梯度洗脫和多組分含量測定

梯度洗脫和多組分含量測定第1頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五1梯度洗脫的原理及應(yīng)用2梯度洗脫方法的建立3注意事項主要內(nèi)容梯度洗脫Part1第2頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五存在的問題早流出峰的分離度差；遲流出峰的峰寬增加而峰高降低；由于k范圍寬，所以分析時間長；強(qiáng)保留組分造成柱污染.等度洗脫Isocraticelution

-在洗脫樣品的整個過程中，流動相的組成保持不變。1梯度洗脫的原理及應(yīng)用Part1梯度洗脫第3頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五梯度洗脫Gradientelution

-在分離過程中改變流動相組成.優(yōu)點

改善分離度提高檢測性能能夠分離復(fù)雜樣品縮短分析時間降低由于強(qiáng)保留組分而使色譜柱性能變差的可能性1梯度洗脫的原理及應(yīng)用Part1梯度洗脫第4頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五梯度洗脫原理：

在液相色譜中用2種（或2種以上）不同極性的流動相，在分離過程中按一定的比例連續(xù)的變化，通過自身配比的改變而改變其極性，以實現(xiàn)對復(fù)雜物質(zhì)的分離。Time（min）流動相強(qiáng)度增加k值減?。ǎ┨荻冗\行過程中會發(fā)生1梯度洗脫的原理及應(yīng)用Part1梯度洗脫第5頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五等度洗脫梯度洗脫化合物流出加快

色譜峰變窄色譜峰尾部處于高比例有機(jī)相環(huán)境中，尾部的速度要比峰中心快，從而使峰聚焦，色譜峰變窄。30%B30%B31%B30%B梯度運行過程中會發(fā)生1梯度洗脫的原理及應(yīng)用Part1梯度洗脫第6頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五梯度洗脫的應(yīng)用

具有較寬k值范圍的樣品;

大分子樣品;

樣品含有晚流出干擾物;

溶于弱溶劑的樣品稀溶液。1梯度洗脫的原理及應(yīng)用Part1梯度洗脫第7頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五梯度洗脫的應(yīng)用1梯度洗脫的原理及應(yīng)用二烷基鄰苯二甲酸酯混合物；C8柱（25×0.46cm，5μm）；流動相：乙腈（B）-水。Part1梯度洗脫1

具有較寬k值范圍的樣品（即等度條件下不可能使所有譜峰達(dá)到0.5<k<20）.運行時間11min，譜峰窄，利于準(zhǔn)確定量。第8頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五梯度洗脫的應(yīng)用注意：梯度洗脫并不能解決所有譜峰的拖尾問題。（a）（b）離子交換色譜分離芳香羧酸混合物（a）55mM硝酸鈉水溶液流動相的等度分離；（b）10→100mM硝酸鈉水溶液流動相的梯度洗脫。k>20的晚流出峰往往會出現(xiàn)較嚴(yán)重拖尾。Part1梯度洗脫1

具有較寬k值范圍的樣品（即等度條件下不可能使所有譜峰達(dá)到0.5<k<20）.1梯度洗脫的原理及應(yīng)用第9頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五梯度洗脫的應(yīng)用大分子量樣品（肽、蛋白質(zhì)、合成聚合物等）的等度保留往往對于流動相組成（%B）的微小改變極其敏感，難以將保留值控制在合適的范圍內(nèi)。例如丙醇-水流動相等度RP-LC分離碳酸酐酶（一種分子量29000Da的蛋白質(zhì)）時，僅改變±0.1%B，則會導(dǎo)致保留時間±20%的變化。當(dāng)用梯度洗脫代替等度條件時，HPLC分離大分子時也會使峰形有較大改善。2大分子樣品（如分子量大于1000，尤其是生物樣品）。Part1梯度洗脫1梯度洗脫的原理及應(yīng)用第10頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五1梯度洗脫的原理及應(yīng)用梯度洗脫的應(yīng)用圖為對單一化合物定量的等度分離，但晚流出物的干擾峰仍連綿不斷。而梯度洗脫可以通過在下一次進(jìn)樣前將這些晚流出峰快速洗脫出。t（min）t（min）等度洗脫梯度洗脫3樣品含有晚流出干擾物，它們會污染色譜柱或在后續(xù)運行中流出。Part1梯度洗脫第11頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五1梯度洗脫的原理及應(yīng)用梯度洗脫的應(yīng)用對于溶解于弱溶劑中的稀樣品，梯度洗脫可以采用大體積（如1~10ml）進(jìn)樣，樣品進(jìn)樣時僅與弱溶劑A混合，在進(jìn)樣過程中于柱入口處完成柱上濃縮，而不會引起峰展寬。等度洗脫也可以進(jìn)行相似的柱上濃縮，但是由于進(jìn)樣過程中樣品與較強(qiáng)的等度流動相混合，使樣品體積過大，引起樣品峰嚴(yán)重展寬，不適合大體積進(jìn)樣。4溶于弱溶劑的樣品稀溶液（如用反相柱分離的樣品水溶液）。Part1梯度洗脫第12頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五2梯度洗脫方法的建立有機(jī)溶劑初始組成梯度時間梯度陡度梯度形狀流速柱長柱重新平衡時間必須確定:

2.1選擇梯度條件2.2改變峰間距2.3調(diào)整色譜柱條件方法建立的基本步驟第13頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五2梯度洗脫方法的建立5%有機(jī)相100%有機(jī)相初始梯度實驗-一個平緩的梯度（60min）2.1選擇梯度條件A：梯度變化速率Part1梯度洗脫第14頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五B：梯度范圍起始%B與終止%B的最佳值可由表1估計出。然后通過“試-湊”實驗，進(jìn)一步優(yōu)化梯度范圍。tRa或tRz（min）起始%B終止%B5314101122151930202738253546304354355160405968456776507584558310060d可能需要正相柱表12.1選擇梯度條件Part1梯度洗脫第15頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五B：梯度范圍梯度分離與初始流動相組成（%B）的關(guān)系足夠大的初始%B值主要影響前部分譜峰：k值降低；峰變窄；分離度降低.相同色譜柱，流速，柱溫，梯度變化速率2%/min2.1選擇梯度條件Part1梯度洗脫第16頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五B：梯度范圍箭頭為梯度完成時間如梯度過早結(jié)束（末峰離開柱之前），通常會增加運行時間，并使后面譜峰變寬（檢測靈敏度下降）相同色譜柱，流速，柱溫，梯度變化速率2%/min2.1選擇梯度條件梯度分離與終止流動相組成（%B）的關(guān)系Part1梯度洗脫第17頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五C：梯度形狀的影響梯度形狀

較陡的梯度可用于色譜圖峰分離寬闊的部分（以節(jié)省時間）；較平坦的梯度可用于色譜圖峰重疊擁擠的部分（以提高分離度）。線性折線形凹形凸形2.1選擇梯度條件Part1梯度洗脫第18頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五C：梯度形狀的影響經(jīng)過初步分離，一般可能得到3種分離色譜圖：①前重疊，后分離，保留時間太長；

②前分離，后重疊；③前后分離，中間重疊。2.1選擇梯度條件Part1梯度洗脫第19頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五2.2改變峰間距A：改變梯度變化速率（%B）-改變選擇性最有效的方法平坦梯度時峰3和4的分離最佳，而峰14和15則更適于較陡梯度分段梯度（折線形）梯度變化速率和形狀使分離發(fā)生很大改善8.6%/min3.0%/min4.8%/minPart1梯度洗脫2梯度洗脫方法的建立第20頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五B：改變?nèi)軇╊愋?對于中性樣品來說，改變有機(jī)溶劑可以改變選擇性前面峰對（2╱3）適合于乙腈洗脫，而后出峰對（8╱9）適合甲醇洗脫。應(yīng)增大甲醇╱乙腈比例的梯度Part1梯度洗脫2梯度洗脫方法的建立2.2改變峰間距第21頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五C：其他條件-主要針對離子樣品

pH離子對試劑的濃度溫度Part1梯度洗脫2梯度洗脫方法的建立2.2改變峰間距第22頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五2.3調(diào)整色譜柱條件當(dāng)針對參數(shù)k*和α（選擇性）優(yōu)化了保留值以后（包括可能采用分段梯度），再改變柱長、固定柱顆粒大小和流速等柱條件，還可進(jìn)一步改善分離。Part1梯度洗脫2梯度洗脫方法的建立第23頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五5%/min1ml/min->5%/ml5%/min2.5ml/min->2%/ml改變流速Part1梯度洗脫2梯度洗脫方法的建立2.3調(diào)整色譜柱條件第24頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五4.6x50mm

1. GLY-TYR 2. VAL-TYR-VAL 3. [GLU]-?

蛋白質(zhì)

AMYLOIDFRAGM1-16 4. [TYR8]血管舒緩激肽 5. MET-ENK 6. 亮氨酸腦菲肽 7. 血管緊張肽II 8. KINETENSIN 9. 核糖核酸酶 10. INS(EQUINE)4.6x150mm124568910k*=2.5k*=2.6k*=4.5k*=5.9300SB-C8,3.5μm梯度: 2-75%Bin30min.流動相: A=5:95,ACN:H2O0.1%TFA B=95:5,ACN:H2O0.085%TFA流速: 1mL/min.進(jìn)樣: 10μL,每種組分2.6μg溫度: 35°CUV: 215nm梯度陡時,使用短色譜柱(降低Vm)常常能改善分離度。73Part1梯度洗脫2梯度洗脫方法的建立2.3調(diào)整色譜柱條件第25頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五正確的柱長是多少?在允許的時間內(nèi)獲得最大分離：分析時間短-短柱，高流速分析時間長-長柱，正常流速Part1梯度洗脫2梯度洗脫方法的建立2.3調(diào)整色譜柱條件第26頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五3梯度洗脫注意事項（1）注意各溶劑間的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。例如：a乙腈和1mol/L的醋酸銨做梯度洗脫，乙腈含量超過70%時就會出現(xiàn)不溶。b甲醇和已烷混合，甲醇含量高于30%時就會分層等。c有機(jī)溶劑和緩沖溶液混合時還可能析出鹽的結(jié)晶體，尤其使用磷酸鹽時需特別小心。一般我們用的鹽濃度不超過0.2mol/ml，濃度太過容易析出，則有機(jī)相比例不得高于60%。（2）對溶劑的純度要求更高（影響重現(xiàn)性）。進(jìn)行樣品分析前必須進(jìn)行空白梯度洗脫，以辯認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰。（3）注意梯度變化時系統(tǒng)壓力的變化，防止超出限度。Part1梯度洗脫第27頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五3梯度洗脫注意事項（4）每次梯度洗脫之后必須使色譜柱恢復(fù)到初始的狀態(tài)。需讓約10倍柱容積的初始流動相流經(jīng)色譜柱，使固定相與初始流動相達(dá)到完全平衡。（梯度周期）（5）低壓梯度要注意脫氣，混合后容易產(chǎn)生氣泡。

用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止溶劑混合時產(chǎn)生氣泡。（6）容易出現(xiàn)鬼峰，應(yīng)作空白試驗。第一針一般不要，空白多做幾次，是兩次空白重合為止。進(jìn)空白能幫助你清楚了解產(chǎn)生的峰到底是樣品中的還是溶劑中的。（7）管路及柱子做梯度前要徹底的沖洗干凈，防止空白中過多鬼峰的出現(xiàn)。Part1梯度洗脫第28頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五3梯度洗脫注意事項（8）梯度選擇時盡量幾相之間相變化要小,否則不易平衡。（9）梯度洗脫應(yīng)使用對流動相組成變化不敏感的選擇性檢測器（如紫外吸收檢測器或熒光檢測器），而不能使用對流動相組成變化敏感的通用型檢測器（如示差折光檢測器）。（10）要注意水相中鹽的濃度，防止在有機(jī)相提升過程中鹽的析出。（11）使用緩沖鹽體系是需要注意切換時的過渡問題。

如果是緩沖鹽體系，一定要用大比例水好好的把柱子沖一下。另外，即使不使用含鹽的體系，也有可能出現(xiàn)梯度過程中兩相不混溶的問題，導(dǎo)致帶來的一系列異常情況的發(fā)生。所以應(yīng)對各流路流動相性質(zhì)作了解，注意溶解范圍以及梯度進(jìn)行的速率等情況。Part1梯度洗脫第29頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五Part2中藥多組分含量測定第30頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五中藥多組分含量測定中藥成分復(fù)雜,藥效部位不是單一成分,而是多種成分的混合物。在中藥制劑中,單一成分不能反映復(fù)方制劑的質(zhì)量,也并不能保證產(chǎn)品質(zhì)量上的均一性。利用復(fù)方制劑中某幾個有效成分作為指標(biāo)，通過同步測定,可以實現(xiàn)對多味藥材的多個成分含量測定,并更準(zhǔn)確表達(dá)中藥的質(zhì)量內(nèi)涵。Part2中藥多組分含量測定第31頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五1查文獻(xiàn)、看藥典2確定色譜條件和供試品制備方法3進(jìn)行方法學(xué)驗證4進(jìn)行含量測定中藥多組分含量測定

確定待測的有效成分（或指標(biāo)性成分）；了解這些成分的理化性質(zhì)；熟悉樣品提取的大概方法。第32頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五2確定色譜條件和供試品制備方法供試品制備方法的確定：

評價方法：a1個或多個指標(biāo)成分的含量；b出峰情況（出峰個數(shù)和峰形等）。篩選供試品制備方法時可能用到的實驗優(yōu)化方法：單因素設(shè)計正交設(shè)計均勻設(shè)計響應(yīng)曲面法確定色譜條件：

用混合對照品摸色譜條件

R＞1.0即可；fs盡量在0.95~1.05。

用樣品摸色譜條件

滿足系統(tǒng)適用性試驗要求Part2中藥多組分含量測定第33頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五3方法學(xué)驗證內(nèi)容驗證的內(nèi)容Part2中藥多組分含量測定3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性3.2專屬性3.3精密度3.4重復(fù)性3.5穩(wěn)定性3.6回收率3.7耐用性3.8定量限第34頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性

分別精密量取一定體積的混標(biāo)對照品儲備液，配成6份濃度不同的混和對照品溶液。按照確定的色譜條件進(jìn)樣,測定各對照品的峰面積。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，濃度（C,mg·mL-1）為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。確定線性范圍及r值。注意：a：先粗測樣品各物質(zhì)含量（如A物質(zhì)含量為0.05mg·mL-1），將這個含量作為線性中間點(混標(biāo)中A物質(zhì)的濃度可配成0.01、0.02、0.04、0.06、0.08和0.10mg·mL-1)；b：混標(biāo)中各物質(zhì)間的相對含量要盡量與樣品中的相對含量一致；c：Y=ax+b（r≥0.999），當(dāng)a＞100b時，可用外標(biāo)一點法(因為這是含量和響應(yīng)成正比)定量，否則用就用標(biāo)準(zhǔn)曲線法；d：測含量時不應(yīng)超出此范圍，標(biāo)曲范圍不能延長。Part2中藥多組分含量測定3方法學(xué)驗證內(nèi)容第35頁，共38頁，2023年，2月20日，星期五3.2專屬性除去含待測成分藥材，模擬處方制備中藥制