質(zhì)粒DNA的提取實(shí)驗(yàn)報(bào)告思考題

質(zhì)粒dna的提取試驗(yàn)報(bào)告思考題人篇一：質(zhì)粒DNA的提取及其瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)報(bào)告及思考題1．試驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^(guò)本次試驗(yàn)學(xué)習(xí)和把握堿裂解法提取質(zhì)粒；DNA2．試驗(yàn)材料及用品試驗(yàn)儀器〔apparatus〕：恒溫培育箱〔Constanttemperatureincubator〕、恒溫?fù)u床〔Constanttemperatureshakingtable〕、高速離心機(jī)〔Highspeedcentrifuge〕、漩渦振蕩器〔Vortexmixer〕、超凈工作臺(tái)〔Bechtop〕、高壓滅菌鍋〔Autoclave〕、微量加樣器〔Pipettes〕、燒杯〔beaker〕、量筒〔graduatedcylinder〕〔stirbar〕〔microwave〕、天平〔Panbalance〕、電泳梳子〔comb〕、電泳槽〔electrophoresistank〕、電泳器〔Electro-phoresisSystem〕〔Ultraviolettransilluminator〕3〕、材料與試劑〔Reagents〕：I〔SolutionⅠ〕：50mmol/L葡萄糖；25mmol/L三羥基甲基氨基甲烷〔Tris〕Tris-HCl〔pH8.0〕；10mmol/L乙二胺四乙酸〔EDTA〕pH8.0154℃。②溶液Ⅱ〔SolutionⅡ〕：穎配制，等體積混合0.2mol/LNaOH〔10mol/L〕；1%SDS〔可用10％貯存液稀釋配制〕留意：SDSⅢ，加上后混勻會(huì)形成絮狀沉淀60mL5mol/LKAc，11.5mL冰醋酸，28.5mLH2O〔3mol/L，5mol/L〕④TE10mmol/LTris-HCl〔pH8.0〕；1mmol/LEDTA〔pH8.0〕⑤70%乙醇；⑥平衡酚：氯仿1：1：24ml氯仿和1ml異戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。⑦LB胰化蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl15gpH7.0⑧瓊脂糖〔Agarose〕；⑨1liter〔升〕5×TBE〔stocksolution〕：54gtrisbase，27.5g〔boricacid〕，20ml0.5mol/LEDTA,pH8.0；⑩6×凝膠加樣緩沖液：0.25%〔bromophenolblue〕，40%〔sucroseinwater〕；RNADNAMarker、硼酸、Gelview3．試驗(yàn)原理：DNA關(guān)于質(zhì)粒：質(zhì)粒是一類(lèi)存在于幾乎全部細(xì)菌中染色體之外〔細(xì)胞質(zhì)中〕呈游離狀態(tài)的1kb200kb上不等，且擁有自己的復(fù)制起始位點(diǎn)，可不依靠于染色體而進(jìn)展獨(dú)立自主復(fù)與編碼的有關(guān)酶。DNA3DNA②收集和裂解細(xì)菌；DNA。SDS法、羥基磷灰石層析法等。在實(shí)際操作中可以依據(jù)宿主菌株類(lèi)型、質(zhì)粒分子大DNA堿裂解法提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA的原理：DNADNADNA。DNADNA鏈彼此相互盤(pán)繞，仍會(huì)嚴(yán)密地結(jié)合在一起。當(dāng)參加pH4.8乙酸鉀高鹽緩沖液恢DNADNA緩慢且不準(zhǔn)確而相互纏繞形成不溶性網(wǎng)狀構(gòu)造。而復(fù)性的質(zhì)粒DNA恢復(fù)原來(lái)構(gòu)DNARNA，蛋白質(zhì)-SDSDNA。質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳：關(guān)于電泳技術(shù)：脂糖凝膠電泳。瓊脂糖是一種海藻多糖，瓊脂糖膠分別范圍很大，但其區(qū)分率卻相對(duì)較20050,0000.5％4％之間，且瓊脂糖凝膠濃度越大，凝膠就越硬。較高濃度的瓊脂糖膠有利于較小的DNA片斷分別，而較DNA瓊脂糖凝膠電泳條帶的觀看：DNA4000bpDNAGelviewDNAGelview料。它可以在做膠時(shí)混入其中在電泳時(shí)進(jìn)展染色，也可以待電泳完成后將凝膠浸泡在稀釋的Gelview溶液中進(jìn)展DNARNA。DNADNADNA的速度向正極移動(dòng)。在肯定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNADNADNA分子泳動(dòng)速率不一樣，可以進(jìn)展分別。DNADNA：DNA在組蛋白四周形成一種致密的構(gòu)造。這就是所謂超螺旋構(gòu)造，由于其構(gòu)造致DNA：DNA，DNADNADNA：IDNA粒遷移速率最慢，其“松散”的分子形式阻礙了它在瓊脂糖凝膠中的運(yùn)動(dòng)。4．試驗(yàn)方法步驟及留意事項(xiàng)試驗(yàn)方法步驟第一局部：質(zhì)粒DNA的提取及酶切1.4mlpUC191.5ml4000r/min離心2100ml10min；4-65min〔使溶液變透亮，粘稠〕；蓋緊離心管口后上下輕緩顛倒4-615min(溶液消滅白色沉淀)；〔5〕12000rpm15min，轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管〔棄沉淀〕；向上清液中參加等體積的酚：氯仿〔1：1〕，反復(fù)混勻，12000rpm5min，取上清液移至另一離心管中；210min，12023rpm5－10min。棄上清液，將離心管倒置于吸水紙，將附于管壁的剩余液滴除凈。，12023rpm2min，棄上清液，將沉淀在室溫下晾干〔50℃－60℃的烘箱中也可〕。DNA，－20℃保存。DNAⅠ.凝膠的制備〔Preparationofthegel〕〔1〕1％瓊脂糖凝膠：50mL0.5×TBE緩沖液，放入0.5％瓊脂糖凝膠液〔由于蒸發(fā)作用，溶解前在容量瓶上作一個(gè)記號(hào)，溶解后用三蒸水補(bǔ)足〕；(2〕制膠器的安裝：①取多功能制膠器，洗凈，晾干；12×6cm1.5mm18teeth〔25μl〕；③將所選擇規(guī)格的梳子插入制膠架的定位槽中；Gelview5μl；至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠面(留意不要形成氣泡)；〔30-60min〕，輕輕拔掉梳子，將凝膠盤(pán)從制膠槽中取出，放入電泳槽內(nèi)；(0.5×〕至電泳槽中；Ⅱ.加樣(LoadingDNAsamples)：DNA至開(kāi)口下方〔記錄點(diǎn)樣挨次，以便作為比照和分析〕，各加樣量如下：DNAsamples：15μlDNA：3μlLoadingbuffer2μlDNAmarkers：6μlbuffer20μl〕Ⅲ.電泳〔Gel〕：，DNA動(dòng))。保持電壓120V；Ⅳ.GelInterpretation〔凝膠圖像解釋〕：DNA電泳成像系統(tǒng)進(jìn)展拍照、分析。留意事項(xiàng)DNA〔2〕TAETBETBETAEkbDNA的片段。DNA①DNA②瓊脂糖濃度—濃度越低，遷移越快。③DNADNADNA④兩個(gè)電極之間單位厘米的電壓——電壓越高，遷移越快。DNA①DNA對(duì)眼睛有損害作用；二．試驗(yàn)內(nèi)容試驗(yàn)現(xiàn)象與結(jié)果：DNA圖注：x’：代表經(jīng)過(guò)酶切的質(zhì)粒DNA樣品的電泳條帶；〔x組〕；marker:DNA對(duì)試驗(yàn)現(xiàn)象、試驗(yàn)結(jié)果的分析及其結(jié)論：對(duì)試驗(yàn)現(xiàn)象的分析及其結(jié)論：從上述所示的DNA電泳條帶圖可以看出：DNADNADNApUcDNADNA這說(shuō)明質(zhì)粒制備過(guò)程個(gè)消滅線性DNA說(shuō)明存在核酸酶污染或試驗(yàn)操作有問(wèn)marker的很可能就是蛋白質(zhì)組分〕，或者在試驗(yàn)的提取過(guò)程中參加溶液Ⅱ所經(jīng)受的DNADNADNA。但是其中各組也存在超螺旋DNA〔與marker組比照，電泳速率最快，跑在最前面的〕1、23DNA〔marker的最終一條帶相比較，同在一條水平線上且較亮的一條條紋即為開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNASample程中酶切是徹底的。DNA少〔濃度過(guò)低〕或電泳前加樣量過(guò)少所致。5．作業(yè)液后，反響體系消滅的現(xiàn)象及其成因?①溶液Ⅰ的作用：懸浮大腸桿菌菌體，而且加溶液I后，必需要將菌體懸DNAβ-1,4而具有溶菌作用。另外葡萄糖的作用是使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)很快沉積到管DNA解。EDTACa2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，在溶液IEDTA，DNaseDNA的降解和抑制微生物生長(zhǎng)的作用。另外也可保證溶菌酶活性。溶液Ⅱ的作用：NaOH〔SDS〕pH〔堿性環(huán)境〕的作用下細(xì)胞發(fā)生裂解，此外蛋白質(zhì)和染色體DNA發(fā)生變性與細(xì)胞碎片bilayer〔雙層膜〕micelle〔微囊〕構(gòu)造的相變化。配制的溶液Ⅱ避開(kāi)作為最正確溶解細(xì)胞的試劑—NaOH0.4MNaOH，SDS0.4MNaOH溶液Ⅲ的作用：〔SDSNaOH〕發(fā)生反響形成十二烷基硫酸鉀〔potassiumdodecylsulfate,PDS〕，從而將與之結(jié)篇二：質(zhì)粒DNA測(cè)定生化試驗(yàn)報(bào)告生物化學(xué)試驗(yàn)報(bào)告姓名：楊曉霞學(xué)號(hào)：3120230025組別：第一試驗(yàn)室生物化學(xué)與分子生物學(xué)試驗(yàn)教學(xué)中心篇三：質(zhì)粒DNA的提取、定量、酶切與PCR鑒定試驗(yàn)報(bào)告DNAPCR一、試驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)并把握用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的方法；學(xué)習(xí)并把握了解質(zhì)粒酶切鑒定的方法；學(xué)習(xí)并把握紫外吸取檢測(cè)DNA濃度和純度的原理和方法；PCR二、試驗(yàn)原理1.PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒错?dNTP〔緩沖液中〕DNA，使目DNA2n式呈指數(shù)形式擴(kuò)增。PCRDNA〔35－70℃,一般低于模板Tm5℃左右〕，與模板DNA互補(bǔ)退火形成局部雙鏈。在TaqdNTP料，引物為復(fù)2.DNA(1).堿裂解法：DNADNADNADNA液中，染(2).離心層析柱：DNA，而不吸附溶液中的蛋白質(zhì)和多糖等物質(zhì)；通過(guò)去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除；DNA3.DNA〔紫外分光光度法〕：性；各種不同的物質(zhì)都具有其各自的吸取光譜:DNA260nmDNAA260/A280=1.8DNAA260/A280<1.8〔芳香族〕或酚類(lèi)物質(zhì)A260/A280>1.8RNARNA4.DNA特異性地與點(diǎn)結(jié)合，并5.瓊脂糖凝膠電泳：的大小打算于瓊脂糖的濃度。DNADNA，分子量大小子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系).1.PCR儀器：PCR儀、臺(tái)式離心機(jī)、微量加樣槍、滅菌的薄壁離心管(pMD19-TGFP)】、無(wú)菌去離子水、2×PremixTaq、引物質(zhì)粒DNA的提取與制備Eppendorf槍、離心管材料：溶液P1〔S1〕P2(S2〕P3〔