環(huán)境工程微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

環(huán)境工程微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)第1頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一顯微鏡的結(jié)構(gòu)和使用實(shí)驗(yàn)一第2頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一一、顯微鏡的結(jié)構(gòu)顯微鏡機(jī)械部分光學(xué)部分鏡座、鏡柱、鏡臂、鏡筒傾斜關(guān)節(jié)、轉(zhuǎn)換器載物臺(tái)目鏡、物鏡遮光器反光鏡第3頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一第4頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一二.顯微鏡的使用一、取鏡和安放1．右手握住鏡臂，左手托住鏡座

第5頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一2．把顯微鏡放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，略偏左（顯微鏡放在距實(shí)驗(yàn)臺(tái)邊緣7厘米左右）。安裝好目鏡和物鏡。顯微鏡的使用第6頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一二、對(duì)光3．轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，使低倍物鏡對(duì)準(zhǔn)通光孔(物鏡的前端與載物臺(tái)要保持5厘米的距離)。顯微鏡的使用第7頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一顯微鏡的使用三、觀察

5．把所要觀察的玻片標(biāo)本放在載物臺(tái)上，用壓片夾壓住，標(biāo)本要正對(duì)通光孔的中心。第8頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一6．轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦螺旋，使鏡筒緩緩下降，直到物鏡接近玻片標(biāo)本為止（眼睛看著物鏡，以免物鏡碰到玻片標(biāo)本）。7．向目鏡內(nèi)看，同時(shí)反方向轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦螺旋，使鏡筒緩緩上升，直到看清物像為止。再略微轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋，使看到的物像更加清晰。顯微鏡的使用第9頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一8、換高倍物鏡：如果進(jìn)一步使用高倍物鏡觀察，應(yīng)在轉(zhuǎn)換高倍物鏡之前，把物像中需要放大觀察的部分移至視野中央（將低倍物鏡轉(zhuǎn)換成高倍物鏡觀察時(shí)，視野中的物像范圍縮小了很多）。如果換高倍物鏡后物像不一定很清晰，可以轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋進(jìn)行調(diào)節(jié)。在轉(zhuǎn)換高倍物鏡并且看清物像之后，可以根據(jù)需要調(diào)節(jié)光圈或聚光器，使光線符合要求（一般將低倍物鏡換成高倍物鏡觀察時(shí)，視野要稍變暗一些，所以需要調(diào)節(jié)光線強(qiáng)弱）。第10頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一1.轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡使視野明亮2.在低倍鏡下觀察清楚后，把要放大觀察的物像移至視野中央3.轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，換成高倍物鏡4.觀察并用細(xì)準(zhǔn)焦螺旋調(diào)焦高倍鏡的使用第11頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一取鏡和安放對(duì)光（選擇低倍鏡、反光鏡、光圈）固定裝片轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦螺旋，鏡筒緩緩下降（目視物鏡與裝片之間）反向轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦螺旋，鏡筒上升，直至看到物像移動(dòng)目標(biāo)至視野中央更換高倍物鏡轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋至標(biāo)本影像清晰為止調(diào)節(jié)反光鏡、光圈光學(xué)顯微鏡載物臺(tái)上升載物臺(tái)下降第12頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一3.使用顯微鏡的注意事項(xiàng)

（1）顯微鏡安放位置，顯微鏡應(yīng)安放在離桌邊緣5cm、鏡筒向前，并講清顯微鏡位置稍靠左側(cè)的道理（兩眼同時(shí)睜開觀察，眼不易疲勞，便于繪圖。）

（2）對(duì)光根據(jù)光線的強(qiáng)弱來選擇平面鏡或凹面鏡；用低倍鏡進(jìn)行對(duì)光，把低倍鏡位置放低；在轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器時(shí)，物鏡到位，光圈調(diào)節(jié)好，視野光線均勻、明亮.

第13頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一（3）正確使用高倍物鏡的方法

由于高倍物鏡的工作距離小，鏡頭易損壞，,并且把光圈開大。

（4）重視準(zhǔn)焦螺旋的使用

在使用高倍物鏡時(shí)，不要調(diào)節(jié)粗準(zhǔn)焦螺旋，避免物鏡損壞、裝片壓爛。

（5）不是倍數(shù)越大，越清晰

如果目鏡倍數(shù)過大，得到的放大虛像則很不清晰。在低倍鏡下能看清楚的物像，不必用高倍鏡觀察。

3.使用顯微鏡的注意事項(xiàng)第14頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一視野中物像與標(biāo)本移動(dòng)的關(guān)系：如視野中某觀察對(duì)象位于左下方如何移到中央，應(yīng)將裝片或切片向左下方移動(dòng)（同向移動(dòng)）。原因是視野中物像移動(dòng)的方向或切片移動(dòng)的方向相反第15頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一使用高倍鏡觀察的步驟和要點(diǎn)是：（1）首先用低倍鏡觀察，找到要觀察的物像，移到視野的中央。（2）轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，用高倍鏡觀察，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋，直到看清楚材料為止。第16頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一高倍顯微鏡的使用

（1）是低倍鏡還是高倍鏡的視野大，視野明亮？為什么？低倍鏡的視野大，通過的光多，放大的倍數(shù)?。桓弑剁R的視野小，通過的光少，但放大的倍數(shù)高。

（2）為什么要先用低倍鏡觀察清楚后，把要放大觀察的物像移至視野的中央，再換高倍鏡觀察?如果直接用高倍鏡觀察，往往由于觀察的對(duì)象不在視野范圍內(nèi)而找不到。因此，需要先用低倍鏡觀察清楚，并把要放大觀察的物像移至視野的中央，再換高倍鏡觀察。

（3）用轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)過高倍鏡后，轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦螺旋行不行？不行。用高倍鏡觀察，只需微調(diào)即可。轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦螺旋，容易壓壞玻片。

第17頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一污點(diǎn)判斷：玻片移，污點(diǎn)移，則污點(diǎn)在玻片上；物鏡換，污點(diǎn)移，則污點(diǎn)在物鏡上；目鏡轉(zhuǎn)，污點(diǎn)移，則污點(diǎn)在目鏡上第18頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一目鏡5X、物鏡4X、視野中央有一排細(xì)胞共15個(gè)。若把物鏡換成10X，則細(xì)胞數(shù)目為（）個(gè)。因?yàn)橐曇爸械募?xì)胞數(shù)目與放大倍數(shù)成反比；若目鏡5X，物鏡4X，視野中共有50個(gè)細(xì)胞，再把物鏡換成10X，則視野中有（）個(gè)細(xì)胞。因?yàn)橐曇爸锌吹降膶?shí)物的范圍與放大倍數(shù)的平方成反比。練習(xí)：第19頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一洋蔥鱗葉表皮細(xì)胞(10×10)第20頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一洋蔥鱗葉表皮細(xì)胞(10×40)第21頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一洋蔥鱗葉表皮細(xì)胞(10×40)第22頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一洋蔥鱗葉表皮細(xì)胞裝片（10×40）細(xì)胞壁細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)(液泡)第23頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一實(shí)驗(yàn)二

培養(yǎng)基的配制和滅菌

第24頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.熟悉玻璃器皿的洗滌和滅菌前的準(zhǔn)備。

2.掌握培養(yǎng)基和無菌水的制備方法。

3.掌握高壓蒸氣滅菌技術(shù)。第25頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)基是用人工的辦法將多種營養(yǎng)物質(zhì)按微生物生長代謝的需要配制成的一種營養(yǎng)基質(zhì)。培養(yǎng)基中均應(yīng)含有滿足微生物生長發(fā)育且比例合適的水分、碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因素以及某些特需的微量元素外還應(yīng)具有適宜的酸堿度〔pH值〕、緩沖能力、氧化還原電位和滲透壓。

第26頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一實(shí)驗(yàn)器材(1)藥品和試劑：牛肉膏、蛋白陳、NaCl、10％NaOH溶液、l0％鹽酸溶液、瓊脂、水(2)器材：小燒杯、小鋁鍋、天平、牛角匙、1000mL刻度燒杯、玻棒、玻璃珠、pH試紙、試管、分裝漏斗、棉花。高壓蒸氣滅菌鍋、烘箱。第27頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一實(shí)驗(yàn)步驟一、玻璃器皿的洗滌和包裝清洗并烘干玻璃器皿：如培養(yǎng)皿、移液管、試管等。棉塞的制作包裝培養(yǎng)皿和移液管等。

2-1棉塞制作方法2-2移液管滅菌前的包裝第28頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一二、培養(yǎng)基的配制

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制（一）培養(yǎng)基配方：

牛肉膏2.5g蛋白胨5.0g、NaCl2.5g、瓊脂10.0g、自來水500mL、pH7.2~7.4。（二）操作步驟：

1.取一個(gè)1000mL燒杯，裝500mL蒸餾水。

2.按配方逐一正確稱取各種成分，依次加入水中溶解。注意：a.前一種成分溶解之后，才能加入下一種成分

b.蛋白胨、肉膏可加熱促進(jìn)溶解

c.加熱過程應(yīng)不斷攪拌，以免糊底燒焦，并適當(dāng)補(bǔ)充因蒸發(fā)而損失的水量。第29頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一

3.調(diào)pH值：用10％NaOH調(diào)pH至7.2~7.4，用精密pH試紙對(duì)照。

4.過濾

液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過濾，以利結(jié)果的觀察。但是供一般使用的培養(yǎng)基，該步可省略。

5.分裝：將培養(yǎng)基分裝于5支試管，其余全部倒入250mL錐形瓶中，分別塞上棉塞。分裝時(shí)可用漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上面造成污染(見圖2－3)。分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的1／5，滅菌后制成斜面（圖2－4）。分裝入錐形瓶內(nèi)以不超過其容積的3/5為宜。半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/3為宜．滅菌后垂直待凝。注意不要污染棉塞和瓶口。

6.包扎成捆，掛上標(biāo)簽，注明何種培養(yǎng)基。

7.滅菌備用：滅菌條件：1210C（相當(dāng)蒸汽壓力0.103MPa）培養(yǎng)基滅菌后必須在37℃下恒溫培養(yǎng)24h，確定無菌生長，方可使用。第30頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一

圖例

圖2－3培養(yǎng)基分裝圖2－4斜面制作第31頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一三、稀釋水的制備

1.取一個(gè)250mL的錐形瓶裝90(或99)mL蒸餾水，放30顆玻璃珠(用于打破活性污泥、菌塊或土壤顆粒)于錐形瓶內(nèi)，塞棉塞、包扎，待滅菌。

2.另取5支18mm×180mm的試管，分別裝9mL蒸餾水，塞棉塞、包扎，待滅菌。

無菌稀釋水為微生物分離實(shí)驗(yàn)中所需要的材料。第32頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一四、滅菌加熱滅菌有干熱滅菌和濕熱滅菌。干熱滅菌法：電熱烘箱作為干熱滅菌器干熱滅菌的操作方法

a.將待滅菌的物品放入恒溫箱，將溫度調(diào)節(jié)至160℃并維持2h；

b.把恒溫箱的調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)回零處，待溫度降到50℃左右，才能將物品取出。第33頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一濕熱滅菌：高壓蒸氣滅菌法

高壓蒸氣滅菌法的操作步驟如下：1.滅菌鍋內(nèi)加入一定量的水。

2.將待滅菌的物品放入鍋內(nèi)，并關(guān)嚴(yán)鍋蓋。

注意：器物不能裝得太滿。

3.接通電源，進(jìn)行加熱。4.排除高壓鍋內(nèi)的冷空氣，可將排氣閥打開，待溫度計(jì)指示溫度為100℃時(shí)關(guān)閉排氣閥；或當(dāng)排出的蒸氣相當(dāng)猛烈且微帶藍(lán)色時(shí)關(guān)閉排氣閥。第34頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一

5.當(dāng)壓力達(dá)1.05kg/cm2(滅菌器內(nèi)的溫度為121℃)即開始滅菌，使其維持15～30min。對(duì)熱不穩(wěn)定的培養(yǎng)基如含有葡萄糖、氨基酸等物質(zhì)時(shí)，應(yīng)適當(dāng)降低壓力(0.56kg/cm2)，延長時(shí)間。6.滅菌時(shí)間一到，切斷電源，待壓力降至零時(shí)，才能打開排氣閥，然后打開滅菌器蓋，取出物品，排出鍋內(nèi)剩余水。

7.待培養(yǎng)基冷卻后置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，若無菌生長則放入冰箱或陰涼處保存?zhèn)溆?。?5頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一間歇滅菌法：即常壓滅菌，用于一些受高溫而破壞的培養(yǎng)基的滅菌。操作方法：

a.待滅菌的物品放在滅菌器或蒸籠里，每天蒸煮1次，每次在100℃煮沸30～60min，連續(xù)3d重復(fù)進(jìn)行。

b.在每兩次蒸煮之間，將物品（指培養(yǎng)基）放在37℃恒溫條件下培養(yǎng)24h，這樣可以使每次蒸煮后未殺死殘留的芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)體，以便下次蒸煮時(shí)殺滅。

c.第三次蒸煮之后基本無菌，但為了確保無菌仍要放在37℃恒溫條件下培養(yǎng)24h，確定無菌才能使用。第36頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一

過濾除菌法：

不能用加熱滅菌的液體物質(zhì)（如維生素、血清），一般可用細(xì)菌過濾器進(jìn)行除菌。

用于除菌的濾器：a.蔡氏濾器，b.注射器裝置濾器第37頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一思考題

1.配制培養(yǎng)基有哪幾個(gè)步驟?在操作過程中應(yīng)注意些什么問題?為什么?2.培養(yǎng)基配制完成后，為什么必須立即滅菌?若不能及時(shí)滅菌應(yīng)如何處理？已滅菌的培養(yǎng)基進(jìn)行無菌檢查？

3.高壓蒸汽滅菌中為什么要把冷空氣排凈，為什么在滅菌后不能驟然快速降壓，并要再放盡鍋內(nèi)蒸汽才能打開鍋蓋?

第38頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一實(shí)驗(yàn)三

細(xì)菌純種分離、培養(yǎng)和接種技術(shù)第39頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.掌握從環(huán)境（土壤、水體、活性污泥、垃圾、堆肥等）中分離培養(yǎng)細(xì)菌的方法，從而獲得若干種細(xì)菌純培養(yǎng)技能。

2.掌握幾種接種技術(shù)。第40頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一實(shí)驗(yàn)器材

無菌培養(yǎng)皿(直徑90mm)10套、無菌移液管1mL2支、10mL1支。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基1瓶，活性污泥或土壤或湖水1瓶，無菌稀釋水90mL1瓶、9mL5管。其它：接種環(huán)、酒精燈、恒溫箱。第41頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一實(shí)驗(yàn)步驟一、細(xì)菌的純種分離

第42頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一(一)稀釋平板法

1.取樣用無菌錐形瓶到現(xiàn)場(chǎng)取一定量的湖水，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。

2.稀釋水樣將1瓶90mL和5管9mL無菌水排列好，用記號(hào)筆依次編上10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6。在無菌操作條件下，用10mL的無菌移液管吸取10mL水樣(或其它樣品)加入編號(hào)為10－1無菌水(內(nèi)含玻璃珠)中，將移液管吹洗三次，用手搖10min將顆粒狀樣品打散。即為10－1濃度的菌液。用1mL無菌移液管吸取1mL10－1濃度的菌液于編號(hào)為10－2無菌水中，將移液管吹洗三次，搖勻即為10－2濃度菌液。同樣方法，依次稀釋到10－6

。第43頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一稀釋液的制備10mL試樣90mL蒸餾水第44頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一

3.平板的制作①取10套無菌培養(yǎng)皿編號(hào)，10－4、10－5、10－6各3個(gè)，另一個(gè)為空氣對(duì)照。②取1支1mL無菌移液管從濃度小的菌液開始，以10－6、10－5、10－4為序分別吸取0.5mL菌液于相應(yīng)編號(hào)的培養(yǎng)皿內(nèi)(每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混勻)。第45頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一③加熱培養(yǎng)基，當(dāng)其冷至45℃左右時(shí)，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拿培養(yǎng)皿，以中指、無名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋，靠近火焰，將皿蓋掀開，倒入培養(yǎng)基后將培養(yǎng)皿平放在桌上，順時(shí)針和逆時(shí)針來回轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基和菌液充分混勻，冷凝后即成平板，倒置于30℃培養(yǎng)24～48h，然后觀察結(jié)果。

a:皿法b:倒平板第46頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一④取對(duì)照無菌培養(yǎng)皿，倒平板待凝固后，打開皿蓋10min后蓋上，倒置于30℃培養(yǎng)24～48h，然后觀察結(jié)果。第47頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一（二）平板劃線法

1.平板制作：將融化并冷至約50℃的肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，使凝固成平板。

2.劃線：用接種環(huán)挑取一環(huán)樣品，左手拿培養(yǎng)皿，中指、無名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋，將培養(yǎng)皿稍傾斜，左手拇指和食指將皿蓋掀半開，右手將接種環(huán)伸入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板上輕輕劃線(切勿劃破培養(yǎng)基)。劃線完畢蓋好皿蓋，30℃培養(yǎng)24～48h后觀察結(jié)果。第48頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一平板劃線分離的劃線方法

左：連續(xù)劃線法（1，2依次劃線的起點(diǎn)）右：分區(qū)劃線法（1，2，3，4依次劃線的起點(diǎn)）第49頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一

二、細(xì)菌的接種技術(shù)接種方法：常用的有斜面接種法、平板接種法、液體接種法、試管深層固體培養(yǎng)基的穿刺接種法。接種工具：常用的有接種針、接種環(huán)、接種鉤、接種圈、接種鏟或接種鋤、玻璃涂棒等。第50頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一

（一）斜面接種法①左手平托兩支試管，拇指壓住兩支試管。外側(cè)是菌種試管，內(nèi)側(cè)是待接種的空白斜面(兩支試管的斜面同時(shí)向上)

。右手將棉塞旋松，以便在接種時(shí)容易拔出。②右手拿接種環(huán)，在火焰上先將環(huán)端燒紅滅菌，然后將有可能伸入試管的其余部位也過火滅菌。③將兩支試管的上端并齊，靠近火焰，用右手小指、無名指和手掌將兩支試管的棉塞一并夾住拔出，棉塞仍夾在手中，然后讓試管口緩緩過火焰。123第51頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一④將已灼燒過的接種環(huán)伸入菌種試管內(nèi)。先冷卻，而后再用環(huán)挑取少許菌種，將接種環(huán)抽出并迅速伸入待接種試管底部，在斜面上由底部向上劃線。抽出接種環(huán)，塞上棉塞將試管插在試管架上，最后再次燒紅接種環(huán)，則接種完畢。45678第52頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一

（二）液體接種和穿刺接種1.液體接種法(從斜面菌種接入培養(yǎng)液)：用接種環(huán)挑取斜面菌種送入培養(yǎng)液中，使環(huán)在液體表面與管壁接觸輕輕研磨，將環(huán)上的菌種全部洗入培養(yǎng)液中，取出接種環(huán)塞上棉塞。將試管輕輕撞擊手掌使菌體在培養(yǎng)液中均勻分布。最后將接種環(huán)燒紅滅菌。2.穿刺接種法(從斜面菌種接入(半)固體培養(yǎng)基)：用接種針經(jīng)火焰滅菌后，挑取少量菌種，垂直地穿入試管固體培養(yǎng)基中心至底部，然后穿刺線緩慢將針抽出，塞上棉塞。燒紅接種針滅菌，則接種完畢。第53頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一

（三）稀釋平板涂布法1.稀釋樣品：方法同稀釋平板分離法2.倒平板：將融化并冷至50℃左右的培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，冷凝后即成平板3.用無菌移液管吸取一定量的經(jīng)適當(dāng)稀釋的標(biāo)志樣品液于平板上，換上無菌玻璃刮刀在平板上旋轉(zhuǎn)涂布均勻4.將培養(yǎng)皿正擺在恒溫箱中，調(diào)節(jié)一定溫度進(jìn)行培養(yǎng)。如果培養(yǎng)時(shí)間較長，次日把培養(yǎng)皿倒置繼續(xù)培養(yǎng)，直至長出菌落。第54頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一（四）液體培養(yǎng)基中的菌種接入液體培養(yǎng)基接種工具：無菌移液管和無菌滴管移液管和滴管不能在火焰上燒，應(yīng)預(yù)先滅菌用無菌移液管自菌種管中吸取一定量的菌液接到另一管液體培養(yǎng)基中，將試管塞好棉塞即可。第55頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一思考題

1.斜面接種取菌前為什么要將灼燒過的接種針在無菌培養(yǎng)基上沾一下？

2.用一根無菌移液管接種幾種濃度的水樣時(shí)，應(yīng)從哪個(gè)濃度開始？為什么？第56頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一實(shí)驗(yàn)?zāi)康娜旧砣旧椒▽?shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)四革蘭氏染色法第57頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.學(xué)習(xí)微生物涂片，染色原理和染色的基本操作技術(shù)，從而掌握微生物的一般染色法和革蘭氏染色法。

2.鞏固顯微鏡（油鏡）的使用方法和無菌操作技術(shù)。第58頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一二、染色原理由于微生物細(xì)胞含有大量水分，對(duì)光線的吸收和反射與水溶液的差別不大,機(jī)體是無色透明的，與周圍背景沒有明顯的反差,在普通光學(xué)顯微鏡下不易識(shí)別，必須對(duì)它們進(jìn)行染色，使經(jīng)染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。微生物細(xì)胞是由蛋白質(zhì)、核酸等兩性電解質(zhì)及其他化合物組成。所以，微生物細(xì)胞表現(xiàn)出兩性電解質(zhì)的性質(zhì)。兩性電解質(zhì)兼有堿性基和酸性基，在酸性溶液中離解出堿性基呈堿性帶正電。在堿性溶液中離解出酸性基呈酸性帶負(fù)電。經(jīng)測(cè)定，細(xì)菌等電點(diǎn)pH在2-5之間，故在中性、堿性或偏酸性溶液中，細(xì)菌的等電點(diǎn)均低于上述溶液的pH值，所以細(xì)菌帶負(fù)電荷，容易與帶正電荷的堿性染料結(jié)合，故用堿性染料染色的較多。微生物體內(nèi)各結(jié)構(gòu)與染料結(jié)合力不同，故可用各種染料分別染微生物的各結(jié)構(gòu)以便觀察。第59頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一三、染色方法(一)簡單染色法簡單染色法又叫作普通染色法，只用一種染料使細(xì)菌染上顏色，如果僅為了在顯微鏡下看清細(xì)菌的形態(tài)，用簡單染色即可。第60頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一(二)復(fù)染色法用兩種或多種染料染細(xì)菌，目的是為了鑒別不同性質(zhì)的細(xì)菌，所以又叫鑒別染色法。主要的復(fù)染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法。革蘭氏染色法：不僅能觀察到細(xì)菌的形態(tài)，而且還可將所有細(xì)菌區(qū)分為兩大類：染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱為革蘭氏陽性細(xì)菌，用G+表示；染色反應(yīng)呈紅色（復(fù)染顏色）的稱為革蘭氏陰性細(xì)菌，用G-表示。細(xì)菌對(duì)革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。第61頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一四、實(shí)驗(yàn)材料1.顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙、接種環(huán)、載玻片、酒精燈等。2.石炭酸復(fù)紅染液、草酸銨結(jié)晶紫染液、碘液、95％乙醇、番紅（沙黃）染液3.菌種：表皮球菌、變形桿菌第62頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一五、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟(一)細(xì)菌的簡單染色步驟涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→鏡檢1．涂片取干凈的載玻片于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，在載玻片的中央滴一滴無菌蒸餾水，將接種環(huán)在火焰上燒紅，待冷卻后從斜面挑取少量菌種(表皮球菌或變形桿菌)與玻片上的水滴混勻后，在載玻片上涂布成一均勻的薄層，涂布面不宜過大。2．干燥涂片最好在室溫下使其自然干燥，有時(shí)為了使之干得更快些，可將標(biāo)本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時(shí)間過長，以防標(biāo)本烤枯而變形。

第63頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一3．固定固定常常利用高溫，手持載玻片的一端，標(biāo)本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過2~3次，共約2~3秒鐘，并不時(shí)以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60℃）,放置待冷后，進(jìn)行染色。4．染色在涂片薄膜上滴加染色液(石炭酸復(fù)紅、草酸銨結(jié)晶紫或美藍(lán)任選一種)一滴，使染色液覆蓋涂片，染色約1min。5．水洗斜置載玻片，在自來水龍頭下用小股水流沖洗，直至洗下的水呈無色為止。6．干燥用吸水紙吸去涂片邊緣的水珠，置于室溫下自然干燥。用吸水紙時(shí)切勿將菌體擦掉。

第64頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一7．鏡檢用顯微鏡觀察，并用鉛筆繪出細(xì)菌形態(tài)圖。(二)細(xì)菌的革蘭氏染色步驟

涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脫色→水洗→復(fù)染→水洗→干燥→觀察1．取表皮球菌和變形桿菌(均以無菌操作)分別在同一張載玻片上做涂片、干燥、固定，方法均與簡單染色的相同。2．用草酸銨結(jié)晶紫染色1min后水洗。3．加碘液媒染1min后水洗。4．斜置載玻片，滴加95％乙醇脫色，至流出的乙醇不現(xiàn)紫色為止，大約需時(shí)20~30s，隨即水洗。第65頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一5．用沙黃染液復(fù)染1min，水洗。6．用吸水紙吸掉水滴，待標(biāo)本片干后置顯微鏡下，用低倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)目的物后用油鏡觀察，注意細(xì)菌細(xì)胞的顏色。繪出細(xì)菌的形態(tài)圖并說明革蘭氏染色的結(jié)果。第66頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一六、注意事項(xiàng)1．革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是脫色時(shí)間，如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而被誤認(rèn)為革蘭氏陰性菌；如脫色時(shí)間過短，革蘭氏陰性菌也會(huì)被誤認(rèn)為是革蘭氏陽性菌。因此必須嚴(yán)格把握脫色時(shí)間。

2．選用培養(yǎng)18-24小時(shí)菌齡的細(xì)菌為宜，若細(xì)菌太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。第67頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一思考題1．作革蘭氏染色涂片為什么不能過于濃厚？其染色成敗的關(guān)鍵一步是什么？2．通過革蘭氏染色，你認(rèn)為它在微生物學(xué)中有何實(shí)踐意義？七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果簡單染色：表皮球菌和變形桿菌染成（）色。革蘭氏染色（變形桿菌與表皮球菌）；將結(jié)果填于下表中第68頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一第69頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一第70頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一第71頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一第72頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一第73頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一

實(shí)驗(yàn)五：酵母菌和霉菌的形態(tài)學(xué)觀察1、菌種：酵母菌、霉菌2、培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基3、染色劑：乳酸酚棉藍(lán)染色液一、目的和要求：1、掌握酵母菌的形態(tài)、培養(yǎng)特性及培養(yǎng)方法2、掌握霉菌的形態(tài)、培養(yǎng)特性及培養(yǎng)方法二、材料：第74頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一1、形態(tài)特征：酵母菌是單細(xì)胞的個(gè)體，長約7.2um，寬度

5.6um，呈圓形、橢圓形、卵圓形、臘腸形、圓柱形等，一般比細(xì)菌大，不生菌絲?？梢姷矫黠@的細(xì)胞核及核膜。①壓片標(biāo)本檢查法：取潔凈載玻片，滴加生理鹽水1滴，以白金耳蘸取被檢材料，混勻后蓋上蓋玻片，即可直接鏡檢。②染色檢查法：標(biāo)本面上滴加乳酸酚棉藍(lán)染色劑，蓋上蓋玻片，放置10－15分鐘后鏡檢。（一）酵母菌形態(tài)及培養(yǎng)性狀的觀察：三、操作方法：酵母菌電鏡照片第75頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一2、培養(yǎng)性狀：

酵母菌的菌落形態(tài)與細(xì)菌很相似，菌落表面一般是光滑、濕潤、粘稠，多數(shù)是乳白色奶油狀菌落，有的有光澤，邊緣整齊，菌落比細(xì)菌大。酵母菌的菌落酵母菌菌落形態(tài)圖第76頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一1、形態(tài)特征：霉菌的菌體是由菌絲組成，但各菌絲是由不分隔的或分隔的多細(xì)胞組成圓柱狀的結(jié)構(gòu)，霉菌菌絲細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和酵母菌細(xì)胞相似，菌絲有營養(yǎng)菌絲、氣生菌絲、產(chǎn)生孢子。①壓片標(biāo)本檢查法：（同酵母菌）②染色檢查法：（同酵母菌）（二）霉菌的形態(tài)及培養(yǎng)性狀的觀察：霉菌菌絲及孢子的染色鏡下照片第77頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一孢子菌絲無隔菌絲有隔菌絲孢子萌發(fā)和菌絲的生長過程

菌絲的結(jié)構(gòu)第78頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一無性孢子無性繁殖是指不經(jīng)過兩性細(xì)胞的結(jié)合而形成個(gè)體的過程。以無性繁殖所產(chǎn)生的孢子稱無性孢子。大多數(shù)霉菌是通過無性孢子來進(jìn)行繁殖的，如芽孢子、關(guān)節(jié)孢子（節(jié)孢子）、厚膜孢子（厚垣孢子）、孢子囊孢子、分生孢子等。孢子囊孢子孢子囊孢子囊梗關(guān)節(jié)孢子厚膜孢子芽孢子小分生孢子大分生孢子分生孢子梗第79頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一肉眼和低倍鏡下觀察：①菌落的顏色②菌落的表面③菌落的形狀④菌落的邊緣⑤菌落的隆起度2、培養(yǎng)性狀：黑曲霉菌落照片青霉菌菌落照片毛霉菌落照片第80頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一1、描述酵母菌的形態(tài)特征及培養(yǎng)性狀？2、描述霉菌的形態(tài)特征及培養(yǎng)性狀？3、實(shí)驗(yàn)中遇到的問題及體會(huì)？四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告：第81頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一實(shí)驗(yàn)六空氣中微生物的測(cè)定第82頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一

了解不同環(huán)境條件下，空氣中微生物的分布狀況；學(xué)習(xí)并掌握檢測(cè)和計(jì)數(shù)空氣微生物的基本方法。實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡?3頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一滅菌培養(yǎng)皿、天平、稱量紙、恒溫箱、培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)器材第84頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一(—)肉湯蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（培養(yǎng)細(xì)菌）牛肉膏5.0g蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、瓊脂20.0g、自來水1000mL、

pH7.2~7.4滅菌條件:0.103Mpa（1210C、15~20min）第85頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一（二）高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基（培養(yǎng)放線菌）可溶性淀粉20gKNO31.0gK2HPO40.5gMgSO4·7H2O0.5gNaCl0.5gFeSO4·7H2O0.5g

瓊脂

20g

蒸餾水1000mLpH7.2~7.4

滅菌條件：0.103Mpa（1210C，15~20min）第86頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一（三）查氏培養(yǎng)基（培養(yǎng)霉菌）

蔗糖

30gK2HPO41gKCl0.5gNaNO42gMgSO4·7H2O0.5gFeSO4·7H2O0.01g水

1000mLpH自然滅菌條件：0.072Mpa（1150C，15~20min）第87頁，共98頁，2023年，2月20日，星期一

落菌法

(1)將肉湯蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、查氏瓊脂培養(yǎng)基、高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基溶化后，各倒十五個(gè)平板，冷凝。（2）在一定面積的房間內(nèi)，按下圖的5點(diǎn)所示，每種培養(yǎng)基每個(gè)點(diǎn)放三個(gè)平板，打開皿蓋，暴露于空氣中30分鐘或60分鐘后蓋上蓋子。（3）肉膏蛋白胨平板于37℃，倒置培養(yǎng)1天；查氏瓊脂平板和高氏一號(hào)瓊脂平板倒置于28℃培養(yǎng)分別培養(yǎng)24~48h各自計(jì)算其菌落數(shù)，觀察菌落形態(tài)、顏色。實(shí)驗(yàn)步驟第88頁，共98頁，2023