實(shí)驗(yàn)五、氨基酸的分離鑒定-濾紙層析法

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^氨基酸的分離，學(xué)習(xí)紙層析法的基本原理及操作技術(shù)。第一頁，共21頁。二、實(shí)驗(yàn)原理紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法。利用不同物質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中的分配系數(shù)不同而得到分離。展層劑由有機(jī)溶劑與水組成。在紙上，水被吸附在纖維素的纖維之間形成固定相，當(dāng)有機(jī)相沿紙流動(dòng)經(jīng)過層析斑點(diǎn)時(shí)，層析點(diǎn)上的溶質(zhì)就在有機(jī)相和水相之間進(jìn)行分配。當(dāng)有機(jī)相不斷流動(dòng)時(shí)，溶質(zhì)就沿著有機(jī)相流動(dòng)方向移動(dòng)，不斷進(jìn)行分配，溶質(zhì)中各組分的分配系數(shù)不同，移動(dòng)速率不同，因而彼此分開。第二頁，共21頁。各組分由于移動(dòng)速度不同，物質(zhì)被分離后在層析紙上的位置也不同，可用Rf值來表示：原點(diǎn)到層析點(diǎn)中心距離

Rf

＝———————————原點(diǎn)到溶劑前沿的距離

在一定的條件下某物質(zhì)的Rf值是常數(shù)，可作為定性分析的依據(jù)。Rf值大小與樣品物質(zhì)的結(jié)構(gòu)性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質(zhì)量及展層方式、溫度、樣品溶液中的雜質(zhì)等因素有關(guān)。第三頁，共21頁。物質(zhì)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)物質(zhì)的極性大小決定了物質(zhì)在水和有機(jī)相之間的分配情況，其極性的大小主要取決于物質(zhì)所具有的極性基團(tuán)的性質(zhì)和數(shù)量，在極性基團(tuán)不改變情況下，非極性基團(tuán)成分越多，則分子極性越低等。第四頁，共21頁。

同一物質(zhì)在不同的溶劑系統(tǒng)中，Rf值不同。在同一溶劑系統(tǒng)中，溶劑各組分比例不同時(shí)，Rf值也有差別。溶劑系統(tǒng)選擇應(yīng)注意以下原則：1）通常選用與水部分混溶的有機(jī)溶劑或與水相混溶的其他溶劑作為展層劑。2）溶劑系統(tǒng)應(yīng)選相對(duì)穩(wěn)定二元或多元混合溶劑，各成分之間不起化學(xué)反應(yīng)，揮發(fā)性太大的溶液不宜作溶劑。3）樣品分離各組分一般Rf值0.05~0.85之間，彼此間差值不應(yīng)小于0.05，樣品與標(biāo)樣差值<0.05基本確認(rèn)為同一種物質(zhì)。4）溶劑的規(guī)格應(yīng)選用色譜純或分析純，必要時(shí)重新蒸餾。溶劑系統(tǒng)第五頁，共21頁。展層方式上行法下行法環(huán)形法(輻射法）第六頁，共21頁。三、器材

層析缸、毛細(xì)管、噴霧器、培養(yǎng)皿、層析濾紙第七頁，共21頁。四、試劑1、擴(kuò)展劑：按體積4:1:3的正丁醇：冰醋酸：水混合后倒入分液漏斗中，充分振蕩，靜置后分層排出水相50ml/組2、平衡劑：取漏斗中的擴(kuò)展劑5ml于燒杯中作平衡劑。3、氨基酸：0.5%賴、脯、纈、苯丙、亮氨酸溶液及各組分的混合氨基酸各5ml。4、顯色劑：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。

200ml全班第八頁，共21頁。五、操作

1、取層析濾紙一張，在紙的一端距邊緣2-3cm處用鉛筆畫一條直線，在此線上每間隔2cm作一記號(hào)（即原點(diǎn)）如圖。2、點(diǎn)樣：用鋼筆或毛細(xì)管將氨基酸樣品分別點(diǎn)在這6個(gè)位置上，干后再點(diǎn)一次。每點(diǎn)在紙上擴(kuò)散的直徑不超3mm。點(diǎn)樣量應(yīng)根據(jù)樣品的性質(zhì)及濾紙的長(zhǎng)度來決定，一般點(diǎn)樣量為5—30ug。第九頁，共21頁。溶劑前沿層析點(diǎn)

原點(diǎn)

第十頁，共21頁。3、平衡：點(diǎn)樣好的濾紙卷成圓筒狀用線縫好與盛有平衡劑的小燒杯，置于密閉的層析缸中，平衡1-2小時(shí)。4、擴(kuò)展：將盛有約20ml左右擴(kuò)展劑的培養(yǎng)皿迅速置于密閉的層析缸中，并將濾紙直立于培養(yǎng)皿中，密閉好層析缸。待溶劑上升到15—20cm時(shí)即取出濾紙，立即用鉛筆描出溶濟(jì)前沿，吹風(fēng)機(jī)或烘箱干燥。第十一頁，共21頁。圖1-2濾紙縫合示意圖第十二頁，共21頁。第十三頁，共21頁。第十四頁，共21頁。5、顯色：用噴霧器均勻噴上0.1%的茚三酮正丁醇溶液，干燥。6、計(jì)算：用鉛筆描出各層析斑點(diǎn)的輪廓，并計(jì)算各氨基酸的Rf值。

第十五頁，共21頁。圖譜顯示化學(xué)方法：顯色劑不與濾紙起反應(yīng)，揮發(fā)性小，易于去除，含水量少。物理方法微生物方法同位素和放射自顯影法第十六頁，共21頁。注意事項(xiàng)：1、要保證層析濾紙不被污染，特別是從點(diǎn)樣線到溶劑前沿的部分。2、各氨基酸樣品點(diǎn)樣時(shí)量要均勻。3、在縫濾紙時(shí)，紙的兩邊不能接觸。4、點(diǎn)樣的一端朝下，擴(kuò)展劑的液面需低于點(diǎn)樣線1cm。第十七頁，共21頁。第十八頁，共21頁。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果樣品aa標(biāo)樣Rf混合aaRf差值賴aa脯aa纈