大腸桿菌培養(yǎng)感受態(tài)制備質粒轉化及鑒定

本文格式為Word版，下載可任意編輯——大腸桿菌培養(yǎng)感受態(tài)制備質粒轉化及鑒定大腸桿菌的培養(yǎng)

1.LB培養(yǎng)基配制：（液體培養(yǎng)基）①取1L的燒杯，參與適量的一蒸水（＜1000ml），稱取胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,Nacl10g倒入燒杯中

②參與磁子攪拌，至完全溶解③用NaoH調PH=7.0，定容至1L④分裝后高壓蒸汽滅菌（固體培養(yǎng)基）

①在液體培養(yǎng)基的基礎上參與瓊脂糖：1L液體培養(yǎng)基→15g瓊脂糖（用水先溶解）②在電爐子上邊加熱邊攪拌至煮沸溶解③分裝后高壓滅菌

抗生素的參與溫度要求：高壓滅菌后，將溶化的LB固體培養(yǎng)基置與55℃的水浴中，待培養(yǎng)基溫度降到55℃時（手可觸摸）參與抗生素，以免溫度過高導致抗生素失效，并充分搖勻。本卷須知：

①電爐子溫度不要太高，燒杯直接加熱時電爐子上要加石棉網高壓滅菌時，瓶蓋上要插上針頭，防止滅菌時瓶蓋噴出2.倒平板：

培養(yǎng)皿要提前進行滅菌、烘干，在超凈工作臺里，開啟酒精燈，在酒精燈的火焰旁進行操作，倒完后做好標記

3.接種（平板劃線分開法）：

接種環(huán)挑取大腸桿菌進行接種：圖式：

注意：每次劃線前接種環(huán)都要灼燒滅菌，再冷卻。4.37°恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)：

接種好的培養(yǎng)皿正置15分鐘，然后倒置放入培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)

倒置培養(yǎng)原因：恒溫培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中的水分會以水蒸汽的形式蒸發(fā)，倒置培養(yǎng)皿則會使水蒸汽凝結成水滴留在蓋上。假使正方，則水分形成的水滴會落入培養(yǎng)基表面并擴散開。假使培養(yǎng)皿中已形成菌落，則會導致菌隨水擴散，很難再分成單菌落，達不到分開目的。

大腸桿菌感受態(tài)的制備及轉化

感受態(tài)：細菌處于簡單吸收外源DNA的狀態(tài)叫感受態(tài)。

轉化：是指質粒DNA或以它為載體構建的重組子導入細菌的過程。一、制備：步驟

從大腸桿菌DH5α的培養(yǎng)平板上挑取一個單菌落接于2mL

LB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。

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以1%的接種量將以上過夜培養(yǎng)物接種于液體培養(yǎng)基中

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37℃振蕩培養(yǎng)2～3h

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將菌液轉移到50mL離心管中，冰上放置10min

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4000rpm，離心10min回收細胞

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倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以便培養(yǎng)液流盡

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用冰冷的0.1mol/LCaCl210mL，懸浮沉淀

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馬上放在冰上保溫30min

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4℃，4000rpm，離心10min，回收細胞

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用冰冷的0.1mol/LCaCl22mL懸浮細胞（務必放冰上）

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分裝細胞，每200μl一份。此細胞為感受態(tài)細胞。

二、轉化：步驟：

在200μl新鮮配制的感受態(tài)細胞中參與質粒DNA2μl(≤50ng)，

混勻同時做以下對照管

（受體菌對照：200μl感受態(tài)細菌+2μl無菌水質粒對照：200μl0.1mol/LCaCl2溶液+2μl質粒）

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冰上放置30min

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將管放到42℃循環(huán)水浴熱沖擊90s

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取出，迅速冰浴2min

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每管加800μlLB液體培養(yǎng)基，37℃慢搖復蘇1h

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取50μl已轉化的感受態(tài)細胞或對照樣品，各分別涂在含有或不含有氨芐青霉素的培養(yǎng)皿中

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待吸干菌液后，倒置培養(yǎng)皿，于37℃培養(yǎng)過夜

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次日在含氨芐青霉素的培養(yǎng)皿上長的菌落即為含有質粒的大腸桿菌（即轉化成功）

質粒DNA的提取

1.溶液：

溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTris（pH=8.0）、10mmol/LEDTA溶液Ⅱ：0.4mol/LNaoH、2%SDS溶液Ⅲ：5mol/L醋酸鉀（KAc）：60ml、冰醋酸：11.5ml、H2O：28.5ml2.步驟：

在錐形瓶中參與100mL液體培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基中參與100ul氨芐青霉素

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挑取單菌落接種于錐形瓶中，37℃培養(yǎng)過夜

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次日，取1.5ml培養(yǎng)物于EP管中，4000rpm離心2min

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吸去培養(yǎng)液，使細菌沉淀盡可能枯燥

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將細菌沉淀懸浮于100ul溶液Ⅰ中，充分混勻，室溫放置10min

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加200ul溶液Ⅱ（新鮮配制），蓋緊管皿，輕柔混勻混合物，冰上放置5min

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參與150ul預冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口，顛倒數次使混勻，冰上放置15min

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12000rpm離心15min，將上清轉移至另一EP管

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向上清中參與等體積的氯仿（去蛋白），反復混勻，12000rpm離心5min，將上清轉移至另一EP管

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向上清中參與2倍體積的無水乙醇，混勻后，室溫放置5～10min，12000rpm離心5min，倒去上清液，把EP管倒扣在吸水紙上，吸干液體

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用1ml70%乙醇洗滌質粒DNA沉淀，震蕩并離心，

倒去上清液，真空抽干或空氣中枯燥

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參與20ulTE緩沖液或無菌水，溶解DNA，-20℃保存

3.本卷須知：

①在混勻時，不能猛烈震蕩，動作一定要輕柔。

②氯仿抽提完，轉移上清時，一定不要吸到中間蛋白層，寧少勿多。

質粒DNA的鑒定

瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA

步驟：

1.制備瓊脂糖凝膠電泳：在錐形瓶中參與45ml0.5×TBE緩沖液，稱取0.45g瓊脂糖放入

錐形瓶中，置微波爐中2min，中火加熱至完全熔化，取出搖勻，則為1%的瓊脂糖凝膠。2.待瓊脂糖凝膠冷卻至70℃時，參與10ul溴化乙錠（Eb）

3.取有機玻璃內槽，洗凈晾干，用橡皮膏將有機玻璃內槽的兩端邊緣封好，一定要封嚴，放好梳子

4.將冷到60℃瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入有機玻璃內槽，直至有機玻璃板上形成一層均勻的膠面（注意不要形成氣泡）

5.目視凝膠凝固后，再過半個小時，取出梳子，取下橡皮膏，放在電泳槽內，參與0.5×TBE緩沖液至電泳槽中，加至液面剛沒過膠板約1mm

6.加樣：將buffer（染料）與被測DNA混合，用移液槍將樣品參與到梳子孔中，對照滴在最下面的孔

7.電泳：接通電源，調理電壓120V、電流80mA

8.觀測結果：在將膠板放在紫外燈下，連接電腦，拍照。

氨芐青霉素（ampicillin）（100mg/ml）

溶解1g氨芐青霉素鈉鹽于足量的水中，最終定容至10ml。分裝成小份于-20℃貯存。常以25ug/ml～50ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基。羧芐青霉素（carbenicillin）（50mg/ml）

溶解0.5g羧芐青霉素二鈉鹽于足量的水中，最終定容至10ml。分裝成小份于-20℃貯存。常以25ug/ml～50ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基。甲氧西林（methicillin）（100mg/ml）

溶解1g甲氧西林鈉于足量的水中，最終定容至10ml。分裝成小份于-20℃貯存。常以37.5ug/ml終濃度與100ug/ml氨芐青霉素一起添加于生長培養(yǎng)基?？敲顾兀╧anamycin）（10mg/ml）

溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最終定容至10ml。分裝成小份于-20℃貯存。常以10ug/ml～50ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基。氯霉素（chloramphenicol）（25mg/ml）

溶解250mg氯霉素足量的無水乙醇中，最終定容至10ml。分裝成小份于-20℃貯存。常以12.5ug/ml～25ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基。鏈霉素（streptomycin）（50mg/ml）

溶解0.5g鏈霉素硫酸鹽于足量的無水乙醇中，最終定容至10ml。分裝成小份于-20℃貯存。常以10ug/ml～50ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基。萘啶酮酸（nalidixicacid）（5mg/ml）

溶解50mg萘啶酮酸鈉鹽于足量的水中，最終定容至10