植物細胞培養(yǎng)

植物細胞培養(yǎng)第1頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五

植物細胞培養(yǎng)，即對植物器官或愈傷組織上分離的單細胞(或小細胞團)進行培養(yǎng)，形成單細胞無性系或再生植株的技術(shù)。第2頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五第一節(jié)單細胞培養(yǎng)一、定義單細胞培養(yǎng)：對分離得到的單個細胞進行培養(yǎng)，誘導(dǎo)其分裂增殖，形成細胞團，再經(jīng)過分化形成芽、根等器官或胚狀體，甚至長成完整植株的技術(shù)。二、意義1、建立單細胞無性系2、對培養(yǎng)的單細胞可以誘發(fā)突變3、排除體細胞干擾4、遺傳轉(zhuǎn)化受體的建立第3頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五三、單細胞的分離葉組織是分離單細胞的最好材料，1、機械法：葉片組織輕輕研碎，勻漿過濾或離心，得到純化細胞。特點：細胞不受酶傷害，不會發(fā)生質(zhì)壁分離。

不適用于所有植物2、酶解法：利用果膠酶處理葉片，使細胞間的中膠層發(fā)生降解，分離出具有代謝活性的細胞。特點：必須對酶溶液給予滲透壓保護，防止細胞脹裂。第4頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五四、單細胞培養(yǎng)方法（一）看護培養(yǎng)法

用一塊活躍生長的愈傷組織塊來看護單個細胞，并使其生長和增殖的方法。（1）取處于活躍生長期約1厘米大小愈傷組織塊。（2）無菌條件下，愈傷組織塊安放在培養(yǎng)瓶中，在愈傷組織上放約1厘米平方的無菌濾紙片。置培養(yǎng)室中放過夜。（3）從懸浮培養(yǎng)物或疏松的愈傷組織上分離出單細胞，并把單細胞接種在培養(yǎng)瓶中的濾紙上面。（4）恒溫培養(yǎng)。第5頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五第6頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五（二）微室培養(yǎng)法

人工制造一個小室（載玻片和蓋玻片），將單細胞培養(yǎng)在小室中的少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖成細胞團的方法。小室可通過毛細管與外界通氣，便于觀察。注意載玻片厚度1mm，微室厚度最好不超過20um，蓋玻片厚度在0.17-0.18mm左右，觀察效果才好。第7頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五第8頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五（三）平板培養(yǎng)法

平板培養(yǎng)法是把單個細胞與融化的瓊脂培養(yǎng)基均勻混合，并平鋪一薄層在培養(yǎng)皿底上的培養(yǎng)方法。廣泛應(yīng)用于細胞、原生質(zhì)體及融合產(chǎn)物的培養(yǎng)。第9頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五步驟：1、單細胞懸浮液的制備2、懸浮細胞密度的調(diào)制3、瓊脂培養(yǎng)基的配制4、平板制作5、培養(yǎng)第10頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五（四）條件培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入高密度的細胞進行培養(yǎng)，一定時間后這些細胞就會向培養(yǎng)基中分泌一些物質(zhì)，使培養(yǎng)基條件化。方法：把液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)了4-6周的高密度細胞過濾掉，將其培養(yǎng)基制成液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基來培養(yǎng)單細胞或低密度細胞群體，這樣可明顯提高單細胞培養(yǎng)物存活和分裂的能力。第11頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五第二節(jié)細胞懸浮培養(yǎng)細胞懸浮培養(yǎng)是使離體的植物細胞懸浮在液體培養(yǎng)基中進行的無菌培養(yǎng)。建立在愈傷組織的液體培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)上。目前已發(fā)展到全自動控制的大容積發(fā)酵罐的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的連續(xù)培養(yǎng)。為研究細胞的生長和分化提供了一個獨特的實驗系統(tǒng)。第12頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五1、愈傷組織誘導(dǎo)材料自來水沖洗——75%的乙醇擦洗——將材料切成小塊（帶形成層）——接種到MS+2,4-D2mg/L+CH500mg/L+瓊脂0.8%,pH5.8的培養(yǎng)基上——得愈傷組織——擴大繁殖。2、單細胞懸浮液的制備愈傷組織轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中——4r/min轉(zhuǎn)床培養(yǎng)10d——140m×140m的細胞篩過篩——使細胞密度達到10個/ml左右——得單細胞懸浮液。

一、前期準備第13頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五

在細胞懸浮培養(yǎng)中，采用生長快、有效成分高、適合懸浮培養(yǎng)的細胞株。篩選細胞株的方法是：

（1）從培養(yǎng)的愈傷組織中挑選出外觀疏松、生長快的淺色愈傷組織。

（2）用振蕩或酶法，游離出單個細胞或小細胞團。

（3）接種在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周。

（4）挑選生長快的細胞株并繼代培養(yǎng)。

（5）取各細胞系的培養(yǎng)物，進行有效成分的測定，篩選出有效成分高而生長較快的細胞株。第14頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五第15頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五二、培養(yǎng)類型和方法（一）成批培養(yǎng)

指把細胞分裝在一定容積的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，當培養(yǎng)物增殖到一定量時，轉(zhuǎn)接繼代，建立起單細胞培養(yǎng)物。它是進行細胞生長和細胞分裂的生理生化研究常用的培養(yǎng)方法。

第16頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五（1）細胞生長在固定體積的培養(yǎng)基上，直至培養(yǎng)基中的養(yǎng)分為細胞耗盡為止。

（2）用適當攪拌的方法增加和維持游離細胞和細胞團在培養(yǎng)基中的均勻分布。

（3）在整個培養(yǎng)過程中，細胞數(shù)目會不斷發(fā)生變化，呈現(xiàn)出明顯的慢-快-慢，最后增長停止的細胞生長周期。

（4）成批培養(yǎng)結(jié)束后，若要進行下一批培養(yǎng)，必須另外進行繼代培養(yǎng)，其方法是用注射器吸取一定量的含單細胞和小細胞團的懸浮培養(yǎng)物，并移到含有新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶里，繼續(xù)進行培養(yǎng)。1、成批培養(yǎng)法第17頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五細胞生長周期延滯期對數(shù)增長期直線生長期緩慢期靜止期時間

細胞數(shù)目第18頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五（二）半連續(xù)培養(yǎng)指每隔一定時間后倒出一半的懸浮液，并同時補充加入等量新鮮培養(yǎng)液。能重復(fù)地取得大量、均一的培養(yǎng)細胞，供生物研究之用。

第19頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五是利用特制的培養(yǎng)容器進行大規(guī)模細胞培養(yǎng)的一種方式。

在培養(yǎng)過程中，以不斷抽取懸浮培養(yǎng)物并注入等量新鮮培養(yǎng)基，使培養(yǎng)物不斷得到養(yǎng)分補充，保持其恒定體積的培養(yǎng)。

（三）連續(xù)培養(yǎng)第20頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五1、連續(xù)培養(yǎng)的特點

（1）由于不斷加入新鮮培養(yǎng)基，保證了養(yǎng)分的充分供應(yīng)，不會出現(xiàn)懸浮培養(yǎng)物發(fā)生營養(yǎng)不足的現(xiàn)象。

（2）可在培養(yǎng)期間使細胞保持在對數(shù)生長期中。細胞增殖速度快。

（3）適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。第21頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五2、連續(xù)培養(yǎng)的種類

封閉式連續(xù)培養(yǎng)：系統(tǒng)中的細胞數(shù)目不斷增加。

開放式連續(xù)培養(yǎng)：系統(tǒng)中的細胞密度保持恒定。

第22頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五封閉型連續(xù)培養(yǎng)：在培養(yǎng)過程中，排除的舊培養(yǎng)基由加入的新鮮培養(yǎng)基進行補充，進出數(shù)量保持平衡，從而使培養(yǎng)系統(tǒng)中營養(yǎng)物質(zhì)的含量總是超過細胞生長的需要。懸浮在排除液中的細胞經(jīng)機械方法收集后再放回培養(yǎng)系統(tǒng)中，因此在這樣培養(yǎng)方式中，隨著培養(yǎng)時間延長，細胞密度不斷增加。第23頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五開放型連續(xù)培養(yǎng)：為了不使限制細胞生長的因子出現(xiàn)，創(chuàng)造一個穩(wěn)定的細胞生長的環(huán)境，必須建立一套自動控制系統(tǒng)來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基注入的數(shù)量和培養(yǎng)液的總體積。在開放連續(xù)培養(yǎng)中，注入的新鮮培養(yǎng)液的容積與流出的培養(yǎng)液容積相等，其中細胞的密度也保持恒定，并通過調(diào)節(jié)流入和流出的速度，使細胞的生長速度一直保持在一個穩(wěn)定狀態(tài)，流出的細胞相當于培養(yǎng)系統(tǒng)中新細胞的增加數(shù)。第24頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五3、為了保持在開放連續(xù)培養(yǎng)中細胞增殖的穩(wěn)定性，采取的控制方法：

（1）濁度恒定法

（2）化學恒定法

第25頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五三、懸浮細胞的繼代在懸浮培養(yǎng)中，為了保持一定的懸浮細胞增殖速度和增殖量，應(yīng)定期做繼代培養(yǎng)，最適的周期一般為1-2周。但實際所需的時間和接種量應(yīng)視不同細胞系而定。繼代時間為1周的細胞系可用1：4的接種量，繼代時間為2周的可用1：10的接種量。第26頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五在懸浮培養(yǎng)中，細胞剛進入靜止期之初，細胞懸浮液達到最大量，就必須進行繼代培養(yǎng)。因為處在靜止期的細胞懸浮液保存時間太長會引起細胞的大量死亡和解體。為了加速細胞增殖，有的甚至在對數(shù)生長期末就進行繼代。第27頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五四、培養(yǎng)細胞的同步化同步培養(yǎng)：在培養(yǎng)基中大多數(shù)細胞都能同時通過細胞周期的各個階段，同步性的程度以百分百分數(shù)表示。第28頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五實現(xiàn)懸浮培養(yǎng)細胞同步化的方法：1、饑餓法：先對細胞斷絕供應(yīng)一種進行細胞分裂所必需的營養(yǎng)成分或激素，使細胞停滯在G1期或G2期，經(jīng)過一段時間的饑餓后，當重新在培養(yǎng)基中加入這種限制因子時，靜止細胞就會同時進入分裂。第29頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五2、抑制法：使用DNA合成抑制劑，也可使細胞培養(yǎng)同步化。當細胞受到這些化學藥物處理后，由于這些核苷酸類似物的存在阻止了DNA的合成，細胞周期只能進行到G1期，細胞都滯留在G1期和S期的邊界，當把這些抑制劑除去后，細胞就進入同步分裂。第30頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五為了改善液體培養(yǎng)基中材料的通氣狀況，需進行培養(yǎng)基的不斷振蕩：

（1）旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)

（2）往返振蕩培養(yǎng)

（3）旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)

（4）攪動振蕩培養(yǎng)五、培養(yǎng)基的振蕩第31頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五1、培養(yǎng)基成分：

N6，MS，B5適合單子葉植物細胞，

MS，B5，LS，SL適合雙子葉植物細胞。

條件培養(yǎng)基適合單細胞和低密度細胞培養(yǎng)。

需要硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、無機磷濃度更高。六、影響細胞培養(yǎng)的因素第32頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五2、細胞密度：培養(yǎng)基的成分和起始細胞密度對單細胞培養(yǎng)成敗有影響。起始密度：細胞培養(yǎng)最低的有效密度，即能使細胞分裂、增殖的最低接種量，低于這個密度細胞不能分裂，甚至很快解體死亡。第33頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五3、植物生長調(diào)節(jié)劑：細胞懸浮培養(yǎng)時，常表現(xiàn)一種自然的聚集現(xiàn)象，加入2，4-D，少量水解酶或酵母提取液，能夠增加細胞的分散度。第34頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五4、pH和二氧化碳濃度在懸浮培養(yǎng)時，PH變動相當大。加入EDTA使鐵和其他金屬離子長期處于可利用狀態(tài)。硝態(tài)氮和銨態(tài)氮之間進行調(diào)整可作為穩(wěn)定PH的一種方法。二氧化碳對細胞培養(yǎng)沒有太大影響，但在低密度細胞培養(yǎng)中，二氧化碳對于誘導(dǎo)細胞分裂可能有重要作用。第35頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五第三節(jié)植物細胞生長和活力的測定一、懸浮培養(yǎng)中細胞生長的測定1、細胞計數(shù)：把1份培養(yǎng)物加入到2份8%三氯化鉻溶液中，在70℃下加熱2-15分鐘，然后將混合物冷卻，用力震蕩10分鐘，用血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)。第36頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五2、細胞總體積：將已知體積的均勻分散的懸浮液放入1個15ml刻度離心管中，在2000g下離心5min，得到細胞沉積的體積。細胞密實體積（PCV）：以每ml培養(yǎng)液中細胞總體積的ml數(shù)表示。3、細胞鮮重和干重：4、細胞有絲分裂的指數(shù)：在一個細胞群體中，處于有絲分裂的細胞占細胞總數(shù)的百分數(shù)。5、細胞植板率=每個平板形成的細胞團數(shù)/每個平板接種的細胞總數(shù)第37頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五二、培養(yǎng)細胞活力的測定1、TTC法2、熒光素二乙酸法（FDA法）3、伊凡藍染色法第38頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五第四節(jié)植物細胞培養(yǎng)的應(yīng)用一、植物次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)二、突變體選擇三、誘導(dǎo)多倍體

第39頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五（一）生產(chǎn)天然的植物成分

通過細胞培養(yǎng)可得到大量合成的植物次生化合物，如生物堿、抗菌劑、抗血平、橡膠、類固醇、糖類衍生物、天然色素等很多物質(zhì).

一、植物次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)第40頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五●海巴戟的植物體內(nèi)——

蒽醌

●胡蘿卜愈傷組織——

紫紅色、橙紅色、綠色、黃白色4種愈傷組織株系●紫草——

紫草色素

●長春花細胞和愈傷組織培養(yǎng)物——

利血平和阿馬靈

●三七的愈傷組織培養(yǎng)物——

三七皂苷（含量達干重的10.25%）●三分三的愈傷組織中——

茛菪堿（含量可達干重的0.55%

第41頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五天然色素，絳紅色?？咕?、抗炎、抗病毒、止血。用于化妝品生產(chǎn)紫草紫草根紫草素醌類第42頁，共47頁，2023年，2月20日，星期五蘆丁、槲皮素：治療心腦血管疾病藥物的主要成分。

槲皮素R=H蘆丁R=蕓香糖銀杏黃酮、大豆黃酮等也是防治心血管疾病的重要物質(zhì)。黃酮類第4