生物工程上游技術(shù)實(shí)驗(yàn)-生工16級(jí)

生物工程上游技術(shù)實(shí)驗(yàn)

（生工16級(jí)）實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（64學(xué)時(shí)）1、含質(zhì)粒的大腸桿菌的接種、培養(yǎng)與保藏（4學(xué)時(shí)）2、質(zhì)粒DNA的制備與質(zhì)量鑒定（6學(xué)時(shí)）3、質(zhì)粒DNA的片段化與分離（6學(xué)時(shí)）4、大分子DNA的制備和質(zhì)量鑒定（6學(xué)時(shí)）5、RNA的制備和質(zhì)量鑒定（6學(xué)時(shí)）6、PCR反應(yīng)（6學(xué)時(shí)）7、利用RT-PCR技術(shù)分析基因表達(dá)（6學(xué)時(shí)）8、PCR產(chǎn)品純化及克?。?學(xué)時(shí)）9、感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化（6學(xué)時(shí)）10、利用不同的方法篩選和鑒定轉(zhuǎn)化子

（綜合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，12學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)要求兩人一組，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)每次實(shí)驗(yàn)完成均要求寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告及做思考題不得曠課，特殊情況可補(bǔ)實(shí)驗(yàn)每次實(shí)驗(yàn)安排2人配制瓊脂糖凝膠考核前9個(gè)實(shí)驗(yàn)共計(jì)50分（實(shí)驗(yàn)報(bào)告和思考題）

（本部分成績也是《基因工程》的平時(shí)成績）綜合實(shí)驗(yàn)（包括設(shè)計(jì)報(bào)告）共計(jì)50分實(shí)驗(yàn)一

含質(zhì)粒的大腸桿菌的接種、培養(yǎng)與保藏一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解培養(yǎng)基的配制原理，掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟；2、了解常見滅菌基本原理及方法，掌握高壓蒸汽滅菌的操作方法；3、了解菌種保藏的基本原理，掌握菌種保藏方法和無菌操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)基是人工按一定比例配制的供微生物生長繁殖和合成代謝產(chǎn)物所需要的營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基的原材料可分為碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子和水。LB培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含有酵母抽提物、蛋白胨和氯化鈉。高壓蒸汽滅菌方法主要是通過升溫使蛋白質(zhì)變性從而達(dá)到殺死微生物的效果。微生物接種技術(shù)是進(jìn)行微生物實(shí)驗(yàn)和相關(guān)研究的基本操作技能，分為斜面接種、液體接種、固體接種和穿刺接種等。三、實(shí)驗(yàn)材料大腸桿菌DH5α（班長與學(xué)委各做1個(gè)）含pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α含pEGFP質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α四、主要試劑

酵母抽提物、蛋白胨、氯化鈉、氨芐青霉素等。五、實(shí)驗(yàn)步驟

1、配制LB液體培養(yǎng)基

稱胰蛋白胨0.4g，酵母提取物0.2g，NaCl0.4g，加入40mL蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，分裝于2個(gè)三角瓶中，每瓶20mL，用4層報(bào)紙包扎瓶口。2、培養(yǎng)基的滅菌將配制好的培養(yǎng)基放入高壓滅菌鍋中滅菌備用。3、液體培養(yǎng)基接種將滅菌培養(yǎng)基移入超凈工作臺(tái)內(nèi)；當(dāng)培養(yǎng)基溫度降至55~60℃后，加20μL氨芐青霉素（100mg/mL），然后接種含不同質(zhì)粒的菌種。4、大腸桿菌的培養(yǎng)大腸桿菌在液體培養(yǎng)基中，37℃，200轉(zhuǎn)/分鐘的搖床培養(yǎng)過夜。5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察第二天取出培養(yǎng)物，觀察記錄不同菌種生長情況（自己拍照）。6、菌種保藏（本次實(shí)驗(yàn)不做）取500μL過夜培養(yǎng)的菌液加入到已滅菌的1.5mL離心管中，再加入500μL已滅菌甘油水溶液（濃度為30~50%）；充分混勻，寫明菌種名稱、日期；將離心管置入裝有液氮的容器浸泡處理，用鑷子取出后立即放入-80℃冰箱中保存。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告的要求包括本次實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)材料及試劑、實(shí)驗(yàn)步驟、真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及詳細(xì)的結(jié)果分析、教材后面的思考題。實(shí)驗(yàn)二質(zhì)粒DNA的制備與質(zhì)量鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

學(xué)習(xí)并掌握基因工程操作技術(shù)中最常用的載體質(zhì)粒DNA的提取方法。二、實(shí)驗(yàn)原理

在堿性溶液中，雙鏈DNA氫鍵斷裂，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)遭破壞而發(fā)生變性，但由于質(zhì)粒DNA分子量相對(duì)較小，且呈環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)，即使在高堿性pH條件下，兩條互補(bǔ)鏈也不會(huì)完全分離，當(dāng)加入中和緩沖液時(shí)，變性質(zhì)粒DNA又恢復(fù)到原來的構(gòu)型；而線性的大分子量細(xì)菌染色體DNA則不能復(fù)性，與細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)、SDS等形成不溶性復(fù)合物，通過離心沉淀，細(xì)胞碎片、染色體DNA及大部分蛋白質(zhì)等可被除去，而質(zhì)粒DNA及小分子量的RNA則留在上清液中，再用酚/氯仿處理，可去除殘留蛋白質(zhì)，混雜的RNA可用RNA酶(RNAase)消除。三、實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑實(shí)驗(yàn)一的材料：含質(zhì)粒pEGFP或pUC19的大腸桿菌DH5α

主要試劑：

溶液I：50mM葡萄糖，10mMEDTA，

25mMTris-HCl（pH8.0），用前加溶菌酶4mg/L

溶液II：0.2mol/LNaOH溶液（內(nèi)含1%SDS）,現(xiàn)配現(xiàn)用溶液III（pH4.8）:60mL5mol/L醋酸鉀，11.5mL冰醋酸，

28.5mLH2O；飽和酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）、氯仿

TE緩沖液（pH8.0）:10mMTris-HCl，1mMEDTA，含RNA酶（RNaseA）:20μg/mL

醋酸鈉（pH5.2）、70%乙醇、無水乙醇四、實(shí)驗(yàn)步驟1)吸取1.4mL菌液至1.5mL離心管中。2)離心(8000r/min，1min)，棄上清液（根據(jù)菌液濃度判斷是否需要重復(fù)1~2次）。3)加入150μL溶液Ⅰ，用旋渦振蕩器充分懸浮菌體。4)加入200μL溶液Ⅱ，加蓋后溫和顛倒5~6次，直至呈透明狀。此步驟在5分鐘內(nèi)完成。5)加入150μL預(yù)冷的溶液Ⅲ，加蓋后反復(fù)顛倒混勻，直至出現(xiàn)白色絮狀沉淀，冰浴5min。6)離心(14000r/min，5min)，移取上清液于另一干凈離心管。7)向上清液中加等體積的苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1），振蕩混勻抽提，離心(14000r/min，5min)，溶液將出現(xiàn)分層。8)移取上層水相溶液（約450~500μL）于另一干凈離心管，加等體積氯仿，振蕩混勻抽提，離心(14000r/min，5min)，溶液將出現(xiàn)分層。9)移取上層水相溶液于另一干凈離心管，加入1/10體積的醋酸鈉（pH5.2）和2倍體積無水乙醇混勻，冰浴30min。10)離心(14000r/min，10min，4℃)，倒掉上清液。11)加0.5mL預(yù)冷的70%酒精振蕩，洗DNA沉淀一次，離心5min，倒掉上清液。12)真空抽干或室溫自然干燥.13)加20~30μLTE緩沖液使DNA完全溶解，室溫放置10min，降解RNA雜質(zhì)，少量用于瓊脂糖凝膠質(zhì)量檢測(cè)，剩余質(zhì)粒-20℃保存?zhèn)溆谩?4)1%瓊脂糖凝膠配制：稱取1g瓊脂糖粉末，加入100mL0.5倍TBE溶液，加熱熔化，稍降溫后，加入5μL溴化乙錠（EB），混勻，制備凝膠板，冷卻后備用。15)每位同學(xué)各取5μL質(zhì)粒DNA加入1μL6×loadingbuffer，混勻，進(jìn)行點(diǎn)樣。16)電泳條件：120v，40min；電泳完成后，膠塊通過凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并拍照記錄。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

觀察并分析電泳圖片六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告按實(shí)驗(yàn)內(nèi)容完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告及教材上的思考題。實(shí)驗(yàn)三質(zhì)粒DNA的片斷化及分離

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1、學(xué)習(xí)利用紫外分光光度法鑒定DNA質(zhì)量

2、采用Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳分析酶切效果。二、實(shí)驗(yàn)原理

DNA的吸收峰在260nm處，測(cè)定此波長下DNA溶液的OD值，當(dāng)OD260=1時(shí)，雙鏈DNA含量為50μg/mL，據(jù)此可用紫外分光光度計(jì)測(cè)定溶液中DNA含量。蛋白質(zhì)的吸收峰在280nm處，在測(cè)定DNA時(shí)，通過計(jì)算OD260/OD280值，可了解所測(cè)DNA的純度，如該值為1.7～2.0時(shí)，DNA純度高。已知Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶能專一識(shí)別堿基序列，并在該處切斷雙鏈DNA，形成一定長度的片段。酶切反應(yīng)需Mg2+等鹽離子，不同內(nèi)切酶對(duì)鹽離子有不同的要求，如鹽離子濃度使用不當(dāng)或甘油含量過高（﹥5%），會(huì)使酶的識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生改變，產(chǎn)生星活性。絕大多數(shù)酶的反應(yīng)溫度37℃。三、實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)二提取的質(zhì)粒DNA四、試劑

限制性核酸內(nèi)切酶XbaI；緩沖液10×MBuffer；0.1%BSA;0.5×TBEBuffer；1%瓊脂糖五、實(shí)驗(yàn)步驟

1、DNA含量的測(cè)定和純度分析

空白測(cè)定(Blank)：吸取200μLTE緩沖液至比色杯，進(jìn)行空白測(cè)定。

DNA測(cè)定(Sample)：取質(zhì)粒DNA1μL至一干凈的離心管，加入199μLTE緩沖液稀釋混勻，轉(zhuǎn)入比色杯，測(cè)定260nm及280nm的OD；計(jì)錄DNA濃度及OD260/OD280比值。2、酶切反應(yīng)

酶切反應(yīng)液的配制:

Xba

I1μL10×Mbuffer2μL0.1%BSA2μL

質(zhì)粒DNA2μL(根據(jù)濃度確定用量)ddH2O到20μL

酶切反應(yīng)條件：37℃水浴2～3小時(shí)。3、電泳檢測(cè)

反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液加2或4μL10×或6×loadingbuffer，混勻，以停止酶切反應(yīng)，所有樣品均點(diǎn)在一個(gè)點(diǎn)樣孔。電泳條件：100V,20分鐘左右。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

觀察并分析電泳圖片。七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告按實(shí)驗(yàn)內(nèi)容完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告及教材上的思考題。實(shí)驗(yàn)四大分子DNA的制備和質(zhì)量鑒定

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

采用CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法從植物組織中提取基因組DNA，并進(jìn)行DNA純度分析和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。二、實(shí)驗(yàn)原理

核酸是生物體的重要成分，在細(xì)胞中常與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，以核蛋白形式存在。在制備核酸時(shí)，通過研磨破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使核蛋白釋放出來。在濃NaCl溶液(1~2mol/L)中，DNA核蛋白的溶解度大，RNA核蛋白的溶解度??；而在稀NaCl溶液(0.14mol/L)中，DNA核蛋白的溶解度小，RNA核蛋白的溶解度大。因此，可利用不同濃度的NaCl溶液將DNA核蛋白和RNA核蛋白從樣品中分別抽提出來。CTAB是一種陽離子去污劑，具有從低濃度鹽溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高濃度鹽溶液中CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，而不能沉淀核酸。分離得到核蛋白后，可用氯仿等將蛋白等雜質(zhì)除去。有效制備大分子DNA的兩個(gè)原則：1）防止和抑制內(nèi)源DNase對(duì)DNA的降解。2）盡量減少對(duì)溶液中DNA的機(jī)械剪切破壞；所有操作均須溫和，避免劇烈震蕩。

三、實(shí)驗(yàn)材料：水稻葉片約0.2克四、實(shí)驗(yàn)試劑

1MTris-HCl(pH8.0)(提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞)

CTAB分離緩沖液：2%CTAB，1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA，100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，0.2%巰基乙醇(EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl提供高鹽環(huán)境，使DNA充分溶解，存在于液相中；β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易從基因組DNA中除去)

洗滌緩沖液：76%乙醇，10mmol/L乙酸銨氯仿-異戊醇(24:1)、異丙醇、TE緩沖液液氮五、實(shí)驗(yàn)步驟CTAB分離緩沖液置于60℃水浴中預(yù)熱；2人一組，摘取0.5g葉片，置于研缽中，倒入液氮，盡快將葉片研碎；取約0.2g葉片粉末加入到2.0mL離心管中，加入1mL預(yù)熱的CTAB分離緩沖液，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)使之混勻；樣品置于65℃保溫30min；加等體積(1mL)的氯仿-異戊醇，輕輕顛倒混勻；室溫下14000rpm離心10min；上層水相吸入另一干凈1.5mL離心管中，加入2/3體積的異丙醇，輕輕混勻，靜置5min，使核酸沉淀下來；室溫下10000rpm離心10min；棄去上清液，加入500μL洗滌緩沖液，懸浮混勻；4℃條件下，14000rpm離心10min；在室溫下使DNA沉淀干燥至周圍透明，中間有少許白色為止；將DNA沉淀溶于20μLTE中，-20℃保存?zhèn)溆?；?uLDNA溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢查所提取DNA的完整性；利用核酸蛋白檢測(cè)儀進(jìn)行DNA濃度和純度檢測(cè)。

（方法同實(shí)驗(yàn)二）六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

基因組DNA的濃度和純度；觀察并分析電泳圖片七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告按實(shí)驗(yàn)內(nèi)容完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告及教材上的思考題。實(shí)驗(yàn)五RNA的制備和質(zhì)量鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆绽迷噭┖刑崛≈参锛?xì)胞總RNA的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理

RNA是一類極易降解的分子，要得到完整的RNA，必須最大限度地抑制提取過程中內(nèi)源性及外源性RNA酶對(duì)RNA的降解。高濃度強(qiáng)變性劑異硫氰酸胍可溶解蛋白質(zhì)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使核蛋白與核酸分離，失活RNA酶，實(shí)驗(yàn)過程中可使從細(xì)胞中釋放出來的RNA不被降解。三、實(shí)驗(yàn)材料：水稻葉片約0.1克四、實(shí)驗(yàn)試劑柱式植物總RNA抽提試劑盒RLTSolution(4℃保存)能使細(xì)胞裂解，釋放出RNA的同時(shí)滅活RNase.吸附柱中的膜能選擇性地與RNA結(jié)合，而不能與蛋白質(zhì)等雜質(zhì)結(jié)合2.0mL收集管RWSolution

RPESolution(使用前加入4倍體積的無水乙醇)DEPC-H2O(0.01%焦碳酸二乙酯處理)五、實(shí)驗(yàn)步驟稱取0.1g葉片，在液氮中研磨成粉末狀，迅速轉(zhuǎn)移到離心管中；加入450uLRLTsolution到樣品中，劇烈振蕩混勻，1200rpm離心5min后，取上清液到另一干凈的離心管中；向上清液中加入1/2體積無水乙醇，用槍頭吸打混勻；將吸附柱套放于一個(gè)2mL的收集管中，將步驟3的混合液加到UNIQ-10柱中，8000rpm室溫離心1min，倒掉收集管中的廢液；將吸附柱放到同一個(gè)收集管中，加入500uLRWSolution到柱子中，室溫下放置1min，10000rpm室溫離心1min，倒掉收集管中的廢液；將吸附柱放到同一個(gè)收集管中，加入500uLRPESolution到柱子中，10000rpm室溫離心1min，倒掉收集管中的廢液；重復(fù)步驟6；將吸附柱放到同一個(gè)收集管中，10000rpm室溫離心1min，以除去殘留的RPEsolution；9.將吸附柱放到一個(gè)新的離心管中，加入50μLDEPC-H2O到UNIQ-10柱的膜中央，50℃下放置2min,10000rpm室溫離心1min，洗脫RNA，收集樣品。10.取1μL樣品，用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定RNA濃度和純度。11.制備的樣品-80℃保存，用于下次RT-PCR實(shí)驗(yàn)。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

總RNA的濃度和純度分析。七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告按實(shí)驗(yàn)內(nèi)容完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告及教材96頁的思考題。實(shí)驗(yàn)六PCR反應(yīng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

了解PCR的基本原理，掌握PCR的基本操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理PCR技術(shù)是通過模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的方式，在體外選擇性地將DNA某個(gè)特殊區(qū)域擴(kuò)增出來的技術(shù)。

PCR的過程：高溫變性：將反應(yīng)體系置于高溫下變性，使模板雙鏈DNA解鏈為兩條單鏈。低溫退火：引物與模板鏈結(jié)合，形成部分雙鏈DNA。中溫延伸：TaqDNA聚合酶使引物從5′端向3′端延伸，4種dNTP摻入合成新的DNA互補(bǔ)鏈。

反復(fù)進(jìn)行這種變性、退火和聚合反應(yīng)循環(huán)，可使兩端引物限定范圍內(nèi)的DNA序列以指數(shù)形式擴(kuò)增。三、實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)二所提質(zhì)粒pEGFP

四、試劑1.10×PCRbuffer、rTaq酶2.dNTPmixtures：dATP,dTTP,dGTP,dCTP各2.5mM3.引物(10μM)P1：GFP-F:5'-TAGTCGACTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’

(Tm=65.5℃)

(SalI)

P2:GFP-R:5'-GCGTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’

(Tm=61.5℃)(XbaI)5.1.5%瓊脂糖凝膠五、實(shí)驗(yàn)步驟1、PCR反應(yīng)混合液的配制(50μL)

10×PCRbuffer5μLdNTPmixture4μL

前向引物(P1)2μL

反向引物(P2)2μLDNA模板1.0μLrTaq酶0.5μL

滅菌蒸餾水35.5μL

所有試劑按量仔細(xì)添加后，輕輕混勻，稍離心后即可。

2、PCR儀的參數(shù)設(shè)置

94℃4min94℃30s

40cycles61℃30s72℃50s72℃5min3、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

反應(yīng)結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)品，加入1μL6×loadingbuffer，混勻后點(diǎn)樣，電泳15min。

其余45μLPCR產(chǎn)品保存在-20℃冰箱中，下次實(shí)驗(yàn)使用。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察并分析電泳圖片七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

按實(shí)驗(yàn)內(nèi)容完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告及教材79頁思考題。實(shí)驗(yàn)七利用RT-PCR技術(shù)分析基因表達(dá)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握RT-PCR技術(shù)的基本原理；學(xué)習(xí)利用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行基因表達(dá)分析。二、實(shí)驗(yàn)原理

RT-PCR技術(shù)是對(duì)目的基因的mRNA分子進(jìn)行體外擴(kuò)增的技術(shù)，可分成兩個(gè)部分：將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA;以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

RT-PCR技術(shù)分為兩步法或一步法。兩步法首先是以mRNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，然后在另一反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增；一步法是逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR擴(kuò)增在同一反應(yīng)體系中依次完成。本實(shí)驗(yàn)將利用一步法RT-PCR對(duì)水稻肌動(dòng)蛋白基因(Actin)在葉片細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平進(jìn)行分析。三、實(shí)驗(yàn)材料:

實(shí)驗(yàn)五的水稻葉片總RNA四、實(shí)驗(yàn)試劑

1.primeScript1stepEnzymemix

PrimescriptRTase,EXTaqHS,RNaseinhibitor

2.2×1stepbuffer

10×onestepRT-PCRbufferOnestepenhancersolutiondNTPmixture3.Actin基因特異引物(2.5μM)Actin-F：5’-TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3’Actin-R：5’-GTACCCGCATCAGGCATCTG-3’4.1.5%瓊脂糖凝膠五、實(shí)驗(yàn)步驟

1.RT-PCR反應(yīng)混合液的配制(25μL)

2×1stepbuffer12.5μL

primeScript1stepEnzymemix

1μLActin-F4μLActin-R4μL

水稻總RNA2μLDEPC-dH2O1.5μL

所有試劑按量仔細(xì)添加后，輕輕混勻，稍離心后即可，為了防止反應(yīng)混合液蒸發(fā)，最后添加20μL礦物油。2、PCR儀的參數(shù)設(shè)置

50℃30min94℃2min94℃30s

35cycles52℃30s72℃20s72℃5min3、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

反應(yīng)結(jié)束后，取5μL產(chǎn)品，加入1μL6×loadingbuffer，混勻后點(diǎn)樣，電泳15min。以Actin基因的mRNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增的目標(biāo)片段長度為335bp。如果RNA中含有DNA雜質(zhì)，將會(huì)同時(shí)以Actin基因的DNA為模板，PCR擴(kuò)增出一條418bp的條帶。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察并分析電泳圖片七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

按實(shí)驗(yàn)內(nèi)容完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告及教材思考題。實(shí)驗(yàn)八PCR產(chǎn)品純化及克隆一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

學(xué)習(xí)PCR產(chǎn)物純化的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，掌握基因工程操作技術(shù)中最常用的T-A克隆方法。二、實(shí)驗(yàn)原理

PCR產(chǎn)物一般都含有過量的引物、Taq酶及dNTP等成分，直接影響后續(xù)的DNA連接酶的連接反應(yīng);實(shí)驗(yàn)中可采用苯酚/氯仿/異戊醇、氯仿依次使反應(yīng)體系中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)變性的方法純化DNA產(chǎn)品，然后在酸性條件下用無水乙醇沉淀DNA。利用普通的TaqDNA聚合酶所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的3’-端具有一個(gè)A突出末端，T載體的5’-端具有一個(gè)T突出末端，二者正好互補(bǔ)，然后用T4DNA連接酶在體外將目的片段與線性化載體連接的方法稱為T-A克隆。

GAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGTTTGCACGCCTGCCGTTCGACGATt

tATCTCTGGAAGATCCGCGCGTPCR所用引物如下：

GFP-F:5'-TAGTCGACTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-5'

(Tm=65.5℃)

(SalI)

GFP-R:5'-GCGTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3‘

(Tm=61.5℃)(XbaI)三、實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)四的PCR產(chǎn)品

pMD19-TVector四、試劑TE緩沖液苯酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)、氯仿醋酸鈉（pH5.2）、無水乙醇、70%乙醇T4DNA連接酶混合物(SolutionI)五、實(shí)驗(yàn)步驟1、PCR產(chǎn)品純化將PCR產(chǎn)品（約45μL）小心轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，加入55μLTE緩沖液至總體積100μL，混勻；加入100μL苯酚/氯仿/異戊醇，渦旋混合1min，14000rpm離心5min；將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管，加入100μL氯仿，渦旋混合1min，14000rpm離心5min；再將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管，加10μL醋酸鈉（pH=5.2）和250μL無水乙醇，顛倒混勻，將離心管插入冰中放置30min；在4℃，14000rpm離心10min，棄去上清液，觀察DNA沉淀；加入500μL預(yù)冷70％乙醇，洗滌DNA沉淀,4℃14000rpm離心5min，棄去上清液；空氣干燥DNA沉淀，加4.5μL無菌水溶解

DNA。2、連接反應(yīng)經(jīng)純化的PCR產(chǎn)品4.5μL轉(zhuǎn)移到PCR管中，加入0.5μLpMD19-T載體，再加入5μLT4DNA連接酶混合物（SolutionI），輕輕混勻，稍加離心即可；連接反應(yīng)混合物放置在PCR儀中，16℃連接過夜；連接產(chǎn)物用于下次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須等到下次實(shí)驗(yàn)完成后才能確定是否連接成功。七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

按實(shí)驗(yàn)內(nèi)容完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告及教材上的思考題。（下周不用交報(bào)告，實(shí)驗(yàn)六完成后再交）實(shí)驗(yàn)九感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饧?xì)胞轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學(xué)研究中的意義。學(xué)習(xí)用氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的方法。學(xué)習(xí)外源DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌受體細(xì)胞的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理

轉(zhuǎn)化是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株(R-，M-)，這些變異株可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細(xì)胞經(jīng)過一些化學(xué)試劑如CaCl2、RbCl等處理后，細(xì)胞膜的通透性會(huì)發(fā)生暫時(shí)性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制，表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。

三、實(shí)驗(yàn)材料

E.coliDH5α菌株：R-，M-，Amp-

實(shí)驗(yàn)八的連接產(chǎn)物四、試劑

1、含氨芐青霉素(Amp,100mg/L)的LB固體培養(yǎng)基

2、X-gal儲(chǔ)存液（20mg/mL）

3、IPTG儲(chǔ)存液（200mg/mL）

4、0.05mol/LCaCl2溶液五、實(shí)驗(yàn)步驟1、受體菌的培養(yǎng)

從LB平板上挑取新鮮活化的E.coliDH5α單菌落，接種于3-5mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)12h左右，直至對(duì)數(shù)生長后期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2-3h至OD600=0.5左右。

(實(shí)驗(yàn)老師已幫大家完成)2、感受態(tài)細(xì)胞的制備(CaCl2法)吸取1.5mL培養(yǎng)液到一滅菌的離心管中，將離心管插入冰中放置10min，然后于4℃下10000rpm離心10min。棄去上清，用1mL預(yù)冷的0.05mol/LCaCl2

溶液輕輕懸浮細(xì)胞，將離心管插入冰中放置30min，4℃下10000rpm離心10min。棄去上清，加入100μl預(yù)冷的0.05mol/LCaCl2溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰中放置幾分鐘，即成感受態(tài)細(xì)胞。3、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

向制備的感受態(tài)細(xì)胞中加入10μL連接產(chǎn)物，輕輕搖勻，插入冰中，放置30min。含有混合物的離心管置入42℃水浴中熱擊90秒，熱擊后迅速插入冰中，冷卻3-5min。向離心管中加入900μLLB液體培養(yǎng)基，混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1~2h，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr)。4、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的涂布篩選培養(yǎng)基(含X-gal和IPTG)的準(zhǔn)備：在事先制備好的含100mg/LAmp的LB平板表面（中央位置）加40μLX-gal儲(chǔ)存液和4μLIPTG儲(chǔ)存液，用無菌玻棒將溶液涂布均勻，置于超凈工作臺(tái)上，使培養(yǎng)基表面的液