酶放大DNA電化學傳感器的進展綜述,分析化學論文

酶放大DNA電化學傳感器的進展綜述,分析化學論文生物傳感器系將生物敏感物質轉換檢測方便的信號的器件[1]，主要包括靶標辨別元件和信號轉換元件.靶標辨別元件是構建生物傳感器的關鍵，必須對靶標有特異性與專一吸附或反響.根據(jù)靶標辨別元件的不同，生物傳感器可分為酶傳感器、免疫傳感器、DNA傳感器等[2].信號轉換元件是生物傳感器的重要組成部分，它對傳感器的信號收集、運用、靈敏度等有極大的影響.根據(jù)檢測手段的不同，又分為質量敏感型、熱敏型、場效應型、光學、電化學等傳感器[3].DNA電化學生物傳感器以DNA為靶標辨別元件，以電化學方式方法為檢測手段[4]，具有下面優(yōu)點：1〕DNA可人工合成，成本低，易于保存；2〕對檢測對象，不僅可根據(jù)堿基互補配對的原則，檢測特定序列的DNA，還可利用適配體的特點，檢測離子、小分子、多肽、蛋白質甚至細胞；3〕用量少，易微型化；4〕可聯(lián)用多種檢測方式，如質量型、光學、電化學等.華而不實電化學傳感器由于選擇性好、靈敏度高、成本低、操作簡便和易于微型化等而備受關注[5].酶是指具有生物催化功能的生物大分子，其催化效率很高，對底物專一性好.酶DNA電化學傳感器響應快、操作簡單，近年發(fā)展尤為迅速.本文結合作者課題組的研究工作介紹酶放大DNA電化學傳感器的進展.1蛋白質酶〔聚合酶、連接酶、內切酶、外切酶〕脫氧核糖核酸〔DNA〕是生物遺傳信息的載體，其構造和功能對生物的遺傳和變異有重要意義.1953年，Watson和Crick提出了DNA的反向雙螺旋構造，其兩條DNA鏈對應的堿基A-T以雙鍵形式連接，C-G以三鍵形式連接，糖-磷酸-糖主鏈在螺旋外側，配對堿基在螺旋內側.利用DNA鏈之間堿基互補配對原則，可實現(xiàn)特定序列的DNA檢測.聚合酶、連接酶、內切酶、外切酶等蛋白質酶對DNA底物有較好的特異性和高效的催化.利用酶與DNA的作用設計的DNA電化學傳感器已展現(xiàn)出強大的優(yōu)越性和研究活力[6].通過聚合酶反響的放大作用[7]，實現(xiàn)了目的物〔OTA〕的超靈敏檢測，檢測限達6.510-11gL-1.利用T4連接酶將模板DNA首尾相接閉合成環(huán)并與引物DNA相結合，在DNA聚合酶的作用下，其引物可沿著環(huán)形模板不斷擴增，到達滾環(huán)放大〔RCA〕構成多拷貝新鏈DNA.該DNA與通過AuS鍵固定到金電極上的固定探針DNA雜交，進而可吸附更多電化學活性物質亞甲基藍〔MB〕.單一酶放大方式方法已可得到令人滿意的檢測效果，通過有機耦合兩種酶放大反響可得到更低的檢測限.鞠熀先課題組通過聯(lián)用內切酶和聚合酶，實現(xiàn)了特定序列DNA的超靈敏檢測〔1.110-17molL-1〕[8].他們將生物素標記的捕獲cDNA固定于親和素修飾電極.在目的tDNA存在下，與輔助aDNA及cDNA堿基互補雜交，構成了內切酶活性位點，通過內切酶的作用使目的tDNA循環(huán)利用，導致了大量的RCA引物序列的暴露.又經(jīng)RCA反響構成的長鏈DNA與量子點標記的探針DNA雜交，實現(xiàn)了對目的tDNA的靈敏檢測.通常，聚合酶和內切酶對DNA的活性位點只針對某一序列，這給設計通用型DNA電化學傳感器增添了難度，在一定程度限制了其運用[9].外切酶可從核酸一端開場按序列順序催化水解核酸磷脂鍵，對DNA序列無特定要求[10-11].2018年，Plaxco小組率先提出了利用外切酶III〔ExoIII〕實現(xiàn)目的物循環(huán)放大的檢測方式方法[12].隨后報道用ExoIII酶在電極上反響的靈敏檢測各種物質，如DNA[13-15]、離子〔Hg2+〕[10]、蛋白質[16]等.作者課題組報道了ExoIII酶放大的免標記通用型檢測tDNA方式方法[11].如此圖1所示，將構成突出3端的雙鏈DNA探針通過AuS鍵固定于金電極上，當tDNA與雙鏈DNA探針雜交時就可得到ExoIII活性位點〔鈍的3端雙鏈〕，釋放出的tDNA又可進行下一輪剪切，最終使含游離鳥嘌呤堿基〔G〕的探針被大量剪切,使其減弱對電化學活性物質亞甲基藍〔MB〕的吸附，實現(xiàn)tDNA的靈敏檢測.此法利用游離的G和MB的強烈特異作用，免去了對探針的修飾，提高了靈敏度且降低了檢測成本.2酶聯(lián)催化反響〔辣根過氧化物酶〕聚合酶、內切酶、外切酶等顯示出強大信號放大能力，其作用底物為DNA，通常需對DNA進行電化學活性物質的標記〔如二茂鐵和亞甲基藍〕.在分析經(jīng)過中，通過構型改變導致電化學活性物質與電極距離變化，進而其電信號改變就可檢測目的物.但這種構型變化引發(fā)的電化學信號較弱，其應用受限.酶聯(lián)免疫分析法利用抗體、抗原的特異性結合酶催化作用，實現(xiàn)蛋白質分析檢測[17-18].該方式方法在核酸分析領域已引發(fā)關注[19-20].辣根過氧化物酶〔HRP〕系常用的標記蛋白質或DNA酶，可催化氧化3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺〔TMB〕構成藍色氧化物，已廣泛應用于比色傳感領域[21].樊春海課題組[22]利用HRP具有催化氧化TMB的性能結合電化學的優(yōu)勢得到了DNA的fmolL-1級別檢測限.他們將修飾Biotin和Dig的分子信標〔MB〕固定于Avidin電極.這種分子信標的構造阻礙了Dig與Antidig-HRP的結合.當目的tDNA打開分子信標時，同時造成分子構型的改變，促使暴露的Dig與Antidig-HRP結合，得到HRP氧化的TMBOX的復原電流.這種方式方法需分子信標修飾，增加了體系的復雜性和成本.作者課題組報道了用免標記的功能型分子信標檢測特定序列的tDNA[23].圖2設計了含SA適配體序列的分子信標探針，其位阻效應阻礙了適配體與SA的結合.當目的物tDNA與探針相結合時，使適配體序列暴露于溶液中構成可與SA-HRP嚴密接觸的構造，并測得TMBOX復原電流，檢測到達pmolL-1級別的tDNA.利用SA適配體與SA的作用，可免去探針繁瑣修飾，降低成本，獲得優(yōu)異的檢測效果.3脫氧核酶〔8-17DNA酶〕傳統(tǒng)觀點以為所有的酶均系蛋白質.20世紀80年代初，Cech和Altman發(fā)現(xiàn)了核酶〔Ri-bozyme〕改變了這一看法[24],隨之人工合成挑選了有RNA切割和連接可催化構成肽鍵、磷酸化等能力的核酶.Breaker小組也發(fā)現(xiàn)有同樣催化能力的DNA片段，即脫氧核酶〔DNA酶〕[25].這一重大的發(fā)現(xiàn)為核酸分析領域提供了重要思路，很多DNA酶的檢測方式方法已有報道.在DNA酶的催化反響，常需金屬離子作為輔酶因子.因而，DNA酶的生物傳感器常用于金屬離子的檢測.當前，已報道Pb2+[26]、Hg2+[27]、Cu2+[28]、Mg2+[29]等作為輔酶因子的DNA酶.Pb2+作為8-17DNA酶的輔酶，可激發(fā)酶的活性并能將一定構造的互1分析[30].在Pb2+的存在下，8-17DNA酶活性被激發(fā)，切割其互補鏈，使修飾于DNA鏈兩端的熒光基團和猝滅基團分離，實現(xiàn)了Pb2+檢測.Xiao等[31]將8-17DNA酶末端修飾電化學活性的亞甲基藍并固定于電極上，通過Pb2+激發(fā)酶活性進而得到電流信號.作者課題組報道了將8-17DNA酶通過電化學發(fā)光〔ECL〕檢測Pb2+[32].圖3將氨基修飾的具有酶活性的DNA探針固定于活化羧基的玻碳基底，參加功能核酸的底物DNA后，在輔酶Pb2+的作用下，8-17DNA酶將底物DNA切斷，使該8-17DNA酶通過堿基互補原則與修飾發(fā)光材料〔Ru〕的分子信標雜交，得到發(fā)光信號.這種方式方法充分利用了8-17DNA酶對底物Pb2+的特異選擇和堿基互補配對的原則,實現(xiàn)了Pb2+靈敏特異檢測.過氧化物酶活性的DNA酶在生物分析領域的運用越來越受重視[33-35].這類DNA酶對核酸序列的要求不高，一般能構成G-四分體構造的均能與血紅素〔Hemin〕相作用構成DNA酶.G-四分體構造的DNA酶有類似于辣根過氧化物酶活性，在H2O2存在下可使魯米諾〔Luminol〕催化發(fā)光[36]，可以以使2,2-連氮-雙(3-乙基苯并噻哩-6-磺酸)〔ABTS〕[37-38]顯色，已被廣泛運用于比色傳感器領域.Liu等[13]將G-四分體構造的DNA固定于電極，由于互補鏈DNA以其雜交屏蔽了其活性，當目的在tDNA和ExoIII的作用下，使其恢復催化活性，具體表現(xiàn)出雙酶的優(yōu)勢，實現(xiàn)tDNAfmolL-1級別的檢測.4DNA電化學生物傳感器的常見問題與解決方案國內外研究者一直致力于發(fā)展DNA電化學生物傳感器，結合酶放大方式方法實現(xiàn)超靈敏、特異的目的物檢測，已獲得了很好的進展.當前該方式方法存在的一些主要問題：1〕電極選擇：主要有玻碳電極和金電極.玻碳電極需要較為復雜的預處理，固定探針時其露出的羧基與修飾了氨基的探針需經(jīng)較長時間的孵化[32].金電極主要是通過自組裝，利用AuS鍵將探針固定于金電極上[11,23]；2〕固定探針的濃度：不同的體系，固定于電極上的探針濃度會極大地影響分析效果，濃度過高造成較大的排擠，降低其與目的物的接觸效率，濃度太低則信號較弱.當前主要根據(jù)不同體系經(jīng)優(yōu)化選取最佳的信噪比[10,39]；3〕非特異性吸附：固定探針的同時需防止探針的非特異性吸附，常用巰基己醇或氨基己醇.在酶反響的經(jīng)過中，金電極與酶吸附所造成的背景信號極大地影響其分析效果，通?？捎肂SA封閉金電極[23]；4〕雜交效率：非均相反響會不同程度地影響分析效果.Wang課題組提出了三元單層構造組成的電化學傳感界面，華而不實巰基己醇〔MCH〕使固定于電極外表DNA探針可直立于電極外表進而得到統(tǒng)一的構型，有利于雜交.二硫蘇糖醇〔DTT〕通過兩個巰基固定于電極上，其兩個親水羥基使DNA雜交傳感器的雜交效率更高層次，分析效果更好[40-41].5DNA電化學傳感器的發(fā)展趨勢比外表積和導電效果均是影響電化學傳感器分析效果的重要因素.碳納米管、石墨烯、金屬納米粒子等的修飾，結合DNA的辨別作用越來越遭到關注[42-43].納米磁珠的富集能極大地提高信號，已被廣