聚合物基液相色譜整體柱的制備及在HPLC中的應(yīng)用

.-...z摘要【摘要】本文采用原位逐步聚合反響，以PEG–1540：環(huán)氧樹脂：二乙烯三胺質(zhì)量比為:8:4:1，在色譜空管柱(50mm×4.6mmi.d)內(nèi)制備了新型的環(huán)氧樹脂基聚合物整體柱；電鏡觀察其內(nèi)部孔構(gòu)造非常豐富，存在大量的貫穿孔；紅外光譜表征發(fā)現(xiàn)柱外表存在大量羥基基團(tuán)?？疾炝肆魉?、酸堿度和有機(jī)溶劑對煙酸和煙酰胺兩種模型分析物在整體柱上保存和別離的影響；在室溫下，100%純水流動(dòng)相，流速為1.0mL·min-1時(shí)，煙酸和煙酰胺可以在色譜柱(50mm×4.6mmi.d)上2min內(nèi)快速別離，別離度為0.83?！娟P(guān)鍵詞】聚合物；整體柱；固定相；高效液相色譜；環(huán)氧樹脂Synthesisandcharacteristicsstudyofepo*yresin-basedliquidchromatographicmonolithiccolumn【ABSTRACT】Anovelepo*yresin-basedpolymermonolithiccolumnispreparedfromPEG-1540,epo*yresin,diethlenetriaminewiththemassratiois8:4:1inthestainlesssteelchromatographiccolumns(50mm×4.6mmi.d)byin-situstep-additionpolymerization.Thecolumnhaslargethrough-poresandhydro*ylshadbeencharacterizedbyscanningelectronmicroscopyandFT-IR.Thechromatographicperformanceofnicotinamideandnicotinicacidonthemonolithiccolumnisevaluated.Thecontentofflowrate,pHandorganicsolventwereinvestigatedinthee*periment.Rapidseparationofnicotinamideandnicotinicacidisachievedwith100%purewaterasmobilephasein2.0minatflowrateof1.0mL·min-1.Theresolutionis0.83.【KEYWORDS】Polymer;MonolithicColumn;StationaryPhase;HPLC;Epo*yResin目錄1引言11.1整體材料及其應(yīng)用簡介11.2整體材料的分類及其制備方法11.2.1 有機(jī)聚合物整體柱的制備 基于聚丙烯酞胺的整體柱基于聚苯乙烯的整體柱基于聚丙烯酸酯的整體柱21.2.2 硅膠整體柱的制備 21.2.3顆粒固定化型整體柱的制備 31.3整體柱的特征及應(yīng)用31.3.1整體柱的特征31.3.2整體柱在HPLC的應(yīng)用41.4整體材料的優(yōu)缺點(diǎn) 41.5固相萃取 52實(shí)驗(yàn)局部62.1 實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)試劑62.1.1 儀器62.1.2 試劑與規(guī)格62.1.3色譜整體柱的制備 72.1.4色譜實(shí)驗(yàn)72.2結(jié)果與討論82.2.1致孔劑成孔機(jī)理及柱性能表征82.2.2聚合物整體柱的紅外光譜分析92.2.3整體柱制備的重現(xiàn)性102.2.4溶脹度測定與分析102.2.5環(huán)氧樹脂基聚合物整體柱的色譜評價(jià)流速對整體柱柱壓降的影響流速對整體柱保存和別離的影響流動(dòng)相組成對整體柱保存和別離的影響流動(dòng)相中有機(jī)溶劑對整體柱別離的影響快速別離142.3小結(jié)15參考文獻(xiàn)17致謝19附錄一、文獻(xiàn)綜述20附錄二、文獻(xiàn)翻譯27-.z1、引言1.1整體材料及其應(yīng)用簡介整體材料通常是由單體、引發(fā)劑、致孔劑等混合物通過原位聚合制備而成的,其幾何形狀大多為棒狀柱體，故常見的名稱有整體柱、連續(xù)床或連續(xù)棒[1]等。整體柱構(gòu)造具有多孔性、高通透性和大的比外表積，使其在別離分析工作中能夠到達(dá)高通量、高效快速和低背壓，被譽(yù)為繼多聚糖、交聯(lián)與涂漬、單分散之后的第四代色譜填料。整體柱相對于常規(guī)填充柱具有易于改性、柱壓低、制備簡單及傳質(zhì)速度快等優(yōu)點(diǎn)，因此得到極大關(guān)注并被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，特別是色譜領(lǐng)域[2,3]。Svec等[4-7]在這方面做了大量的工作。他們還首次把聚合物整體柱用于固相萃取(SPE)富集待測物[8]。整體柱的特殊優(yōu)勢使其廣泛的應(yīng)用于樣品預(yù)處理中，馮鈺锜等[9]綜述了近年來整體柱在樣品預(yù)處理領(lǐng)域中的應(yīng)用，進(jìn)一步拓寬了整體柱的應(yīng)用*圍。1.2整體材料的分類及其制備方法目前整體材料己被廣泛用于高效液相色譜柱、毛細(xì)管液相色譜柱及毛細(xì)管電色譜柱的制備，對于整體柱的研究和應(yīng)用是當(dāng)前色譜研究的一大熱點(diǎn)。根據(jù)所制備的材料的不同，整體柱可被分為有機(jī)聚合物整體柱和無機(jī)硅膠整體柱。此外，在毛細(xì)管電色譜中還有一種特殊的整體柱形式:顆粒固定化整體柱。有機(jī)聚合物整體柱的制備有機(jī)聚合物整體柱的制備在毛細(xì)管電色譜和高效液相色譜柱中的制備有所不同。有機(jī)聚合物高效液相色譜整體柱的制備是非常簡單的。將單體、交聯(lián)劑、致孔劑和引發(fā)劑的混合溶液參加空管柱中通過或光引發(fā)熱引發(fā)聚合。反響完全后用有機(jī)溶劑除去致孔劑或其它可溶性化合物，即可得到大孔聚合物整體柱。然后通過對其進(jìn)展化學(xué)改性以滿足各種色譜模式的要求。根據(jù)所用單體的不同，有機(jī)聚合物整體柱可分為以下幾種。.1基于聚丙烯酰胺的整體柱丙烯酰胺是一個(gè)親水性很強(qiáng)的單體，通常在水相中聚合制備凝膠，用于凝膠電泳。Hjerten[9]制得含有異丙基的丙烯酰胺凝膠用于疏水色譜別離蛋白質(zhì)。*ie[10]用甲基丙烯酸丁酯與丙烯酰胺共聚合成了聚丙烯酰胺-甲基丙烯酸丁醋疏水整體柱，并成功地用于蛋白質(zhì)的別離。這種聚合物的疏水性可方便的通過改變反響液中甲基丙烯酸丁酯的含量加以控制。.2基于聚苯乙烯的整體柱聚苯乙烯整體柱的制備一般選用氯甲基苯乙烯或苯乙烯為單體，二乙烯基苯為交聯(lián)劑。因?yàn)榫郾揭蚁┩獗砭哂休^強(qiáng)的疏水性，所以可直接用于小分子、膚、生物大分子的反相色譜別離以及聚合物的沉淀一溶解色譜中[11-13]。氯甲基苯乙烯與二乙烯苯的共聚物不僅具有聚苯乙烯的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性，而且含有氯甲基活性官能團(tuán)易于改性。然而苯乙烯外表無活性官能團(tuán)，改性困難。另外，通過調(diào)節(jié)氯甲基苯乙烯的比例，可以改變配體的鍵合密度。Svec等人[14]選用高含量的二乙烯基苯單體以及適宜的致孔劑制得了比外表達(dá)400m2/g的整體柱，且依然具有較好的通透性。Frechet等人[15].3基于聚丙烯酸酯的整體柱聚甲基丙烯酸縮水甘油酯poly(GMA-co-EDMA)是應(yīng)用最為廣泛的聚丙烯酸醋類整體柱。由于它具有環(huán)氧活性官能團(tuán)易于改性，因此可被用于制備多種色譜填料。Viklund用聚2-丙烯酞胺-2-甲基丙磺酸(poly(2-acrvlamido-2-methvl-propanesulfonicacid))在經(jīng)過水解的聚甲基丙烯酸縮水甘油酯整體柱上接枝，得到了強(qiáng)陽離子交換柱。Svec等人[16]用二乙胺與聚甲基丙烯酸縮水甘油酯整體柱反響制得弱陰離子交換柱。硅膠整體柱的制備硅膠整體柱的制備相對復(fù)雜一些，主要有以下兩種方法:一種方法，即溶膠-凝膠法(sol-gel)。首先在PEO[poly(ethyleneo*ide)]的水溶液中參加四甲氧基硅烷(tetrametho*ysilane，TMOS)及催化劑醋酸，在0℃攪拌30min，然后將此混合液參加一聚碳酸醋的柱管中40聚合反響過程如下:縮聚反響:a，Si-OH+Si-OR--Si-0-Si+ROHb，Si-OH+Si-OH--Si-0-Si+H2O水解作用:c，Si(OR)4+H20--Si(OH)(OR)3+ROH由于硅膠在老化和枯燥時(shí)會(huì)收縮，因此得到的硅膠整體柱必須放入聚醚醚酮(PEEK)柱管中用外壓使管壁與柱體緊貼，以防止產(chǎn)生側(cè)壁穿漏。采用這種方法得到的硅膠整體柱的比外表積高達(dá)300-400m2最近，Dulay等[17]在365nm紫外線照射下在毛細(xì)管中單步原位合成了多孔硅連續(xù)床，此柱表現(xiàn)出了反相色譜的特性，可用于低分子量中性化合物如PAHs、烷基苯、烷基苯基酮及類固醇的別離分析。Chen等[18]則在溶膠-凝膠法制柱的根底上再鍵合上L-苯丙酞胺，并在配體交換模式下成功拆分了十二對丹酞化氨基酸消旋體。另一種是先將硅酸鉀的溶液注入石英毛細(xì)管在100℃顆粒固定化型整體柱的制備除無機(jī)硅膠聚合物和有機(jī)聚合物外在毛細(xì)管電色譜整體柱制備中還包括一種特殊的整體柱形式:顆粒固定化整體柱。它是將傳統(tǒng)固定相顆粒用燒結(jié)、溶膠-凝膠技術(shù)方法或利用有機(jī)聚合物聚合使其固載到毛細(xì)管內(nèi)形成顆粒固定化整體柱。此方法制備得到的整體柱同樣具有聚合物型整體柱無塞子的優(yōu)點(diǎn)，在電色譜中得到了較廣泛的應(yīng)用。1.3整體柱的特征及應(yīng)用整體柱的特征整體柱對流動(dòng)相的通透性與它的孔構(gòu)造密切相關(guān)。雖然孔徑大于50nm的大孔對基質(zhì)材料的外表積奉獻(xiàn)很小，但是整體柱中的大孔越多，流動(dòng)相流過時(shí)的柱壓就越低。然而對于色譜別離，填料的外表積要求越大越好。為了獲得大的外表積，基質(zhì)材料中小于2nm的小孔和介于2-50nm的中孔應(yīng)盡可能多。因此，必須兼顧低柱壓和大外表積兩方面的要求。傳統(tǒng)大孔微球外表孔內(nèi)停滯流動(dòng)相的傳質(zhì)阻力是導(dǎo)致峰變寬，影響柱效的主要因素。緩慢的分子擴(kuò)散傳質(zhì)過程特別對于生物大分子是別離速度難以提高的主要原因。由于整體柱中存在著特有的大孔通道允許流動(dòng)相直接流過，并以對流傳質(zhì)取代了緩慢的擴(kuò)散傳質(zhì)，使得樣品的傳質(zhì)阻力大大減小。突破曲線是考察傳質(zhì)動(dòng)力學(xué)的有效工具，理想的突破曲線應(yīng)該是一條垂直的曲線，當(dāng)樣品的吸附速率低于流動(dòng)相的流速時(shí)，突破曲線會(huì)變得平緩。Wang等人[19]的研究說明，對于50*8mmI.D.的交聯(lián)聚苯乙烯整體柱，當(dāng)線流速從200cm/h提高到1000cm/h時(shí)，其柱效根本保持不變。傳統(tǒng)填充柱的另一個(gè)缺點(diǎn)在于柱效受很多因素的影響，重復(fù)性差。甚至對于同一批次的填料一樣的人裝填的柱子，柱效也會(huì)有所差異。然而整體柱不但制備過程簡單而且重復(fù)性也非常好。另外，有機(jī)聚合物整體柱除了有高空間利用率、優(yōu)異的通透性、制備簡單等優(yōu)點(diǎn)外，它在制備時(shí)可以通過選擇不同的單體以到達(dá)各種外表屬性，因而具有不同的選擇性。整體柱在HPLC的應(yīng)用整體材料基質(zhì)目前已被廣泛地用于高效液相色譜別離分析。Frechet等人[20]制備的交聯(lián)聚苯乙烯整體柱被成功地用于苯的同系物、多膚及蛋白質(zhì)的反相色譜別離。在低流速下，整體柱對多肽的別離能力不如硅膠填充柱，但當(dāng)流速為5ml/min時(shí)，五種多膚在整體柱上50秒內(nèi)實(shí)現(xiàn)了基線別離，這在常規(guī)的硅膠填充柱上是不可想象的。Petro等人[21]利用交聯(lián)聚苯乙烯整體柱別離分子量在519-2.95*l06*圍內(nèi)的8種聚苯乙烯低聚物，并將結(jié)果與采用高效體積排阻色譜的別離結(jié)果相比擬，兩*色譜圖上的8個(gè)峰一一對應(yīng)。由于對整體柱進(jìn)展柱上改性費(fèi)時(shí)費(fèi)力，Li等人[22]選擇適宜的單體采用水相體系一步聚合得到弱陽離子交換整體柱，4種蛋白在100*0.025mmI.D.的離子交換柱上實(shí)現(xiàn)了基線別離。Svec等[23]在水解的甲基丙烯酸縮水甘油酯基質(zhì)上接枝反響制備了強(qiáng)陽離子交換柱，3個(gè)蛋白能在1.5min內(nèi)得到別離。*ie[24]制備的交聯(lián)聚丙酰胺-甲基丙烯酸丁酯整體柱同樣也被用于蛋白質(zhì)的疏水色譜別離。當(dāng)進(jìn)樣量從0.36增加至5.84mg時(shí)，蛋白的保存時(shí)間僅發(fā)生微小變化，且蛋白的質(zhì)量回收率超過90%。Zeng等人[25]采用呱嗦二丙烯酞胺、甲基丙烯酞胺及異丙基丙烯酞胺為單體一步聚合得到疏水相互作用整體柱。這種疏水相互作用整體柱的固定相外表疏水性可以通過改變異丙基丙烯酰胺的比例任意調(diào)節(jié)。Hjerten等[26]在聚丙烯胺基質(zhì)上以三嗪染料為配基從酵母提取液中別離出了脫氫酶。Amatschek等[267]以縮氨酸為配基在組合化學(xué)庫中別離出了人凝血因子VIII，采用聚甲基丙烯酸基質(zhì)獲得了更高的吸附容量和選擇性。Luo等人[28,29]分別以蛋白A和鰲合金屬離子為配基在聚甲基丙烯酸基質(zhì)上獲得了蛋白的快速別離。1.4整體材料的優(yōu)缺點(diǎn)整體柱與傳統(tǒng)的填充柱相比有以下顯著優(yōu)點(diǎn)：〔1〕防止了填料顆粒間的空體積，提高了色譜柱的空間利用率?！?〕整體柱內(nèi)部特有的大孔構(gòu)造形成了許多“大通道〞，大大降低了流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱時(shí)產(chǎn)生的柱壓降?！?〕整體柱合成過程簡單，操作方便，色譜性能穩(wěn)定，提高了色譜柱制備的重現(xiàn)性。〔4〕溶質(zhì)在整體柱被以對流傳質(zhì)代替了緩慢的擴(kuò)散傳質(zhì)，大大提高了傳質(zhì)效率。盡管整體柱有許多顯著優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)它也存在一些缺乏:(1)由于整體柱的孔隙率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于填充柱，因此其比外表積和柱容量也都低于填充柱。(2)合成制備型整體柱仍然存在許多問題。(3)聚合物在有機(jī)溶劑中的溶脹收縮效應(yīng)會(huì)降低聚合物整體柱的穩(wěn)定性，另外由于聚合物整體介質(zhì)的孔徑分布*圍很寬，柱效低，特別對于小分子物質(zhì)其柱效遠(yuǎn)低于常規(guī)填充柱。(4)除了與硅膠微球同樣具有的不耐酸堿的缺點(diǎn)外，硅膠整體柱必須放入PEEK柱管中用外壓使管壁與柱體緊貼，以防止產(chǎn)生側(cè)壁穿漏。而這正是制備過程中最困難的一步。用聚合物材料包裹硅膠整體柱以及隨后的化學(xué)鍵合是導(dǎo)致硅膠整體柱重現(xiàn)性差的主要原因。(5)對整體柱的化學(xué)改性一般為柱內(nèi)改性，受很多因素的制約，反響條件難以實(shí)現(xiàn)最優(yōu)化。另外一次反響只能針對一根柱子，效率低。1.5固相萃取固相萃取(SolidPhaseE*traction,SPE)是由液固萃取和柱液相色譜技術(shù)結(jié)合開展而來，是基于液相色譜理論的一種別離、純化方法，包括液相和固相的物理萃取過程。SPE具有富集因數(shù)高、提取速度快、操作簡便、溶劑用量少、易與現(xiàn)代分析儀器聯(lián)用等特點(diǎn)與傳統(tǒng)的液-液萃取相比擬，且能將富集和別離合為一步，是目前樣品預(yù)處理技術(shù)中最簡捷、高效、靈活的一種手段，能夠有效的提高分析靈敏度。根據(jù)固相萃取劑對液相待測物的吸附作用，當(dāng)樣品通過萃取劑時(shí)，其中*些痕量物質(zhì)(目標(biāo)物)就被吸附在萃取劑上，然后用適宜的溶劑將其洗脫下來，即可得到富集、純化的目標(biāo)物。其使用形式有SPE柱、SPE盤和固相微萃取[30]。SPE技術(shù)主要應(yīng)用于樣品的預(yù)處理，別離和富集痕量組分，以提高分析靈敏度[31]。但是通用的固相萃取吸附劑往往存在選擇性差的缺點(diǎn),對非常復(fù)雜的環(huán)境和生物樣品的富集別離效果不夠理想，基于此種實(shí)際需求，能夠有效提高選擇性的分子印跡技術(shù)便應(yīng)運(yùn)而生，成為目前固相萃取領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。本文利用原位逐步聚合反響，按PEG-1540：環(huán)氧樹脂：二乙烯三胺的質(zhì)量比為8:4:1，在50mm×4.6mmi.d的不銹鋼空管柱內(nèi)制備了新型的環(huán)氧樹脂基聚合物整體柱，將其作為色譜固定相，分析了其色譜性能。通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，以純水為流動(dòng)相，煙酸和煙酰胺可在整體柱上實(shí)現(xiàn)快速別離，說明所制備的聚合物整體柱用于色譜固定相的可行性。采用逐步聚合反響制備的環(huán)氧樹脂基聚合物整體柱經(jīng)濟(jì)、環(huán)保，且制備簡單，整體柱性能穩(wěn)定，尤其可以在水環(huán)境下穩(wěn)定使用，可為拓展整體柱的應(yīng)用領(lǐng)域提供借鑒作用。2、實(shí)驗(yàn)局部2.1實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)試劑2.1儀器儀器名稱規(guī)格型號(hào)廠家高效液相色譜儀LC-10ATvp日本島津儀器公司掃描電子顯微鏡S-570系列日本Hitach公司電熱恒溫鼓風(fēng)枯燥箱DGG-9070BD系列**森信實(shí)驗(yàn)儀器**電子天平BS224S系列賽多利斯公司超純水器MILLIPOREACADEMIC美國密理博公司酸度計(jì)PHS-3CT數(shù)字式**群眾分析儀器廠快速混勻器SK-1金壇市順華儀器**超聲波清洗機(jī)DS180A**市海曙達(dá)盛電子儀器廠國產(chǎn)空柱總成50mm×4.6mmi.d銳鋒同創(chuàng)科技**封閉電爐FD-2**曠維實(shí)驗(yàn)室設(shè)備**傅立葉變換紅外光譜儀NICOLET-6700美國熱電儀器**2.2試劑與規(guī)格藥品名稱規(guī)格產(chǎn)地環(huán)氧樹脂**吳江合力樹脂廠二乙烯三胺分析純國藥**化學(xué)試劑**聚乙二醇1540分析純國藥**化學(xué)試劑**三乙胺分析純**化學(xué)試劑總廠甲醇色譜純英國Fisher公司乙腈色譜純英國Fisher公司乙酸分析純**化學(xué)試劑總廠煙酸分析純國藥**化學(xué)試劑**煙酰胺分析純國藥**化學(xué)試劑**整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程溶液的pH值用乙酸和氨水溶液來調(diào)節(jié)。色譜流動(dòng)相使用之前用0.45μm的濾膜過濾，實(shí)驗(yàn)中所用的水均為去離子(DDI)水。2.3色譜整體柱的制備在燒杯中將PEG–1540、環(huán)氧樹脂和二乙烯三胺按質(zhì)量比為：8:4:1混合均勻得到澄清透明粘稠狀液體，震蕩、超聲5min后將其裝入到不銹鋼空管柱(50mm×4.6mmi.d)內(nèi)，兩端密封，放入烘箱內(nèi)60℃恒溫加熱24h。反響完畢后，將兩端柱頭塞子去除，將柱子放入60℃去離子水中超聲2h將柱內(nèi)PEG–1540浸出。然后換上柱頭將柱子連接到HPLC泵上，以100%純水作為流動(dòng)相，在60℃的熱水浴中，利用泵提供的壓力將柱內(nèi)的致孔劑PEG–1540帶走。直到流出的流動(dòng)相內(nèi)觀察不到絮狀液體，柱壓隨流速的增加而穩(wěn)定變化，基線穩(wěn)定水平，完全將未反響的剩余試劑和雜質(zhì)除去(1)色譜整體柱(2)固定相圖4.1制備的色譜整體柱和固定相2.4色譜實(shí)驗(yàn)所有色譜實(shí)驗(yàn)均在島津LC–10A型高效液相色譜儀(Shimadzu,Kyoto,Japan)上完成，包括：兩臺(tái)LC–10ATvp泵、DGU–20A3在線脫氣系統(tǒng)、SPD–10Avp紫外檢測器和Rheodyne7725i手動(dòng)進(jìn)樣器；數(shù)據(jù)采集和處理在N2000色譜工作站(**大學(xué)智達(dá)信息工程**)上完成。除溫度實(shí)驗(yàn)外其他色譜實(shí)驗(yàn)均在室溫下完成。流動(dòng)相為100%純水，流速為1.0mL·min-1，進(jìn)樣量為20μL，以丙酮測定死時(shí)間。保存因子k按公式k=(tR-t0)/t0計(jì)算，其中tR是樣品的保存時(shí)間，t0是采用丙酮測定的死時(shí)間；別離因子α按照公式α=k2/k1計(jì)算，其中k1和k2分別是先被洗脫的組分和后被洗脫的組分保存因子。別離度RS按照公式RS=2(t1-t2)/(w1+w2)計(jì)算，其中t1和t2分別為先被洗脫的組分和后被洗脫的組分的保存時(shí)間，w1和w2分別為兩組份的峰底寬度。3結(jié)果與討論3.1致孔劑成孔機(jī)理及柱性能表征本實(shí)驗(yàn)采用逐步聚合反響來制備環(huán)氧樹脂聚合物整體柱。逐步聚合反響的放熱比自由基聚合低大約4倍，反響速率慢容易控制，對于整體柱中孔構(gòu)造大小及其分布非常有利。環(huán)氧樹脂是重要的膠黏劑品種之一，固化后形成無限大的三維網(wǎng)狀構(gòu)造，具有非常好的韌性和強(qiáng)度。環(huán)氧樹脂整體柱具有優(yōu)良的穩(wěn)定性，耐酸堿性優(yōu)于無機(jī)整體柱，耐溶劑穩(wěn)定性明顯優(yōu)于自由基聚合得到的聚烯烴類整體柱。采用聚乙二醇作為致孔劑不僅環(huán)保，而且其分子量大小和參加比例對于相別離過程有顯著影響，容易調(diào)節(jié)整體柱的孔構(gòu)造和形態(tài)。在反響開場時(shí)，聚乙二醇與環(huán)氧樹脂-二乙烯三胺形成的是無色透明的均勻溶液，此時(shí)聚乙二醇作為溶劑。隨著聚合反響的進(jìn)展，由于聚合物分子量的增長和交聯(lián)密度的增大，聚乙二醇與聚合物的相容性逐漸降低，導(dǎo)致了微觀相別離(micro-phaseseparation)的發(fā)生。由此在體系內(nèi)部形成了均勻分布的凝膠核，繼而吸收溶劑相中的單體使得核逐漸長大，當(dāng)核長到足夠大并且互相之間發(fā)生連接就可以形成簇，簇進(jìn)一步長大并且互相連接就可以搭建成三維網(wǎng)狀骨架構(gòu)造，骨架之間充滿了致孔劑，反響完成后除去致孔劑就形成了許多的空穴——即多孔構(gòu)造。而柱內(nèi)有三種孔構(gòu)造同時(shí)存在，一種是凝膠核與凝膠核之間形成的微孔；另一種是凝膠核與簇之間形成的中孔；還有一種是簇與簇之間形成的大孔。大孔準(zhǔn)許液體直接流過，大大降低了流動(dòng)相流過時(shí)產(chǎn)生的柱壓降，小孔則提供了所需的外表積[134]。上述過程亦可通過反響現(xiàn)象觀察，在不加致孔劑聚乙二醇的情況下，與二乙烯三胺反響后成為無色透明的塊狀體型聚合物；參加聚乙二醇以后，隨著反響的進(jìn)展，體系由透明逐漸變白，最終形成白色的不透明塊狀聚合物，這種變化無疑是聚乙二醇起的作用。透明與不透明兩種情況通常是判斷凝膠樹脂無孔與多孔性的重要依據(jù)，因此，根據(jù)反響的現(xiàn)象可以初步認(rèn)定是形成了多孔構(gòu)造，再進(jìn)一步由電鏡照片得到確認(rèn)(圖4.2)。顯然，聚乙二醇在體系中起到了致孔劑的作用。我們參考以前實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的條件[135]，采用PEG–1540:EP:二乙烯三胺質(zhì)量比為8:4:1來制備色譜整體柱。圖4.2聚合物整體柱的電鏡照片3.2聚合物整體柱的紅外光譜分析圖4.3是聚合物整體柱的紅外光譜圖。從譜圖中可以看出環(huán)氧樹脂基聚合物整體柱中主要功能基團(tuán)的吸收峰為：3363.30cm-1(γO–H和N-H),2929.39cm-1(CH2和CH的γC–H)，1608.37cm-1和1510.01cm-1(苯環(huán)的γC=C)，1459.87cm-1(C(CH3)2中δCH3)247.74cm-1(γasO–Ar的C-O-C),1182.17cm-1(CH2中的γC–H)，827.33cm-1(1,4紅外光聚合物基液相色譜整體柱的制備及在HPLC中的應(yīng)用聚合物基液相色譜整體柱的制備及在HPLC中的應(yīng)用羥基基團(tuán)伸縮振動(dòng)引起的，說明聚合物外表存在大量裸露的–OH基團(tuán)。這主要是基于二乙烯三胺中氨基上的氮與環(huán)氧樹脂中的環(huán)氧環(huán)發(fā)生開環(huán)反響而生成的。圖4.3聚合物整體柱的紅外光譜圖3.3整體柱制備的重現(xiàn)性與常規(guī)的填充柱相比整體柱具有制備簡單、易于改性、柱壓低及傳質(zhì)速度快等優(yōu)點(diǎn)，其制備過程只需要一步就可以完成，沒有繁瑣的研磨、篩分、填充等后序處理步驟，因此制備的重現(xiàn)性較高。實(shí)驗(yàn)過程中曾同時(shí)用一樣的原料反響比例制備了四根(50mm×4.6mmi.d)一樣的柱子，經(jīng)過一樣的處理程序后用色譜進(jìn)展評價(jià)發(fā)現(xiàn)其響應(yīng)值、保存時(shí)間、柱壓降等因素根本未發(fā)生變化，別離因子和別離度也沒有顯著的改變。正是基于整體柱良好的重現(xiàn)性使其得到極大關(guān)注并被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。3.4溶脹度測定與分析為了評價(jià)聚合物整體柱的剛性，本文采用稱量法測定環(huán)氧樹脂聚合物整體柱的溶脹度。準(zhǔn)確稱取2g枯燥的聚合物整體柱，于甲苯中浸泡，每24h濾去多余的甲苯，用濾紙SR=(Ws-Wd)/Wd×100%(4–1)式中：SR——聚合物整體柱溶脹度(%)；Ws——整體柱在溶劑中一定時(shí)間或到達(dá)溶脹平衡時(shí)的質(zhì)量(g)；Wd——干整體柱的質(zhì)量(g)。結(jié)果顯示聚合物整體柱溶脹后的質(zhì)量變成3.36g，根據(jù)公式(4–1)可得溶脹度為68%。聚合物溶脹性能與它的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)造及網(wǎng)絡(luò)所包含溶劑的性質(zhì)有密切關(guān)系；溶劑與聚合物高分子鏈親和性越好，聚合物溶脹越明顯，平衡時(shí)溶脹程度還與交聯(lián)度有關(guān)，交聯(lián)點(diǎn)數(shù)量越少，溶脹程度越大[136]。所合成的聚合物整體柱發(fā)生溶脹可能與其構(gòu)造中含有苯環(huán)有關(guān)，甲苯屬于疏水型化合物，容易與聚合物上的苯環(huán)發(fā)生親和而被吸附，當(dāng)吸附到達(dá)一定程度時(shí)，聚合物體積膨脹，即發(fā)生溶脹。另外，固化劑與環(huán)氧樹脂之間未充分聚合交聯(lián)，聚合物中含有柔性的鏈狀構(gòu)造，易與甲苯發(fā)生親和吸附，也是聚合物發(fā)生溶脹的一個(gè)原因。此外，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)聚合物在水介質(zhì)中的溶脹度幾乎為零，說明所合成的聚合物整體柱在水體環(huán)境下較穩(wěn)定，為研究其在水溶液中的別離性能提供可行性依據(jù)。3.5環(huán)氧樹脂基聚合物整體柱的色譜評價(jià)流速對整體柱柱壓降的影響整體柱對流動(dòng)相的通透性與它的孔構(gòu)造密切相關(guān)。整體柱中的大孔越多，流動(dòng)相流過時(shí)的柱壓就越低。但是孔徑大于50nm的大孔對基質(zhì)材料的外表積奉獻(xiàn)很小。對于色譜別離，填料的外表積要求越大越好，因此，基質(zhì)材料中小于2nm的小孔和介于2–50nm的中孔要求盡可能多。這樣才能兼顧低柱壓和大外表積兩方面的要求。而在不同的流速下色譜柱具有穩(wěn)定的柱壓降是色譜分析的前提條件，同時(shí)還可以判斷整體柱內(nèi)部孔構(gòu)造分布均勻與否，也是柱子穩(wěn)定性條件之一。圖4.4是不同流速下環(huán)氧樹脂基色譜整體柱的柱壓降，從結(jié)果可以看出，柱壓降隨流速的增加而增加，且在0.5–2.0mL·min-1*圍內(nèi)二者成線性關(guān)系，從而說明柱內(nèi)孔構(gòu)造分布應(yīng)該是均勻穩(wěn)定的。另外，在較高流速下產(chǎn)生的柱壓降較低，也說明柱體內(nèi)存在大的通透孔，使得流動(dòng)相可直接通過，大大降低了流動(dòng)相流過時(shí)產(chǎn)生的柱壓降。這也說明實(shí)驗(yàn)制備的整體柱具有優(yōu)良的機(jī)械穩(wěn)定性，在該流速*圍內(nèi)聚合物的構(gòu)造不會(huì)受到破壞[137]。圖4.4不同流速下的柱壓降流速對整體柱保存和別離的影響流速對化合物在整體柱上的保存和別離會(huì)產(chǎn)生一定的影響，適宜的流速下可以縮短保存時(shí)間，加速別離，提高別離度；而當(dāng)流速較低時(shí)，保存時(shí)間延長，色譜峰展寬拖尾較嚴(yán)重，從而使別離度下降。因此，探索最正確的流速對色譜別離具有重要的意義，有必要考察其對整體柱色譜保存和別離行為的影響。圖4.5是流速在0.1–1.0mL·min-1*圍內(nèi)煙酸和煙酰胺在整體柱上的保存和別離色譜圖。從圖上可以看出，流速對煙酰胺的影響不大，而對煙酸的影響較明顯。流速為0.1mL·min-1時(shí)兩者根本未分開，當(dāng)流速為0.3mL·min-1時(shí)別離效果較好，但煙酸峰拖尾較嚴(yán)重，可能是煙酸在整體柱內(nèi)傳質(zhì)速率較慢的緣故；在流速為0.5–0.8mL·min-1*圍內(nèi)流速對兩者的保存因子影響不大，而在1.0mL·min-1的流速下兩者獲得最正確的別離效果。圖4.5不同流速對煙酸和煙酰胺在整體柱上保存和別離的影響；〔流速〔mL·min-1〕：1.0.1；；；；5.0.8；6.1.0流動(dòng)相組成對整體柱保存和別離的影響待測物在整體柱上的保存行為既受聚合物外表性質(zhì)的影響，同時(shí)又受流動(dòng)相組成的影響。一方面，固定相的識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合分析物而使其在整體柱上保存；另一方面，流動(dòng)相與分析物之間的相互作用使分析物被洗脫下來。因此流動(dòng)相中的添加劑不僅可以影響被分析物的保存時(shí)間和別離度，同時(shí)也可以提供分析物與聚合物之間相互作用類型的信息。因而以純水為流動(dòng)相、流速為1.0mL·min-1條件下，考察流動(dòng)相中參加酸、堿對別離的影響。圖4.6為純水流動(dòng)相中添加不同比例的醋酸對煙酸和煙酰胺保存行為的影響，可以看出流動(dòng)相中的酸對煙酸的影響較大，隨酸的增加煙酸的保存因子由6.85降到5.12，別離度也有所下降。這可能是因?yàn)榱鲃?dòng)相中添加醋酸后，與聚合物外表上的羥基形成氫鍵或靜電作用，可以與煙酸分子中的羧基進(jìn)展競爭，使其從整體柱外表上迅速置換下來，所以保存時(shí)間縮短，使其與煙酰胺保存時(shí)間差縮短，導(dǎo)致別離度下降。而流動(dòng)相中的酸度對煙酰胺的保存因子影響不大，這也可能與其分子構(gòu)造有關(guān)。在流動(dòng)相中添加堿性化合物三乙胺(參加量為0.1–2.5%)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)三乙胺含量較低時(shí)對保存時(shí)間影響不大，只是色譜峰變得有些鋒利；而當(dāng)三乙胺含量超過1%時(shí)，煙酸和煙酰胺的保存時(shí)間均縮短，其別離度也迅速下降，再增加三乙胺含量時(shí)兩者之間幾乎沒有別離效果。圖4.6純水流動(dòng)相中醋酸含量對煙酸和煙酰胺在整體住上的保存和別離的影響；(●)煙酸的保存因子；(■)煙酰胺的保存因子流動(dòng)相中有機(jī)溶劑對整體柱別離的影響傳統(tǒng)的顆粒填充柱和大多數(shù)分子印跡聚合物整體柱常采用大量的高純度有機(jī)溶劑來作為流動(dòng)相。有機(jī)溶劑有利于分析物與識(shí)別位點(diǎn)形成復(fù)合物，從而實(shí)現(xiàn)別離的目的。因此有必要考察在純水中參加不同比例的甲醇、乙腈對煙酸和煙酰胺在整體柱上別離的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)流動(dòng)相中參加甲醇或乙腈時(shí)，煙酸和煙酰胺的保存因子均明顯降低，且兩者未分開即被流動(dòng)相沖出來。這可能由于整體柱外表存在大量的極性羥基基團(tuán)，在極性溶劑乙腈或甲醇存在下，更易與其結(jié)合，從而破壞了被分析物與整體柱上結(jié)合位點(diǎn)的相互作用，使其很難被保存；另外，也可能是“相似相溶〞使分析物更易被流動(dòng)相帶走的緣故。再者，所制備的整體柱在有機(jī)溶劑中會(huì)發(fā)生微溶脹作用，使其變軟而影響機(jī)械強(qiáng)度降低穩(wěn)定性，從而影響色譜別離。而在以純水為流動(dòng)相時(shí)，煙酸和煙酰胺在整體柱上別離效果較好，柱子也較穩(wěn)定。整體柱所具備的這一特性也正是接下來我們研究工作的重點(diǎn)，將其與分子印跡技術(shù)結(jié)合，使識(shí)別過程從有機(jī)相轉(zhuǎn)向水相，以接近天然分子識(shí)別系統(tǒng)?？焖賱e離整體柱與傳統(tǒng)的填充柱相比具有的顯著特點(diǎn)就是能夠快速別離，這主要基于整體柱自身具有的優(yōu)點(diǎn)：(1)整體柱制備過程簡單，操作方便，整體構(gòu)造好，良好的機(jī)械性能使其色譜性能較穩(wěn)定，具有較高的制備重現(xiàn)性；(2)防止了填料顆粒之間的空體積，提高了色譜柱的空間利用率；(3)整體柱內(nèi)部特有的大孔構(gòu)造形成了許多“通道〞，這樣在別離過程中一局部流動(dòng)相就可以直接流過這些大孔通道，大大的降低了流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱所產(chǎn)生的柱壓降；(4)溶質(zhì)在整體柱內(nèi)以對流傳質(zhì)代替了緩慢的擴(kuò)散傳質(zhì)，為色譜柱內(nèi)傳質(zhì)的主要方式，大大提高了傳質(zhì)效率，即使在較高流速下，柱效也未受到影響。整體柱良好的滲透性，使其在較高的流速下能夠?qū)?gòu)造類似物實(shí)現(xiàn)快速別離。如圖4.7所示，在室溫下，以100%純水為流動(dòng)相，當(dāng)流速為1.0mL·min-1時(shí)，煙酸和煙酰胺在色譜柱(50mm×4.6mmi.d)上在2min內(nèi)可以到達(dá)別離度為0.83，與文獻(xiàn)[138]相比，結(jié)果令人滿意。煙酸峰有些拖尾的原因，可能是因?yàn)闊熕岬聂然c整體柱上的羥基結(jié)合能力較強(qiáng)，在整體柱內(nèi)傳質(zhì)速率較慢，流動(dòng)相很難迅速將其帶走的緣故。而傳統(tǒng)的顆粒填充柱或不規(guī)則的MIP固定相的色譜中，很難在較高的流速下實(shí)現(xiàn)快速別離。圖4.7煙酸(nicotinicacid)和煙酰胺(nicotinamide)在所制備的環(huán)氧樹脂基整體柱上的別離色譜圖：1.煙酸;2.煙酰胺4小結(jié)(1)采用PEG–1540：環(huán)氧樹脂：二乙烯三胺質(zhì)量比為:8:4:1在色譜空管柱(50mm×4.6mmi.d)內(nèi)制備了新型的環(huán)氧樹脂聚合物整體柱；電鏡觀察其內(nèi)部孔構(gòu)造非常豐富，存在大量的貫穿孔；紅外光譜表征發(fā)現(xiàn)柱外表存在大量羥基基團(tuán)。(2)考察了流速、酸堿度和有機(jī)溶劑對煙酸和煙酰胺兩種模型分析物在整體柱上保存和別離的影響；發(fā)現(xiàn)流速增加利于兩者別離，當(dāng)流動(dòng)相中添加酸堿和有機(jī)溶劑時(shí)都會(huì)影響兩者的保存和別離，大大降低了別離度；而在純水中柱子最穩(wěn)定且別離效果較好。(3)在室溫下，100%純水流動(dòng)相考察了煙酸和煙酰胺在色譜柱上的保存和別離情況，當(dāng)流速為1.0mL·min-1時(shí)，煙酸和煙酰胺在色譜柱(50mm×4.6mmi.d)上2min內(nèi)可以到達(dá)別離度為0.83，結(jié)果令人滿意。參考文獻(xiàn)：[1]李懿睿,*敏如.分子印跡整體柱在高效液相色譜中的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志.2007,38(4):313-317.[2]NohaN.Atia,PeterYork,BrianJ.Clark.parisonbetweenmonolithicandparticlepackedplatinumC18columnsinHPLCdeterminationofacidicandbasictestmi*tures[J].J.Sep.Sci.2009,(32):2732–2736.[3]MagdalenaBiesaga,UrszulaOchnik,KrystynaPyrzynska.Fastanalysisofprominentflavonoidsintomatousingamonolithiccolumnandisocratic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