酶放大DNA電化學(xué)傳感器的進展綜述,分析化學(xué)論文

酶放大DNA電化學(xué)傳感器的進展綜述,分析化學(xué)論文生物傳感器系將生物敏感物質(zhì)轉(zhuǎn)換檢測方便的信號的器件[1]，主要包括靶標(biāo)辨別元件和信號轉(zhuǎn)換元件.靶標(biāo)辨別元件是構(gòu)建生物傳感器的關(guān)鍵，必須對靶標(biāo)有特異性與專一吸附或反響.根據(jù)靶標(biāo)辨別元件的不同，生物傳感器可分為酶傳感器、免疫傳感器、DNA傳感器等[2].信號轉(zhuǎn)換元件是生物傳感器的重要組成部分，它對傳感器的信號收集、運用、靈敏度等有極大的影響.根據(jù)檢測手段的不同，又分為質(zhì)量敏感型、熱敏型、場效應(yīng)型、光學(xué)、電化學(xué)等傳感器[3].DNA電化學(xué)生物傳感器以DNA為靶標(biāo)辨別元件，以電化學(xué)方式方法為檢測手段[4]，具有下面優(yōu)點：1〕DNA可人工合成，成本低，易于保存；2〕對檢測對象，不僅可根據(jù)堿基互補配對的原則，檢測特定序列的DNA，還可利用適配體的特點，檢測離子、小分子、多肽、蛋白質(zhì)甚至細胞；3〕用量少，易微型化；4〕可聯(lián)用多種檢測方式，如質(zhì)量型、光學(xué)、電化學(xué)等.華而不實電化學(xué)傳感器由于選擇性好、靈敏度高、成本低、操作簡便和易于微型化等而備受關(guān)注[5].酶是指具有生物催化功能的生物大分子，其催化效率很高，對底物專一性好.酶DNA電化學(xué)傳感器響應(yīng)快、操作簡單，近年發(fā)展尤為迅速.本文結(jié)合作者課題組的研究工作介紹酶放大DNA電化學(xué)傳感器的進展.1蛋白質(zhì)酶〔聚合酶、連接酶、內(nèi)切酶、外切酶〕脫氧核糖核酸〔DNA〕是生物遺傳信息的載體，其構(gòu)造和功能對生物的遺傳和變異有重要意義.1953年，Watson和Crick提出了DNA的反向雙螺旋構(gòu)造，其兩條DNA鏈對應(yīng)的堿基A-T以雙鍵形式連接，C-G以三鍵形式連接，糖-磷酸-糖主鏈在螺旋外側(cè)，配對堿基在螺旋內(nèi)側(cè).利用DNA鏈之間堿基互補配對原則，可實現(xiàn)特定序列的DNA檢測.聚合酶、連接酶、內(nèi)切酶、外切酶等蛋白質(zhì)酶對DNA底物有較好的特異性和高效的催化.利用酶與DNA的作用設(shè)計的DNA電化學(xué)傳感器已展現(xiàn)出強大的優(yōu)越性和研究活力[6].通過聚合酶反響的放大作用[7]，實現(xiàn)了目的物〔OTA〕的超靈敏檢測，檢測限達6.510-11gL-1.利用T4連接酶將模板DNA首尾相接閉合成環(huán)并與引物DNA相結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下，其引物可沿著環(huán)形模板不斷擴增，到達滾環(huán)放大〔RCA〕構(gòu)成多拷貝新鏈DNA.該DNA與通過AuS鍵固定到金電極上的固定探針DNA雜交，進而可吸附更多電化學(xué)活性物質(zhì)亞甲基藍〔MB〕.單一酶放大方式方法已可得到令人滿意的檢測效果，通過有機耦合兩種酶放大反響可得到更低的檢測限.鞠熀先課題組通過聯(lián)用內(nèi)切酶和聚合酶，實現(xiàn)了特定序列DNA的超靈敏檢測〔1.110-17molL-1〕[8].他們將生物素標(biāo)記的捕獲cDNA固定于親和素修飾電極.在目的tDNA存在下，與輔助aDNA及cDNA堿基互補雜交，構(gòu)成了內(nèi)切酶活性位點，通過內(nèi)切酶的作用使目的tDNA循環(huán)利用，導(dǎo)致了大量的RCA引物序列的暴露.又經(jīng)RCA反響構(gòu)成的長鏈DNA與量子點標(biāo)記的探針DNA雜交，實現(xiàn)了對目的tDNA的靈敏檢測.通常，聚合酶和內(nèi)切酶對DNA的活性位點只針對某一序列，這給設(shè)計通用型DNA電化學(xué)傳感器增添了難度，在一定程度限制了其運用[9].外切酶可從核酸一端開場按序列順序催化水解核酸磷脂鍵，對DNA序列無特定要求[10-11].2018年，Plaxco小組率先提出了利用外切酶III〔ExoIII〕實現(xiàn)目的物循環(huán)放大的檢測方式方法[12].隨后報道用ExoIII酶在電極上反響的靈敏檢測各種物質(zhì)，如DNA[13-15]、離子〔Hg2+〕[10]、蛋白質(zhì)[16]等.作者課題組報道了ExoIII酶放大的免標(biāo)記通用型檢測tDNA方式方法[11].如此圖1所示，將構(gòu)成突出3端的雙鏈DNA探針通過AuS鍵固定于金電極上，當(dāng)tDNA與雙鏈DNA探針雜交時就可得到ExoIII活性位點〔鈍的3端雙鏈〕，釋放出的tDNA又可進行下一輪剪切，最終使含游離鳥嘌呤堿基〔G〕的探針被大量剪切,使其減弱對電化學(xué)活性物質(zhì)亞甲基藍〔MB〕的吸附，實現(xiàn)tDNA的靈敏檢測.此法利用游離的G和MB的強烈特異作用，免去了對探針的修飾，提高了靈敏度且降低了檢測成本.2酶聯(lián)催化反響〔辣根過氧化物酶〕聚合酶、內(nèi)切酶、外切酶等顯示出強大信號放大能力，其作用底物為DNA，通常需對DNA進行電化學(xué)活性物質(zhì)的標(biāo)記〔如二茂鐵和亞甲基藍〕.在分析經(jīng)過中，通過構(gòu)型改變導(dǎo)致電化學(xué)活性物質(zhì)與電極距離變化，進而其電信號改變就可檢測目的物.但這種構(gòu)型變化引發(fā)的電化學(xué)信號較弱，其應(yīng)用受限.酶聯(lián)免疫分析法利用抗體、抗原的特異性結(jié)合酶催化作用，實現(xiàn)蛋白質(zhì)分析檢測[17-18].該方式方法在核酸分析領(lǐng)域已引發(fā)關(guān)注[19-20].辣根過氧化物酶〔HRP〕系常用的標(biāo)記蛋白質(zhì)或DNA酶，可催化氧化3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺〔TMB〕構(gòu)成藍色氧化物，已廣泛應(yīng)用于比色傳感領(lǐng)域[21].樊春海課題組[22]利用HRP具有催化氧化TMB的性能結(jié)合電化學(xué)的優(yōu)勢得到了DNA的fmolL-1級別檢測限.他們將修飾Biotin和Dig的分子信標(biāo)〔MB〕固定于Avidin電極.這種分子信標(biāo)的構(gòu)造阻礙了Dig與Antidig-HRP的結(jié)合.當(dāng)目的tDNA打開分子信標(biāo)時，同時造成分子構(gòu)型的改變，促使暴露的Dig與Antidig-HRP結(jié)合，得到HRP氧化的TMBOX的復(fù)原電流.這種方式方法需分子信標(biāo)修飾，增加了體系的復(fù)雜性和成本.作者課題組報道了用免標(biāo)記的功能型分子信標(biāo)檢測特定序列的tDNA[23].圖2設(shè)計了含SA適配體序列的分子信標(biāo)探針，其位阻效應(yīng)阻礙了適配體與SA的結(jié)合.當(dāng)目的物tDNA與探針相結(jié)合時，使適配體序列暴露于溶液中構(gòu)成可與SA-HRP嚴(yán)密接觸的構(gòu)造，并測得TMBOX復(fù)原電流，檢測到達pmolL-1級別的tDNA.利用SA適配體與SA的作用，可免去探針繁瑣修飾，降低成本，獲得優(yōu)異的檢測效果.3脫氧核酶〔8-17DNA酶〕傳統(tǒng)觀點以為所有的酶均系蛋白質(zhì).20世紀(jì)80年代初，Cech和Altman發(fā)現(xiàn)了核酶〔Ri-bozyme〕改變了這一看法[24],隨之人工合成挑選了有RNA切割和連接可催化構(gòu)成肽鍵、磷酸化等能力的核酶.Breaker小組也發(fā)現(xiàn)有同樣催化能力的DNA片段，即脫氧核酶〔DNA酶〕[25].這一重大的發(fā)現(xiàn)為核酸分析領(lǐng)域提供了重要思路，很多DNA酶的檢測方式方法已有報道.在DNA酶的催化反響，常需金屬離子作為輔酶因子.因而，DNA酶的生物傳感器常用于金屬離子的檢測.當(dāng)前，已報道Pb2+[26]、Hg2+[27]、Cu2+[28]、Mg2+[29]等作為輔酶因子的DNA酶.Pb2+作為8-17DNA酶的輔酶，可激發(fā)酶的活性并能將一定構(gòu)造的互1分析[30].在Pb2+的存在下，8-17DNA酶活性被激發(fā)，切割其互補鏈，使修飾于DNA鏈兩端的熒光基團和猝滅基團分離，實現(xiàn)了Pb2+檢測.Xiao等[31]將8-17DNA酶末端修飾電化學(xué)活性的亞甲基藍并固定于電極上，通過Pb2+激發(fā)酶活性進而得到電流信號.作者課題組報道了將8-17DNA酶通過電化學(xué)發(fā)光〔ECL〕檢測Pb2+[32].圖3將氨基修飾的具有酶活性的DNA探針固定于活化羧基的玻碳基底，參加功能核酸的底物DNA后，在輔酶Pb2+的作用下，8-17DNA酶將底物DNA切斷，使該8-17DNA酶通過堿基互補原則與修飾發(fā)光材料〔Ru〕的分子信標(biāo)雜交，得到發(fā)光信號.這種方式方法充分利用了8-17DNA酶對底物Pb2+的特異選擇和堿基互補配對的原則,實現(xiàn)了Pb2+靈敏特異檢測.過氧化物酶活性的DNA酶在生物分析領(lǐng)域的運用越來越受重視[33-35].這類DNA酶對核酸序列的要求不高，一般能構(gòu)成G-四分體構(gòu)造的均能與血紅素〔Hemin〕相作用構(gòu)成DNA酶.G-四分體構(gòu)造的DNA酶有類似于辣根過氧化物酶活性，在H2O2存在下可使魯米諾〔Luminol〕催化發(fā)光[36]，可以以使2,2-連氮-雙(3-乙基苯并噻哩-6-磺酸)〔ABTS〕[37-38]顯色，已被廣泛運用于比色傳感器領(lǐng)域.Liu等[13]將G-四分體構(gòu)造的DNA固定于電極，由于互補鏈DNA以其雜交屏蔽了其活性，當(dāng)目的在tDNA和ExoIII的作用下，使其恢復(fù)催化活性，具體表現(xiàn)出雙酶的優(yōu)勢，實現(xiàn)tDNAfmolL-1級別的檢測.4DNA電化學(xué)生物傳感器的常見問題與解決方案國內(nèi)外研究者一直致力于發(fā)展DNA電化學(xué)生物傳感器，結(jié)合酶放大方式方法實現(xiàn)超靈敏、特異的目的物檢測，已獲得了很好的進展.當(dāng)前該方式方法存在的一些主要問題：1〕電極選擇：主要有玻碳電極和金電極.玻碳電極需要較為復(fù)雜的預(yù)處理，固定探針時其露出的羧基與修飾了氨基的探針需經(jīng)較長時間的孵化[32].金電極主要是通過自組裝，利用AuS鍵將探針固定于金電極上[11,23]；2〕固定探針的濃度：不同的體系，固定于電極上的探針濃度會極大地影響分析效果，濃度過高造成較大的排擠，降低其與目的物的接觸效率，濃度太低則信號較弱.當(dāng)前主要根據(jù)不同體系經(jīng)優(yōu)化選取最佳的信噪比[10,39]；3〕非特異性吸附：固定探針的同時需防止探針的非特異性吸附，常用巰基己醇或氨基己醇.在酶反響的經(jīng)過中，金電極與酶吸附所造成的背景信號極大地影響其分析效果，通常可用BSA封閉金電極[23]；4〕雜交效率：非均相反響會不同程度地影響分析效果.Wang課題組提出了三元單層構(gòu)造組成的電化學(xué)傳感界面，華而不實巰基己醇〔MCH〕使固定于電極外表DNA探針可直立于電極外表進而得到統(tǒng)一的構(gòu)型，有利于雜交.二硫蘇糖醇〔DTT〕通過兩個巰基固定于電極上，其兩個親水羥基使DNA雜交傳感器的雜交效率更高層次，分析效果更好[40-41].5DNA電化學(xué)傳感器的發(fā)展趨勢比外表積和導(dǎo)電效果均是影響電化學(xué)傳感器分析效果的重要因素.碳納米管、石墨烯、金屬納米粒子等的修飾，結(jié)合DNA的辨別作用越來越遭到關(guān)注[42-43].納米磁珠的富集能極大地提高信號，已被廣