PCR技術(shù)克隆目的基因全過(guò)程

實(shí)驗(yàn)：目的基因克?。≒CR技術(shù)）【課前預(yù)習(xí)】PCR(polymerasechainreaction)反應(yīng)的基本原理?！灸康囊蟆?．學(xué)習(xí)和掌握PCR反應(yīng)的基本原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法。2．認(rèn)真完成每一步實(shí)驗(yàn)操作，詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和結(jié)果并加以分析和總結(jié)?！净驹怼款愃朴贒NA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈【實(shí)驗(yàn)用品】1．材料：重組質(zhì)粒DNA作為模板2．器材和儀器：移液器及吸頭，硅烷化的PCR小管，DNA擴(kuò)增儀(PE公司)，瓊脂糖凝膠電泳所需設(shè)備(電泳槽及電泳儀)，臺(tái)式高速離心機(jī)3．試劑：①10×PCR反應(yīng)緩沖液：500mmol/LKCl,100mmol/LTris·Cl,在25℃②MgCl2：25mmol/L。③4種dNTP混合物:每種2.5mmol/L。④TaqDNA聚合酶5U/μl。⑤T4DNA連接酶及連接緩沖液：【方法步驟】（一）PCR反應(yīng)1.依次混勻下列試劑35μlH2O5μl10×PCR反應(yīng)緩沖液4μl25mmol/LMgCl24μl4種dNTP0.5μl上游引物（引物１）0.5μl下游引物（引物２）0.5μl模板DNA(約1ng)混勻后離心5秒。2.將混合物在94℃下加熱5分鐘后冰冷,迅速離心數(shù)秒,使管壁上液滴沉至管底,加入TaqDNA聚合酶（0.5μ3.用94℃變性1分鐘，45℃退火1分鐘,72℃4電泳按前所述,取10μl擴(kuò)增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析,檢查反應(yīng)產(chǎn)物及長(zhǎng)度。[注意]1.PCR非常靈敏,操作應(yīng)盡可能在無(wú)菌操作臺(tái)中進(jìn)行。2.吸頭、離心管應(yīng)高壓滅菌,每次吸頭用畢應(yīng)更換,不要互相污染試劑。3.加試劑前,應(yīng)短促離心10秒鐘,然后再打開(kāi)管蓋,以防手套污染試劑及管壁上的試劑污染吸頭側(cè)面。4.應(yīng)設(shè)含除模板DNA所有其它成分的負(fù)對(duì)照?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】【注意事項(xiàng)】微量操作、PCR反應(yīng)體系的設(shè)計(jì)、引物設(shè)計(jì)、擴(kuò)增條件的優(yōu)化【思考題】1.降低退火溫度對(duì)反應(yīng)有何影響？2.延長(zhǎng)變性時(shí)間對(duì)反應(yīng)有何影響？3.循環(huán)次數(shù)是否越多越好？為何？4.PCR有哪些用途？舉例說(shuō)明。附：PCR知識(shí)(供參考)（一）PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：10×擴(kuò)增緩沖液10ul4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加雙或三蒸水至100ulPCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：①引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右。②引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3’⑤引物3’⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。酶及其濃度：目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))，濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。dNTP的質(zhì)量與濃度：dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1MNaOH或1MTris。HCl的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過(guò)低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+模板(靶基因)核酸：模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來(lái)消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。Mg2+濃度：Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。PCR反應(yīng)條件的選擇PCR反應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。溫度與時(shí)間的設(shè)置：基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對(duì)于較短靶基因(長(zhǎng)度為100～300bp時(shí))可采用二溫度點(diǎn)法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，①變性溫度與時(shí)間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93②退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。對(duì)于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允許圍，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。③延伸溫度與時(shí)間：TaqDNA聚合酶的生物學(xué)活性：70～80℃70℃55℃高于90℃PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72循環(huán)次數(shù)：循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。PCR反應(yīng)特點(diǎn)特異性強(qiáng)PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；②堿基配對(duì)原則；③TaqDNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；④靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過(guò)選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。靈敏度高PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12g)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。簡(jiǎn)便、快速PCR反應(yīng)用耐高溫的TaqDNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。對(duì)標(biāo)本的純度要求低不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等粗制的DNA擴(kuò)增檢測(cè)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析PCR產(chǎn)物是否為特異性擴(kuò)增，其結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠，必須對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的分析與鑒定，才能得出正確的結(jié)論。PCR產(chǎn)物的分析，可依據(jù)研究對(duì)象和目的不同而采用不同的分析方法。凝膠電泳分析：PCR產(chǎn)物電泳，EB溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。PCR產(chǎn)物片段的大小應(yīng)與預(yù)計(jì)的一致，特別是多重PCR，應(yīng)用多對(duì)引物，其產(chǎn)物片斷都應(yīng)符合預(yù)訐的大小，這是起碼條件。瓊脂糖凝膠電泳：通常應(yīng)用1～2%的瓊脂糖凝膠，供檢測(cè)用。聚丙烯酰胺凝膠電泳：6～10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用于科研及檢測(cè)分析。酶切分析：根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性切酶的位點(diǎn)，用相應(yīng)的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，又能對(duì)靶基因分型，還能進(jìn)行變異性研究。分子雜交：分子雜交是檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測(cè)PCR產(chǎn)物堿基突變的有效方法。Southern印跡雜交：在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(部寡核苷酸)標(biāo)記后做探針，與PCR產(chǎn)物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測(cè)PCR產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。斑點(diǎn)雜交：將PCR產(chǎn)物點(diǎn)在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用部寡核苷酸探針雜交，觀察有無(wú)著色斑點(diǎn)，主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。核酸序列分析：是檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性的最可靠方法。PCR常見(jiàn)問(wèn)題總結(jié)PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間一般為48h以，有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及活性④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：①選定一個(gè)好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。假陽(yáng)性出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：①操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍或?yàn)R出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。③必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶則不出現(xiàn)，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：①必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。②減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。③降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性，65出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。其對(duì)策有：①減少酶量，或調(diào)換另一來(lái)源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當(dāng)降低Mg2+濃度。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。PCR污染與對(duì)策PCR反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問(wèn)題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生。污染原因(一)標(biāo)本間交叉污染:標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時(shí)，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染;標(biāo)本核酸模板在提取過(guò)程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。(二)PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過(guò)程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.(三)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染:這是PCR反應(yīng)中最主要最常見(jiàn)的污染問(wèn)題，因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大(一般為1013拷貝/ml)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可造成假陽(yáng)就可形成假陽(yáng)性。還有一種容易忽視，最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開(kāi)蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問(wèn)題。(四)實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽(yáng)性對(duì)照的檢驗(yàn)室，這個(gè)問(wèn)題也比較常見(jiàn)。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積含量相當(dāng)高，另外在純化過(guò)程中需用較多的用具及試劑，而且在活細(xì)胞的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強(qiáng)的生命力，其污染可能性也很大。污染的監(jiān)測(cè)一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室，要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測(cè)，考慮有無(wú)污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。對(duì)照試驗(yàn)1.陽(yáng)性對(duì)照:在建立PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽(yáng)性對(duì)照，它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。陽(yáng)性對(duì)照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本，如以重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，其含量宜低不宜高(100個(gè)拷貝以下)，但陽(yáng)性對(duì)照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽(yáng)性標(biāo)本，其對(duì)檢測(cè)或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大。因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí)，在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽(yáng)性對(duì)照。2.陰性對(duì)照:每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對(duì)照。它包括①標(biāo)本對(duì)照:被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對(duì)照;被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對(duì)照。②試劑對(duì)照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測(cè)試劑是否污染。3.重復(fù)性試驗(yàn)4.選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增防止污染的方法(一)合理分隔實(shí)驗(yàn)室:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行，特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開(kāi)。最好能劃分①標(biāo)本處理區(qū);②PCR反應(yīng)液制備區(qū);③PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū);④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng)專用，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA。(二)吸樣槍:吸樣槍污染是一個(gè)值得注意的問(wèn)題。由于操作時(shí)不慎將樣品或模板核酸吸入槍或粘上槍頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時(shí)要十分小心，吸樣要慢，吸樣時(shí)盡量一