流式細(xì)胞術(shù)的工作原理與發(fā)展綜述

班級(jí)：臨床醫(yī)學(xué)（五年制）1507班姓名：劉香賀學(xué)號(hào)：2201150724流式細(xì)胞術(shù)的工作原理與發(fā)展綜述摘要：流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速、精確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的新技術(shù)。是一項(xiàng)多學(xué)科交叉研究的結(jié)晶。流式細(xì)胞術(shù)及流式細(xì)胞儀的出現(xiàn)融合了醫(yī)學(xué)，計(jì)算機(jī)學(xué)，物理學(xué)等眾多學(xué)科背景。。它不僅測(cè)量速度快、準(zhǔn)確度好、靈敏度高，而且還具有客觀、直接和測(cè)量參數(shù)多的優(yōu)點(diǎn)。目前，該技術(shù)已普遍應(yīng)用于腫瘤學(xué)、血液學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)等領(lǐng)域。本文針對(duì)其發(fā)展歷史及當(dāng)前應(yīng)用作一綜述。流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速、精確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的新技術(shù)。從其發(fā)明到如今在臨床和實(shí)驗(yàn)室的廣泛應(yīng)用，每一步都凝結(jié)了電子技術(shù)、流體力學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、激光技術(shù)、生物學(xué)、生物技術(shù)、高等數(shù)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)、有機(jī)化學(xué)和生物物理學(xué)等學(xué)科知識(shí)。流式細(xì)胞術(shù)最大的特點(diǎn)是能在保持細(xì)胞及細(xì)胞器或微粒的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞的狀態(tài)下，通過熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲取多種信號(hào)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量分析或純化分選。因其在量上的準(zhǔn)確性及其在質(zhì)上的特異性，流式細(xì)胞術(shù)在藥學(xué)，腫瘤學(xué)、血液學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)，生物材料等眾多研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用也取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。流式細(xì)胞術(shù)的工作原理流式細(xì)胞術(shù)的基本原理和方法是將待測(cè)樣品(如細(xì)胞、染色體、精子或細(xì)菌等)經(jīng)熒光染料染色后，制成樣品懸液，排成單列的樣品經(jīng)流動(dòng)室的噴嘴噴出成為樣品液流，與激光束相交時(shí)，樣品被激發(fā)產(chǎn)生熒光，熒光檢測(cè)器為光電倍增管，同時(shí)還可以光電二極管檢測(cè)與樣品大小有關(guān)的散射光，而散射光又分為前向散射光（FS）與側(cè)向散射光（SS）（詳見后述）測(cè)得的FS與SS信號(hào)通過計(jì)算機(jī)處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號(hào)對(duì)未染色的活細(xì)胞進(jìn)行分析或分選。流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞的分析要基于流式細(xì)胞儀才能實(shí)現(xiàn)。流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)分為三部分——液流系統(tǒng)，光學(xué)系統(tǒng)，數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。首先待測(cè)細(xì)胞或微粒進(jìn)入液流系統(tǒng)，待測(cè)細(xì)胞或微粒進(jìn)行熒光染色后制成懸液標(biāo)本,在一定氣體壓力下將待測(cè)樣品壓入流動(dòng)室,用不含細(xì)胞或微粒的緩沖液(又稱鞘液)在高壓下從鞘液管噴出,鞘液管入口方向與待測(cè)細(xì)胞或微粒流成一定角度,使鞘液包繞著細(xì)胞或微粒高速流動(dòng),形成一個(gè)圓形的流束(即鞘流),待測(cè)細(xì)胞在鞘液的包裹下單行排列,依次通過流式細(xì)胞儀的檢測(cè)區(qū)域。（如下圖）繼而液流進(jìn)入光學(xué)系統(tǒng)，液流通過測(cè)量區(qū)的細(xì)胞被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，在與入射光束和液柱垂直方向放置光學(xué)系統(tǒng)(透鏡光欄、濾片、檢測(cè)器)用以收集信號(hào)（如下圖）細(xì)胞在液柱中與激光束相交時(shí)向周圍360°立體角方向散射的光線信號(hào)，它的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小、形狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關(guān)，（如下圖）主要分為前向散射光和側(cè)向散射光。（前向散射光（forwardscatter,FS）：激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以相對(duì)軸較小角度(0.5°～10°)向前方散射的訊號(hào)用于檢測(cè)細(xì)胞等粒子的表面屬性，信號(hào)強(qiáng)弱與細(xì)胞體積大小成正比。側(cè)向散射光（sidescatter,SS）：激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以90°角散射的訊號(hào)，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性。）。這些熒光信號(hào)的強(qiáng)度代表所測(cè)細(xì)胞膜表面抗原的強(qiáng)度或其細(xì)胞內(nèi)、核內(nèi)物質(zhì)的濃度,經(jīng)光電倍增管接收后可轉(zhuǎn)換為電信號(hào),再通過模/數(shù)轉(zhuǎn)換器,將連續(xù)的電信號(hào)轉(zhuǎn)換為可被計(jì)算機(jī)識(shí)別的數(shù)字信號(hào)。計(jì)算機(jī)采集所測(cè)量到的各種信號(hào)進(jìn)行計(jì)算處理,將分析結(jié)果顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上,也可以打印出來,還可以數(shù)據(jù)文件的形式存儲(chǔ)在硬盤上,以備日后的查詢或進(jìn)一步分析。檢測(cè)數(shù)據(jù)的顯示視測(cè)量參數(shù)的不同而有多種形式可供選擇。單參數(shù)數(shù)據(jù)以直方圖的形式表達(dá),其x軸為測(cè)量的散射光或熒光的強(qiáng)度(可以是線性軸,也可以選擇對(duì)數(shù)軸),縱軸為相對(duì)細(xì)胞數(shù)。一般來說,流式細(xì)胞儀坐標(biāo)軸的分辨率有256或1024通道數(shù),這視其模/數(shù)轉(zhuǎn)換器的分辨率而定。對(duì)于雙參數(shù)或多參數(shù)數(shù)據(jù),既可以單獨(dú)顯示每個(gè)參數(shù)的直方圖,也可以選擇二維的散點(diǎn)圖、等高線圖或三維的立體視圖等。由此可僅用散射光信號(hào)對(duì)未染色的活細(xì)胞進(jìn)行分析或分選。（分選原理如上圖5）流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展歷史流式細(xì)胞術(shù)是20世紀(jì)70年代初發(fā)展起來的一項(xiàng)高新技術(shù),80年代開始從基礎(chǔ)研究發(fā)展到臨床醫(yī)學(xué)研究及疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè)。我國(guó)在80年代初引進(jìn)了第一臺(tái)流式細(xì)胞儀。具體發(fā)展歷程如下[1]：1930年,Casperrsson和Thorell開始致力于細(xì)胞的計(jì)數(shù);1934年,Moldaven是世界上最早設(shè)想使細(xì)胞檢測(cè)自動(dòng)化的人,他試圖用光電儀記錄流過1根毛細(xì)管的細(xì)胞數(shù)量;1936年,Caspersson等引入顯微光度術(shù);1940年,Coons提出用結(jié)合熒光素的抗體去標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的特定蛋白;1947年,Guclcer運(yùn)用層流和湍流原理研制煙霧微粒計(jì)數(shù)器;1949年,Coulter提出在懸液中計(jì)數(shù)粒子的方法并獲得專利;1950年,Caspersson用顯微分光光度計(jì)在紫外(UV)和可見光光譜區(qū)檢測(cè)細(xì)胞;1953年,Croslannd-Taylor應(yīng)用分層鞘流原理,成功地設(shè)計(jì)紅細(xì)胞光學(xué)自動(dòng)計(jì)數(shù)器;1953年,Parker和Hutcheon描述一種全血細(xì)胞計(jì)數(shù)器裝置,成為流式細(xì)胞儀的雛形;1954年,Beirne和Hutchcon發(fā)明光電粒子計(jì)數(shù)器;1959年,B型Coulter計(jì)數(shù)器問世;1965年,Kamemtsky等提出兩個(gè)設(shè)想:(1用分光光度計(jì)定量細(xì)胞成分;(2)結(jié)合測(cè)量值對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類;1967年,Kamemtsky和在.Moldaven的方法基礎(chǔ)上提出細(xì)胞分選的方法;1969年,VanDillaFulwyler及其同事們?cè)贚osALmos,NM(現(xiàn)在的NationalFlowCytometryResourceLabs)發(fā)明第一臺(tái)熒光檢測(cè)細(xì)胞計(jì);1972年,Herzenberg研制出一個(gè)細(xì)胞分選器的改進(jìn)型,能夠檢測(cè)出經(jīng)熒光標(biāo)記抗體染色的細(xì)胞的較弱的熒光信號(hào);1975年,Kochler和Milstein提出單克隆抗體技術(shù),為細(xì)胞研究中大量的特異性免疫試劑的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用3.1流式細(xì)胞術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用3.1.1流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用[2]癌細(xì)胞與正常體細(xì)胞最明顯的區(qū)別就是細(xì)胞DNA含量發(fā)生改變或形態(tài)異常，以及細(xì)胞生長(zhǎng)周期的改變。利用FCM進(jìn)行細(xì)胞周期分析、DNA倍體分析、定量分析檢測(cè)細(xì)胞增殖標(biāo)志物、細(xì)胞表面標(biāo)志、癌基因蛋白產(chǎn)物、耐藥蛋白、細(xì)胞凋亡等,從而獲得組織形態(tài)學(xué)方法難以得到的信息,可為腫瘤的臨床診斷、治療和預(yù)防提供幫助。3.1.2流式細(xì)胞術(shù)在血液學(xué)中的應(yīng)用血液中的細(xì)胞在發(fā)育過程中細(xì)胞表面表達(dá)出不同的抗原，利用特有的熒光標(biāo)記可以檢測(cè)其熒光強(qiáng)度判斷血細(xì)胞發(fā)育生長(zhǎng)正常與否，尤其在急性白血病的診斷中，利用不同類型白細(xì)胞表面表達(dá)出的抗原種類及量的不同，流式細(xì)胞術(shù)能夠較為客觀地診斷急性白血病及其分型，也能夠檢測(cè)出骨髓正常細(xì)胞中萬分之一的白血病細(xì)胞，進(jìn)行微小殘留病的檢測(cè)。此外，在造血干細(xì)胞移植后，需使用流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測(cè)移植患者免疫重建的狀況，如淋巴細(xì)胞亞群分析。流式細(xì)胞術(shù)在治療關(guān)于血小板減少的疾病[3]中也起到了重要作用。外周血小板減少的病因主要有:(1)骨髓造血功能障礙;(2)血小板破壞過多;(3)儲(chǔ)存池異常。網(wǎng)織血小板檢測(cè)能夠較好地區(qū)分血小板減少的病因。網(wǎng)織血小板內(nèi)部含有殘存的RNA，噻唑橙(TO)可與血小板內(nèi)的RNA結(jié)合，發(fā)出綠色熒光。其熒光強(qiáng)度與RNA含量正相關(guān)。由此，可以檢測(cè)網(wǎng)織血小板的百分含量。骨髓造血機(jī)能障礙引起的血小板減少(再生障礙性貧血)，網(wǎng)織血小板下降;免疫性血小板破壞增加導(dǎo)致的血小板減少(特發(fā)性血小板減少性紫癜)網(wǎng)織血小板上升[4]也可以用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板相關(guān)免疫球蛋白來確定免疫性血小板減少[5]。進(jìn)一步可以檢測(cè)血小板釋放的微粒(plateletmicroparticles，PMPs)，分析血小板功能。3.1.3流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)中的應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)中對(duì)隨著單克隆抗體技術(shù)、熒光色素化學(xué)等技術(shù)的發(fā)展,流式細(xì)胞術(shù)成為當(dāng)代技術(shù)的“雜交體”。正像免疫學(xué)作為一種不斷發(fā)展的學(xué)科和技術(shù)手段延伸到生物、醫(yī)學(xué)及其他領(lǐng)域一樣,流式細(xì)胞術(shù)也以它的快速、靈活和定量的特點(diǎn),廣泛地被應(yīng)用于免疫理論研究臨床實(shí)踐應(yīng)用的各方面,所以有人稱之為現(xiàn)代免疫技術(shù)基石之一。尤其同單克隆抗體結(jié)合應(yīng)用,在免疫分型、分選、腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)督、機(jī)體免疫狀態(tài)的監(jiān)測(cè)、免疫細(xì)胞的系統(tǒng)發(fā)生及特性研究等方面都起著相當(dāng)重要的作用。[6]3.2流式細(xì)胞術(shù)在藥學(xué)中的應(yīng)用[7]流式細(xì)胞術(shù)作為一種在細(xì)胞、受體及分子水平的定量分析方法,在藥物濫用，多藥耐藥基因，體外藥敏實(shí)驗(yàn)的研究中已成為一種非常重要的手段。例如：傳統(tǒng)的藥物敏感試驗(yàn)的方法包括試管肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法,以及紙片擴(kuò)散法、微量稀釋法和E-試驗(yàn)等。此等方法忽略細(xì)胞個(gè)體間的異質(zhì)性,通常僅提供群體細(xì)胞的均值,且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。將流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用于細(xì)菌藥試驗(yàn),用熒光探針來標(biāo)記細(xì)菌細(xì)胞的特征,通過儀器測(cè)定藥物對(duì)細(xì)菌個(gè)體生長(zhǎng)的影響,可以檢測(cè)到群體中具有異質(zhì)性的菌細(xì)胞,因此較其他方法更為準(zhǔn)確、敏感和快速。在國(guó)外FCM甚至已被建議作為細(xì)菌常規(guī)藥敏試驗(yàn)[8]。再如流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)的基礎(chǔ)和臨床研究中都已有很成熟的應(yīng)用;藥物與腫瘤的關(guān)系也有報(bào)道,如:劉屏[9]等用流式細(xì)胞儀觀察了嗎啡依賴小鼠T淋巴細(xì)胞周期的變化情況,發(fā)現(xiàn)胸腺細(xì)胞的DNA合成期和增殖分裂期均受到抑制。3.3應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)注意的問題3.3.1熒光檢測(cè)[10]實(shí)驗(yàn)過程中，流式細(xì)胞儀所檢測(cè)到的熒光信號(hào)主要包括三部分:(1)細(xì)胞自發(fā)熒光。來自于細(xì)胞代謝過程中的自發(fā)熒光的分子，如核黃素、細(xì)胞色素等，其含量越高，自發(fā)熒光越強(qiáng);(2)非特異性結(jié)合。標(biāo)記熒光素的抗體，除了與細(xì)胞表面的抗原特異性結(jié)合外，其Fc段也可與細(xì)胞表面Fc受體結(jié)合，以及抗體蛋白與細(xì)胞蛋白質(zhì)之間的吸附作用;(3)特異性結(jié)合。這是單克隆抗體與細(xì)胞抗原的特異性結(jié)合。前兩種熒光為實(shí)驗(yàn)“噪音”，后一種熒光是我們需要的信號(hào)。為了得到正確的檢驗(yàn)結(jié)果，必須排除前兩種熒光的干擾。主要方法是以同型對(duì)照為參照，來確定檢測(cè)細(xì)胞是否表達(dá)相應(yīng)抗原。需要強(qiáng)調(diào)的是不同細(xì)胞自發(fā)熒光強(qiáng)度不同，在外周血里面，單核細(xì)胞自發(fā)熒光最強(qiáng)，粒細(xì)胞次之，淋巴細(xì)胞最弱，培養(yǎng)的細(xì)胞自發(fā)熒光更強(qiáng)。3.3.2正確設(shè)門得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果后，先正確設(shè)門才能進(jìn)行有意義的分析比較，例如下圖6中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，若在103處設(shè)門，則實(shí)驗(yàn)比較不出結(jié)果。3.3.3熒光補(bǔ)償多色流式細(xì)胞術(shù)分析，各種熒光顏色之間會(huì)相互干擾，需要用補(bǔ)償減去干擾的光源。不同熒光素發(fā)出的熒光，以及熒光的強(qiáng)弱都影響補(bǔ)償值，也與儀器的濾光片狹縫有關(guān)。做補(bǔ)償調(diào)節(jié)的原則，應(yīng)以“橫平豎直”為準(zhǔn)。不同儀器、不同細(xì)胞、不同廠家試劑，其補(bǔ)償值各不相同。如何做好熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)，是流式細(xì)胞分析操作的難點(diǎn)，尤其在檢測(cè)弱抗原表達(dá)時(shí)候，會(huì)直接影響檢測(cè)結(jié)果。流式細(xì)胞術(shù)新技術(shù)[11]4.1液相芯片技術(shù)生物芯片技術(shù)是近年來隨著人類基因組計(jì)劃和蛋白質(zhì)組計(jì)劃的進(jìn)展在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù),現(xiàn)已被大家所熟知。將生物芯片技術(shù)和FCM有機(jī)結(jié)合在一起,把不同生物探針(核酸、蛋白等)標(biāo)記在各種有熒光的微球上,以熒光標(biāo)記微球作為反應(yīng)載體在液相系統(tǒng)中完成生物學(xué)反應(yīng),即為流式細(xì)胞術(shù)液相芯片技術(shù)。它組成由微球體+探針+目的分子+報(bào)告分子的一種簡(jiǎn)單反應(yīng)模式?？梢栽谕灰合嘀型瑫r(shí)檢測(cè)多個(gè)目的分子。如對(duì)血液中多種白細(xì)胞介素檢測(cè)。4.2定量流式細(xì)胞分析定量流式細(xì)胞分析(quantitativeflowcytometryQFCM)是指用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞或微粒上標(biāo)記熒光分子的定量分析,從而對(duì)細(xì)胞的生物分子進(jìn)行精確測(cè)量。如每個(gè)分子表達(dá)的平均分子數(shù)、抗原數(shù)等。定量流式細(xì)胞分析不同于以往的相對(duì)熒光強(qiáng)度或陽性細(xì)胞百分率測(cè)量,它更為準(zhǔn)確、靈敏。為FCM的發(fā)展趨勢(shì)。如在獲得性免疫缺陷綜合癥和“非典”的研究與治中,對(duì)外周血中的CD4+T淋巴細(xì)胞進(jìn)行絕對(duì)記數(shù),來反映病情進(jìn)展及監(jiān)測(cè)療效。小結(jié)本文只是簡(jiǎn)要介紹了一些關(guān)于流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用，其應(yīng)用范圍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止這些，在多學(xué)科的交叉發(fā)展下，流式細(xì)胞術(shù)會(huì)有更廣闊的發(fā)展空間和應(yīng)用范圍。參考文獻(xiàn)：[1][6][10][11]魏熙胤,牛瑞芳.流式細(xì)胞儀的發(fā)展歷史及其原理和應(yīng)用進(jìn)展[J].現(xiàn)代儀器,2006,04:8-11[2]陳麗.流式細(xì)胞術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的研究進(jìn)展[J].右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2016,03:335-337.[3]陳軍浩.流式細(xì)胞術(shù)在臨床及科研中的應(yīng)用[J].臨床檢驗(yàn)雜志,2012,10:861-864[4]寧宇，連小珂，王留興．流式細(xì)胞學(xué)細(xì)胞周期分析預(yù)測(cè)晚期食管癌化療療效［J］．胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2006，15(2):144-146．[5]尹亞飛，羅自勉，周新伏，等．血小板相關(guān)抗體在特發(fā)性血小板減少性紫癜診