Sanger法測序—雙脫氧鏈末端終止法等3.給予一個基因，如何構建一個載體：

(1)根據(jù)該基因序列設計特異引物，通過PCR進行該基因的大量