滅菌與空氣除菌

滅菌與空氣除菌第1頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一本章內(nèi)容一、常用滅菌方法

二、培養(yǎng)基與發(fā)酵設(shè)備滅菌三、空氣除菌第2頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一第一節(jié)常用滅菌方法滅菌(sterilization):用化學(xué)或物理方法殺死物料或設(shè)備中所有有生命物質(zhì)的過程。

消毒(disinfection):用物理或化學(xué)方法殺死空氣、地表以及容器和器具表面的微生物。

除菌(degermation):用過濾方法除去空氣或液體中的微生物及其孢子。

防腐(antisepsis):用物理或化學(xué)方法殺死或抑制微生物的生長和繁殖

。第3頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)——滅菌方法干熱滅菌法

濕熱滅菌法

射線滅菌法

化學(xué)藥劑滅菌法過濾除菌法火焰滅菌法

第4頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一化學(xué)滅菌：一些化學(xué)物質(zhì)與微生物細胞中某種成分產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)。一般無法殺死所有微生物，只能殺死病原菌，所以起消毒劑作用。消毒劑：迅速殺滅病原菌微生物的藥物。防腐劑：抑制或阻止微生物生長繁殖的藥物。常用化學(xué)藥劑：石碳酸、甲醛、氯化汞、碘酒、酒精等。第5頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一主要用于：生產(chǎn)車間的環(huán)境、無菌室空間、接種操作前小型器具及雙手的消毒燈。使用方法：浸泡、擦拭、噴灑、氣態(tài)熏等。滅菌主要機理：一些化學(xué)物質(zhì)（高錳酸鉀、漂白粉等）與微生物細胞中的某種成分產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，使蛋白質(zhì)變性、核酸破壞、酶類失活、細胞膜透性改變而殺死微生物。第6頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一射線滅菌：利用紫外線、高能電磁波或放射性物質(zhì)產(chǎn)生的γ射線進行滅菌的方法。波長范圍：200~275nm紫外線，殺菌最強范圍250~275nm,253.7nm最強。主要用于：接種室、超凈工作臺、無菌培養(yǎng)室、物質(zhì)表面滅菌。30min作用力：桿菌>球菌>酵母霉菌第7頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一作用機理：微生物在紫外線照射下細胞中DNA遭到破壞，形成胸腺嘧啶二聚體和胞嘧啶水合物，抑制DNA正常復(fù)制；空氣在紫外線照射下產(chǎn)生臭氧也能殺菌。干熱滅菌：在干燥高溫條件下，微生物細胞內(nèi)的各種與溫度有關(guān)的氧化還原反應(yīng)迅速增加，使微生物致死率迅速增高。160℃,1h。主要用于：玻璃器皿、金屬器材和其他耐高溫的物品滅菌。作用機理：干燥高溫條件下，微生物細胞內(nèi)各種與溫度有關(guān)的氧化還原反應(yīng)迅速增加，使微生物致死率提高。第8頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一第二節(jié)培養(yǎng)基與設(shè)備滅菌**

（一）濕熱滅菌原理

（二）分批滅菌（實罐滅菌）（三）連續(xù)滅菌（連消）（四）分批滅菌與連續(xù)滅菌的比較

第9頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一濕熱滅菌：高溫使微生物體內(nèi)的一些重要蛋白質(zhì)發(fā)生凝固、變性，從而導(dǎo)致微生物無法生存而死忙。用于：培養(yǎng)基、發(fā)酵設(shè)備、附屬設(shè)備、管道和實驗器材等。機理：蒸汽冷凝時釋放大量潛熱，并具有強大的穿透力，在高溫蒸汽的作用下，使微生物細胞中蛋白質(zhì)、酶核酸分子內(nèi)部的化學(xué)鍵和氫鍵受到破壞，致使微生物再短時間內(nèi)死亡。第10頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一干濕熱比較：濕熱優(yōu)于干熱。一方面是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)含水量較高；另一方面高溫水蒸氣對蛋白質(zhì)有較高的穿透力，從而加速蛋白質(zhì)變性而使微生物死亡。一般121℃維持20-30min。致死溫度：殺死微生物的極限溫度。致死時間：殺死全部微生物所需的時間。例：微生物營養(yǎng)細胞在60℃加熱10min。芽孢100℃加熱10min---1h。第11頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一1.熱阻2.微生物熱死定律：對數(shù)殘留定律3.滅菌溫度和時間的選擇4.影響培養(yǎng)基滅菌的其它因素

（一）濕熱滅菌原理第12頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一1.熱阻

定義：微生物對熱的抵抗力稱為熱阻（微生物細胞在某一特定條件下死亡致死時間），可用比死亡速率常數(shù)k來表示。

k↓，熱阻↑,t↑第13頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一當(dāng)溫度T一定時，k隨微生物不同而不同，具體計算時，可取細菌芽孢的k值為標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)T變化時，k有很大變化，其變化遵從阿累尼烏斯定律

k=Aexp(-△E/RT)∴k與微生物活化能及T有關(guān)k越小，微生物越耐熱1.熱阻

第14頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一大腸桿菌在不同溫度下的殘留曲線嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢在不同溫度下的死亡曲線第15頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一第16頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一2.微生物熱死定律：

(1)對數(shù)殘留定律

在一定溫度下，微生物受熱致死遵循分子反應(yīng)速度理論，微生物受熱死亡的速率-dN/dt與任何瞬間殘留的活菌數(shù)N成正比稱為殘留定律，即

當(dāng)Nt=0時，t=∞，

既無意義，也不可能。一般采用Nt=0.001，即1000次滅菌中只有一次失敗。第17頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一菌體死亡屬于一級動力學(xué)滅菌反應(yīng)速度常數(shù)k是判斷微生物受熱死亡難易程度的基本依據(jù)。溫度對k影響，遵從阿累尼烏斯定律

k=Aexp(-△E/RT)培養(yǎng)基在滅菌之前存在各種微生物，他們的k不相同，上式可寫成同一微生物在不同滅菌溫度下，k不同，滅菌溫度越低，k越?。粶缇鷾囟仍礁?，k越大。第18頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一(2)非對數(shù)殘留定律

某些微生物受熱死亡的速率不符合對數(shù)殘留定律：如一些微生物芽孢。

kRksNRNsNDdNR/dt=-kRNRdNs/dt=kRNR-ksNs→Nt/N0=KR/(kR-kS)[ekst-ks/kRe-kRt]

式中NR：耐熱性活芽孢數(shù)；Ns：敏感性活芽孢數(shù)

ND：死亡的芽孢數(shù)；kR：耐熱性芽孢的比死亡速率；

ks：敏感性芽孢的比死亡速率；

N0：初始活芽孢數(shù)。第19頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一培養(yǎng)基中含有大量的不耐熱的微生物和相當(dāng)數(shù)量的耐熱性微生物時的滅菌殘留曲線∴在T相同時，對數(shù)與非對數(shù)定律的滅菌時間t不同。第20頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一3.

滅菌溫度和時間的選擇

培養(yǎng)物質(zhì)受熱破壞也可看作一級反應(yīng)：式中C：對熱不穩(wěn)定物質(zhì)的濃度；k’：分解速度常數(shù)；

k’的變化也遵循阿累尼烏斯方程：

都與相應(yīng)的活化能及T有關(guān)第21頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一當(dāng)T1→T2

㏑(k2/k1)/㏑(k2’/k1’)=ΔE/ΔE’>1(∵ΔE>ΔE’)∴隨著T上升，菌死亡速率增加倍數(shù)大于培養(yǎng)基成分分解速率增加倍數(shù)，故一般選擇高溫快速滅菌。3.

滅菌溫度和時間的選擇

第22頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一4.影響培養(yǎng)基滅菌的因素

培養(yǎng)基成分油脂、糖類及一定濃度的蛋白質(zhì)、高濃度有機物等增加微生物的耐熱性低濃度（1%-2%）NaCl對微生物有保護作用，隨著濃度增加，保護作用減弱，當(dāng)濃度達8%-10%以上，則減弱微生物的耐熱性。微生物細胞含水量。含水量越少，滅菌時間越長。第23頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一pH：pH6.0-8.0，微生物最耐熱，pH<6.0，H+易滲入微生物細胞內(nèi)，改變細胞的生理反應(yīng)促使其死亡。∴培養(yǎng)基pH愈低，滅菌所需時間愈短。培養(yǎng)基的物理狀態(tài)泡沫：泡沫中的空氣形成隔熱層，對滅菌極為不利，可加入少量消泡劑。培養(yǎng)基中的微生物數(shù)量攪拌冷空氣排除情況4.影響培養(yǎng)基滅菌的其它因素

第24頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一分空氣過濾器滅菌并用空氣吹干夾套或蛇管排冷水，開啟排氣管閥，空氣管通蒸汽，也可夾套內(nèi)通蒸汽達70℃左右取樣管放料管通蒸汽120℃，1×105pa保溫保溫階段，凡液面以下各管道都應(yīng)通蒸汽，液面上其余各管道則應(yīng)排蒸汽，不留死角，維持壓力、溫度恒定罐壓接近空氣壓力向罐內(nèi)通無菌空氣保溫結(jié)束，依次關(guān)閉各排汽、進汽閥門夾套或蛇管中通冷水培養(yǎng)基降溫到所需溫度（二）分批滅菌（實罐滅菌）

1.滅菌工藝過程

第25頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一升溫、冷卻兩階段也有一定的滅菌效果，考慮到滅菌的可靠性主要在保溫階段進行，故可以簡單地利用式

㏑(N/N0)=-kt

來粗略估算滅菌所需時間。分批滅菌過程：升溫、保溫冷卻3個階段。2.

滅菌時間的估算

第26頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一2.滅菌時間的估算

例1：有一發(fā)酵罐內(nèi)裝40m3培養(yǎng)基，在1210C溫度下實罐滅菌，原污染程度為每1ml有2×105個耐熱細菌芽孢，已知1210C時滅菌速度常數(shù)k=1.8min-1，求滅菌失敗機率為0.001時所需時間。

解：N0=40×106×2×105=8×1012(個)Nt=0.001(個)k=1.8(min-1)

㏑(Nt/N0)=-kt

t=2.303/k[lg(N0/Nt)]=2.303/1.8[lg(8×1015)]=20.34(min)

由于升溫階段就有部分菌被殺滅，特別是當(dāng)培養(yǎng)基加熱至1000C以上，這個作用較為顯著，故實際保溫階段時間比計算值要短。

第27頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一（三）連續(xù)滅菌（連消）

工藝流程噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程噴射加熱連續(xù)滅菌流程薄板式換熱器連續(xù)滅菌流程滅菌時間的計算

㏑(Ct/C0)=－ktt=2.303/k[lg(C0/Ct)]

式中：C0、Ct分別為單位體積培養(yǎng)基滅菌前、后的含菌數(shù)。

第28頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一例2．某發(fā)酵罐內(nèi)裝40m3培養(yǎng)基，采用連續(xù)滅菌，滅菌溫度為1310C，原污染程度為每1ml含有2×105個雜菌，已知1310C時滅菌速度常數(shù)為15min-1，求滅菌所需的維持時間。連續(xù)滅菌時間的估算解：C0=2×105(個/ml)Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(個/ml)t=2.303/k[lg(C0/Ct)]=2.303/15×lg[(2×105)/(2.5×10-11)]=2.37min第29頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程第30頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一第31頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一分批滅菌與連續(xù)滅菌的比較

連續(xù)滅菌的優(yōu)點：（適用于大型罐）可采用高溫短時滅菌，營養(yǎng)成分破壞少，有利于提高發(fā)酵產(chǎn)率；發(fā)酵罐利用率高；蒸汽負荷均衡；采用板式換熱器時，可節(jié)約大量能量；適宜采用自動控制，勞動強度小；可實現(xiàn)將耐熱性物料和不耐熱性物料在不同溫度下分開滅菌，減少營養(yǎng)成分的破壞。第32頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一缺點：對小型罐無優(yōu)勢，不方便，對設(shè)備要求高；蒸汽波動時滅菌不徹底；當(dāng)培養(yǎng)基中含有固體顆?；蛴休^多泡沫時，以分批滅菌好，防止滅菌不徹底。不適合含有大量固體物料培養(yǎng)基滅菌。第33頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一分批滅菌優(yōu)點：不需其他設(shè)備，操作簡單易行；不需設(shè)備進行加熱冷卻；適合小型發(fā)酵罐中培養(yǎng)基滅菌；適合含固體顆粒或較多泡沫培養(yǎng)基滅菌。缺點：對培養(yǎng)基營養(yǎng)成分破壞較大；培養(yǎng)基反復(fù)冷卻耗能增加發(fā)酵周期延長；降低發(fā)酵罐利用率。

第34頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一

第三節(jié)空氣除菌

（一）發(fā)酵使用凈化標(biāo)準(zhǔn)（二）空氣過濾除菌流程（三）空氣預(yù)處理（四）空氣預(yù)處理流程設(shè)計應(yīng)用舉例（五）空氣過濾介質(zhì)（六）空氣過濾除菌原理（七）提高過濾除菌效率的措施第35頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一（一）發(fā)酵使用凈化標(biāo)準(zhǔn)

空氣除菌的必要性

以一個50m3的發(fā)酵罐為例，若裝料系數(shù)為0.7，要求每立方米發(fā)酵液每分鐘通氣0.8m3，培養(yǎng)周期170h，那么每個周期需通氣量2.86×105m3(50×0.7×0.8×170×60)，而每立方米大氣中約有103-104個微生物。第36頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一空氣潔凈度：潔凈環(huán)境中空氣含塵量多少的程度。第37頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一（二）空氣除菌流程第38頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一1.

對空氣過濾除菌流程的要求流程主要設(shè)備：空氣壓縮機、空氣過濾器

附屬設(shè)備：粗過濾器、氣液分離器、空氣貯罐、空氣冷卻器

第39頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一流程的制定應(yīng)根據(jù)所在地的地理、氣候環(huán)境和設(shè)備條件綜合考慮

環(huán)境污染比較嚴(yán)重的地方，要考慮改變吸風(fēng)的條件；在溫暖潮濕的南方，要加強除水設(shè)施；壓縮機耗油嚴(yán)重的設(shè)備流程中則要加強消除油霧的污染，也可采用無油潤滑的往復(fù)式壓縮機；往復(fù)式壓縮機，要配備前置粗過濾器及空氣貯罐。通常要求壓縮空氣的相對濕度Φ=50%~60%時通過過濾器為好。1.

對空氣過濾除菌流程的要求第40頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一2.

空氣除菌流程的分析空氣除菌系統(tǒng)包括：冷卻、分離油水、加熱、過濾幾種典型的設(shè)備流程

兩級冷卻、加熱除菌流程

冷熱空氣直接混合式空氣除菌流程高效前置過濾空氣除菌流程將空氣冷卻至露點以上的流程利用熱空氣加熱冷空氣流程一次冷卻和析水的空氣過濾流程

第41頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一

兩級冷卻、加熱除菌流程圖1-粗過濾器；2-空壓機；3-貯罐；4，6-冷卻器；5-旋風(fēng)分離器；7-絲網(wǎng)分離器；8-加熱器；9-過濾器

第42頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一

冷熱空氣直接混合式空氣除菌流程圖1-粗過濾器；2-壓縮機；3-貯罐；4-冷卻器；5-絲網(wǎng)分離器；6-過濾器第43頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一

利用熱空氣加熱冷空氣的流程示意圖1-高空采風(fēng)；2-粗過濾器；3-壓縮機；4-熱交換器；5-冷卻器；6，7-析水器；8-空氣總過濾器；9-空氣分過濾器第44頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一

將空氣冷卻至露點以上的流程1－高空采風(fēng)；2－粗過濾器；3－壓縮機；4－冷卻器；5－冷卻器；6－空氣總過濾器；7－空氣分過濾器第45頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一

高效前置過濾空氣除菌流程圖1—高效前置過濾器；2—壓縮機；3—貯罐；4—冷卻器；5—絲網(wǎng)分離器；6—加熱器；7—過濾器第46頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一

一次冷卻和析水的空氣過濾流程示意圖1－高空采風(fēng)；2－粗過濾器；3－壓縮機；4－冷卻器；5，6—析水器；7—貯罐；8—加熱器；9—空氣總過濾器；10—空氣分過濾器第47頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一無菌空氣制備過程包括兩部分內(nèi)容：一是對進入空氣過濾器的空氣進行預(yù)處理達到合適的空氣狀態(tài)，二是對空氣進行過濾處理，除去微生物顆粒，滿足生物細胞培養(yǎng)的需要。預(yù)處理的目的：一是提高壓縮機空氣潔凈度，降低空氣