2023年常見(jiàn)的PCR反應(yīng)抑制物一覽

第常見(jiàn)的PCR反應(yīng)抑制物一覽

一個(gè)PCR反應(yīng)過(guò)程分為很多的步驟，同時(shí)也受到很多因素的影響，可以分為內(nèi)部因素和外部因素，內(nèi)部因素是指正常試劑體系中的成分，外部因素是指環(huán)境或者樣本帶入的因素。

體系內(nèi)部因素

引物：引物是整個(gè)PCR體系最重要的部分，也是決定一個(gè)PCR反應(yīng)特異性的關(guān)鍵，引物在設(shè)計(jì)時(shí)要遵守一定的原則（長(zhǎng)度、擴(kuò)增跨度、堿基等）。酶及其濃度：目前有兩種TaqDNA聚合酶，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸桿菌合成的基因工程酶，酶濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。dNTP的質(zhì)量與濃度：dNTP溶液呈酸性，一般配置成體系需將其調(diào)節(jié)至7.0-7.5，正常情況下4種dNTP的濃度應(yīng)該相等，如果其中某一種過(guò)高就會(huì)引起錯(cuò)配，濃度過(guò)低又會(huì)引起PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。核酸（靶標(biāo)）：核酸的量和純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，對(duì)于RNA更要注意RNA的降解。Mg2+濃度：主要影響PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量，一般要對(duì)應(yīng)dNTP的濃度。Mg2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。溫度與時(shí)間的設(shè)置：PCR原理三步驟涉及變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)，也就是變性溫度與時(shí)間、退火（復(fù)性）溫度與時(shí)間、延伸溫度與時(shí)間。循環(huán)次數(shù)：循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于DNA的濃度。一般溫度循環(huán)次數(shù)在30-40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量就越多。

體系外部因素SDS:離子去污劑，0.01%即可完全抑制PCR反應(yīng)，0.005%可顯著降低產(chǎn)量苯酚:0.5%即可完全抑制PCR反應(yīng)，0.2%可顯著降低產(chǎn)量乙醇:大于1%的濃度可抑制PCR反應(yīng)，但在某些體系里又能增加產(chǎn)量異丙醇:抑制作用比乙醇稍強(qiáng)乙酸鈉:大于5mM時(shí)抑制PCR反應(yīng)氯化鈉:大于25mM時(shí)抑制PCR反應(yīng)（生理鹽水無(wú)影響）EDTA:0.5mM可使PCR產(chǎn)物減少，1mM完全沒(méi)有PCR產(chǎn)物血紅素（heme）-來(lái)源：血液，大于1mg/ml抑制PCR反應(yīng)氯高鐵血紅素（hemin）：大于0.1ng/μl抑制PCR反應(yīng)丹寧酸（tannicacids）：大于0.1ng/μl抑制PCR反應(yīng)肝素：大于0.15IU/ml抑制PCR反應(yīng)尿素-來(lái)源：尿，大于20mM時(shí)產(chǎn)生抑制腐殖質(zhì)-來(lái)源：土壤，植物材料，自然界水植物多糖-來(lái)源：糞便，植物多糖聚苯乙烯，聚丙烯-來(lái)源：紫外線照射塑料管膽酸鹽-來(lái)源：糞便膠原質(zhì)-來(lái)源：組織靛青染料-來(lái)源：粗斜紋棉布，牛仔褲蛋白酶-來(lái)源：牛奶鈣離子-來(lái)源：牛奶，骨頭鐵離子-來(lái)源：血液二甲苯胺溴酚蘭膽紅素（bilirubin）其他抑制劑

除上述抑制劑外，還存在一定的PCR增強(qiáng)劑，比如甜菜堿、二甲基亞砜、甲酰胺、甘油、PEG、亞精胺和單鏈DNA結(jié)合蛋白等，但是在高濃度情況下，也會(huì)對(duì)PCR產(chǎn)生抑制，因此如何采用增強(qiáng)劑消除抑制劑的影響，采用多少的濃度對(duì)結(jié)果都存在很大的影響。

臨床PCR常見(jiàn)問(wèn)題

1、假陽(yáng)性問(wèn)題

方法學(xué)問(wèn)題：靶基因序列特異性、引物錯(cuò)配、非特異性擴(kuò)增污染問(wèn)題：樣本污染、產(chǎn)物污染、產(chǎn)物污染解決辦法：嚴(yán)格區(qū)分試驗(yàn)區(qū)域及人員培訓(xùn)，使用UNG技術(shù)

2、假陰性問(wèn)題

問(wèn)題來(lái)源：試劑因素、操作因素、