基因工程課程小結(jié)

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第一章緒論

基因工程概念：依照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)密的設(shè)計(jì)，通過(guò)體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，有目的地改造生物種性。，使現(xiàn)有的物種在較短時(shí)間內(nèi)趨于完善，創(chuàng)造出更符合人們需求的新的生物類型。（又稱遺傳工程或DNA重組技術(shù)）（一）基因工程研究發(fā)展史

現(xiàn)代分子生物領(lǐng)域理論上的三大發(fā)現(xiàn)：1.DNA是遺傳物質(zhì)2透露了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保存復(fù)制3遺傳密碼的破譯、遺傳信息的傳遞方式?，F(xiàn)代分子生物領(lǐng)域理論上的三大發(fā)明：1.限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)與DNA的切割2DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)與DNA片段的連接3基因工程的載體的發(fā)現(xiàn)研究。（二）基因工程研究?jī)?nèi)容

1目的基因的研究獲得目的基因的途徑好多，主要有通過(guò)構(gòu)建基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)，從中篩選出特別需要的基因。

2基因工程工具酶的研究基因工程工具酶指體外進(jìn)行DNA合成、切割、修飾和連接等系列過(guò)程中所需要的酶，包括DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶、修飾酶和連接酶等。現(xiàn)在常用的DNA連接酶只有兩種，即大腸桿菌DNA連接酶和T4DNA連接酶。

其次章基因工程基本技術(shù)路線

生物材料

RNA

mRNADNA基因組文庫(kù)人工合成cDNA文庫(kù)

克隆載體目的基因

受體細(xì)胞重組DNA

克隆子

轉(zhuǎn)基因生物

基因工程基本技術(shù)路線圖

（一）DNA的組成和結(jié)構(gòu)

生物體內(nèi)的DNA絕大部分是以B-DNA形式存在的。

當(dāng)變性的DNA迅速降溫時(shí)，兩條單鏈DNA不易復(fù)性成雙鏈DNA。

幾乎所有真核生物的染色體DNA都是線性DNA，部分原核生物的染色體DNA也是

以線形存在。

ocDNAlDNAccDNA(電泳方向：由上至下)（二）自然DNA的制備1自然DNA的來(lái)源：1染色體DNA2病毒和噬菌體DNA3質(zhì)粒DNA4線綠體和葉綠體DNA

2自然DNA的提?。?準(zhǔn)備生物材料2裂解細(xì)胞：對(duì)于細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的原核生物，可用溶菌酶處理，用NaOH和SDS處理，用煮沸處理，用冰凍處理，以及用超聲波處理等。3DNA的純化：

最常用的是方法是乙醇沉淀4DNA濃縮：

5DNA片段大小的凝膠電泳檢測(cè)

影響電泳的因素：1帶點(diǎn)泳顆粒的物理性狀2支持物介質(zhì)3電場(chǎng)強(qiáng)度4緩沖液離心強(qiáng)度

凝膠電泳：在PH8..0--8.3的緩沖溶液中，核酸分子帶負(fù)電，向正極移動(dòng)。在濃度適當(dāng)?shù)哪z中，由于分子刷選效應(yīng)，使大小和設(shè)想不同的核酸分子遷移率出現(xiàn)差異，從而把它們分開(kāi)。6核酸分子雜交（297-312）7DNA序列分析

（1）DNA的雙脫氧鏈終止序列（329）（2）化學(xué)降解測(cè)序列（327）（3）PCR測(cè)序

（4）DNA自動(dòng)化測(cè)序（5）DNA雜交測(cè)序

（6）DNA片段序列測(cè)序的策略隨機(jī)克隆策略、引物步移策略和定向缺失克隆策略。

大規(guī)?；驕y(cè)序的兩種策略：逐步克隆法和全基因組散彈法

第三章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)

（一）限制性核酸內(nèi)切酶和DNA片段化

1限制性核酸內(nèi)切酶是一類能識(shí)別雙鏈DNA中特別核苷酸序列，并使每條鏈的一個(gè)磷酸二酯鍵斷開(kāi)的內(nèi)脫氧核糖核酸酶。2限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列：（1）長(zhǎng)度，4--8個(gè)堿基，最常見(jiàn)的為6個(gè)堿基。（2）識(shí)別序列的結(jié)構(gòu)：大多數(shù)為回文結(jié)構(gòu)，切割位點(diǎn)在DNA兩條鏈相對(duì)稱的位置，也有序列埠對(duì)稱的，或呈休止對(duì)稱。（3）切割位點(diǎn)：磷酸二酯鍵斷開(kāi)的位置。3限制性內(nèi)切酶內(nèi)切產(chǎn)生的末端：（1）匹配末端：識(shí)別位點(diǎn)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)的序列經(jīng)限制酶切割后產(chǎn)生的末端，亦即黏性末端。（2）平末端：在回文對(duì)稱軸上同時(shí)切割DNA的兩條鏈則產(chǎn)生的末端。（3）非對(duì)稱突出末端：識(shí)別序列為非對(duì)稱性時(shí)。

4影響限制性內(nèi)切酶活性的因素：（1）DNA純度：存在pro、乙醇、EDTA、SDS等等會(huì)降低活性，可增加酶的用量。（2）DNA樣品的甲基化程度。甲基化對(duì)酶切得影響：a修飾酶切位點(diǎn)b產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)c對(duì)基因組作圖的影響。（3）限制性內(nèi)切酶緩沖液的性質(zhì)：高鹽、中鹽和低鹽。（4）DNA的分子結(jié)構(gòu)：線形>超螺旋和環(huán)狀。（5）酶切溫度T：37°

5一些限制性核酸內(nèi)切酶雖然來(lái)源不同，但是具有一致的識(shí)別序列，這樣的限制

性核酸內(nèi)切酶被稱為同裂酶。同裂酶可以是具有不同的切割位點(diǎn)，也可以是具有一致的切割為點(diǎn)。

6Star活性：某些限制性核酸內(nèi)切酶在特定條件下，可以在不是原來(lái)的識(shí)別序列處切割DNA。

Star活性出現(xiàn)的頻率因采用的限制性核酸內(nèi)切酶、底物DNA和反應(yīng)條件的不同而不同。幾乎所有的限制性核酸內(nèi)切酶都具有Star活性。7DNA分子片段化：（1）單酶切法（最常用的方法）（2）雙酶切法（3）部分酶切

8DNA分子的限制性圖譜：（1）雙酶切法（2）部分酶切法（3）Bal31逐步切割片段法

（二）DNA連接酶

1DNA連接酶是一種封閉DNA鏈上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5'-PO4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯鍵。但這兩條鏈必需是與同一條互補(bǔ)鏈配對(duì)結(jié)合的(T4DNA連接酶除外)，而且必需是兩條緊鄰DNA鏈才能被DNA連接酶催化成磷酸二酯鍵。

2DNA連接酶包括大腸桿菌DNA連接酶和T4噬菌體DNA連接酶。3T4噬菌體DNA連接酶更廣泛的應(yīng)用：（1）修復(fù)雙鏈DNA上的單鏈缺口（2）連接RNA-DNA雜交雙鏈上的DNA鏈缺口或RNA鏈缺口，后者反應(yīng)速度較慢。（3）連接酶完全斷開(kāi)的兩個(gè)平頭雙鏈DNA分子，屬于分子間連接，但速度慢，需高濃度的底物和酶。

4DNA片段的連接：（1）具互補(bǔ)黏性末端片段之間的連接（注意連接前后識(shí)別序列的變化）（2）具平末端DNA片段的連接（3）DNA片段末端修飾后再進(jìn)行連接（4）DNA片段加連桿后連接。（三）甲基化酶

Dam甲基化酶：修飾GATC序列中的腺嘌呤殘基成為5’-甲基腺嘌呤。

Dcm甲基化酶：修飾CC(A/T)GG序列中的胞嘧啶殘基成為5’-甲基胞嘧啶。（四）其他酶1磷性磷酸酯酶2DNA聚合酶（1）大腸桿菌聚合酶（2）T4噬菌體DNA聚合酶（3）Tt噬菌體DNA聚合酶（4）耐高溫DNA聚合酶：主要用于多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）（5）反轉(zhuǎn)錄酶：依靠于RNA的DNA聚合酶。（6）末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶

第四章基因工程載體

（一）載體的功能與特征1概念：載體是在基因工程中，把外源DNA或基因攜帶入宿主細(xì)胞的工具稱為載體。2功能：（1）運(yùn)輸外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞（2）為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力（3）為外源基因擴(kuò)增和表達(dá)提供條件

3載體藍(lán)本：自然存在的質(zhì)粒，噬菌體，病毒DNA，對(duì)其再進(jìn)行修飾、改造、構(gòu)建成多種功能的載體DNA分子。

4載體具備的條件：具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)具有較高的外源DNA裝載能力具有多種單一的限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)、切割位點(diǎn)具有適合的刷選標(biāo)記載體的安全性載體的本質(zhì)是DNA與外源基因連接導(dǎo)入的受體細(xì)胞并能復(fù)制進(jìn)行表達(dá)。5載體的分類：

根據(jù)來(lái)源和性質(zhì)分類：質(zhì)粒載體、噬菌體載體、粘粒載體、噬菌粒載體、病毒載體、人工染色體載體。

根據(jù)功能和用途分類：克隆載體、表達(dá)、測(cè)序、轉(zhuǎn)化、穿梭、多功能載體（二）質(zhì)粒載體

1質(zhì)粒的基本特征：自主復(fù)制、不相容性、可擴(kuò)增、可轉(zhuǎn)移和不相容性。

質(zhì)粒載體的三種共同成分：復(fù)制起點(diǎn)、刷選標(biāo)記和克隆位點(diǎn)（一般人工構(gòu)建的質(zhì)粒是單復(fù)制子）

2質(zhì)粒載體的改造與構(gòu)建：自然質(zhì)粒的局限性

質(zhì)粒載體必備條件：具有復(fù)制起始位點(diǎn)、抗性基因、多克隆位點(diǎn)和較小的分子量（易于操作）和較高的拷貝數(shù)（可以獲得大量的克隆基因）質(zhì)粒載體改造與構(gòu)建的指導(dǎo)思想

常見(jiàn)質(zhì)粒載體類型：克隆質(zhì)粒載體、表達(dá)質(zhì)粒載體、多功能質(zhì)粒載體和穿梭質(zhì)粒載體。

藍(lán)白斑刷選原理3質(zhì)粒DNA的提取4質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性（三）λ噬菌體載體1λ噬菌體的生物學(xué)特性

2λ噬菌體的構(gòu)建（1）野生型λ噬菌體的局限性（2）λ噬菌體的構(gòu)建3λ噬菌體的主要類型：插入型取代型4λ-DNA的提取

5λ噬菌體載體的應(yīng)用：基因文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的構(gòu)建6λ噬菌體作為載體的優(yōu)點(diǎn)：刷選便利提取便利7基因工程克隆策略：分、切、接、轉(zhuǎn)、刷、增8λ噬菌體載體的克隆步驟：（1）通過(guò)裂解過(guò)程增值載體

（2）載體與外源DNA的酶切（挑揀目的基因）（3）載體與外源DNA的連接（4）重組噬菌體的體外包裝（5）包裝噬菌體顆粒的感染（6）刷選

（四）粘性載體（柯斯質(zhì)粒載體，cosmid載體）

1cosmid載體的構(gòu)建：1978發(fā)明白柯斯質(zhì)粒載體，具有cos位點(diǎn)的質(zhì)粒概念：是一類有人工構(gòu)建的含有DNA的cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特別類型的質(zhì)粒載體（復(fù)制起點(diǎn)、抗性標(biāo)記、cos位點(diǎn)）具有λ噬菌體的高效感染能力和質(zhì)粒易于克隆的優(yōu)點(diǎn)，有31-45kb的裝載能力。而且能夠被包裝成具有感染性能力的噬菌體顆粒。

2cosmid載體的特點(diǎn)：（1）具有λ噬菌體的特征，不形成溶菌周期（以大腸桿菌形式表現(xiàn)而不是噬菌斑）（2）具有質(zhì)粒載體的特性（3）具有高容量的克隆能力3使用cosmid克隆載體的基本程序Cosmid載體的缺點(diǎn)：（1）載體片段自我連接（2）外源DNA的自我連接（3）多個(gè)本來(lái)不在一起的外源DNA連接起來(lái)，同時(shí)插入與載體上。（五）單鏈絲狀噬菌體載體

1生物學(xué)特性（1）外形呈絲狀（2）由外殼蛋白和正DNA組成（3）全長(zhǎng)6407個(gè)核苷酸（4）至少有10個(gè)基因2構(gòu)建：p116

（六）人工染色體載體146-147

（七）噬菌體載體及其他病毒載體

第五章目的基因的獲取

1目的基因：需要研究的基因2目的基因的制備：

（1）直接分開(kāi)法：限制性核酸內(nèi)切酶酶切分開(kāi)法基因分開(kāi)的物理化學(xué)法雙抗體免疫發(fā)分開(kāi)編碼蛋白的基因利用酶促反轉(zhuǎn)錄法直接從特定的mRNA分開(kāi)基因（2）構(gòu)建基因組文庫(kù)分開(kāi)法

DNA文庫(kù)：消減雜交文庫(kù)、表達(dá)