生物技術(shù)在林木育種中的應(yīng)用

生物技術(shù)在林木育種中的應(yīng)用第1頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一本章講述內(nèi)容一、組織培養(yǎng)1、培養(yǎng)基的配制2、無菌培養(yǎng)體系的建立3、外植體的分化及芽的增值和繼代培養(yǎng)4、增殖培養(yǎng)應(yīng)注意的問題5、完整植株的獲得6、試管苗煉苗和出瓶移栽二、體細(xì)胞胚胎發(fā)生和人工種子1、體細(xì)胞胚胎發(fā)生2、人工種子三、遺傳標(biāo)記技術(shù)在林木遺傳育種中的應(yīng)用1、遺傳標(biāo)記的概念2、分子標(biāo)記技術(shù)3、遺傳標(biāo)記在林木遺傳育種中的應(yīng)用四、基因工程在林木育種中的應(yīng)用1、植物基因工程基本步驟2、基因工程技術(shù)在林木育種中的應(yīng)用第2頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一概述生物技術(shù)，也稱生物工程，是指以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進(jìn)的工程技術(shù)和其它基礎(chǔ)科學(xué)的理論，按照預(yù)先的設(shè)計改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需要的產(chǎn)品或達(dá)到某種目的的一系列技術(shù)。目前，生物技術(shù)在林木遺傳育種中的應(yīng)用主要包括組織培養(yǎng)、體細(xì)胞胚胎發(fā)生與人工種子、分子標(biāo)記輔助育種、基因工程等技術(shù)。第3頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一一、組織培養(yǎng)通過組織培養(yǎng)可以將一個外植體在一定的時間內(nèi)，繁殖出比常規(guī)繁殖多幾百倍，甚至千萬倍與母體遺傳性狀相同的健壯小植株。由于試管苗具有增殖快、成本低、易于批量生產(chǎn)和管理方便等特點(diǎn)，因而被用于樹木、花卉、藥用植物等苗木的工廠化生產(chǎn)。這不僅解決了苗木供應(yīng)問題，而且為長期保存和應(yīng)用優(yōu)質(zhì)種源提供了重要手段。通過組織培養(yǎng)，快速繁殖苗木是當(dāng)前生物技術(shù)中較成熟的技術(shù)，更適合于繁殖珍稀瀕危植物。第4頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一一、組織培養(yǎng)林木組培快速繁殖技術(shù)主要包括：1、培養(yǎng)基的配制2、無菌培養(yǎng)體系的建立3、外植體的分化及芽的增值和繼代培養(yǎng)4、增殖培養(yǎng)應(yīng)注意的問題5、完整植株的獲得6、試管苗煉苗和出瓶移栽第5頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一1、培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基可分為兩類：一是基本培養(yǎng)基，包括大量元素和微量元素（無機(jī)鹽類）、維生素、氨基酸、糖和水等。迄今為止，基本培養(yǎng)基已有幾百種，但較常用的僅一二十種，如MS、改良MS、White、Nitsch、N6、B5等。二是完全培養(yǎng)基，即在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加一些植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（BA、ZT、KT、2，4-D、NAA、IAA、IBA、GA3等）以及其它的復(fù)雜有機(jī)附加物，包括有些成分尚不完全清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、番茄汁、酵母提取物、麥芽膏等。第6頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一1、培養(yǎng)基的配制一般分別配成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物質(zhì)（除蔗糖）、植物生長調(diào)節(jié)劑等不同濃縮母液。配制培養(yǎng)基時分別計算和量取各種母液，添加蔗糖、瓊脂和蒸餾水，混合并加熱融化瓊脂，煮沸后定容，調(diào)節(jié)pH值，分裝，滅菌。第7頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一2、無菌培養(yǎng)體系的建立盡管所有的植物細(xì)胞都具有重新形成植株的能力，但不是任何細(xì)胞都同樣能表現(xiàn)出來，所以要選擇那些在培養(yǎng)時容易進(jìn)行再分化產(chǎn)生植株的部位作試驗(yàn)材料。在同一植物不同部位的組織、器官中，其形態(tài)發(fā)生的能力，因植株年齡、采集季節(jié)、外植體大小及著生部位及生理狀態(tài)而有很大不同，因此，選擇外植體對離體快速繁殖是十分重要的。一般選擇生長健壯優(yōu)良植株，在春季取幼年樹體較基部的材料為好。第8頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一2、無菌培養(yǎng)體系的建立首先清理材料，將需要的部分用軟毛刷、毛筆等在流水下刷洗干凈；也可用毛筆沾少量洗衣粉或肥皂水刷洗，把材料切割到適當(dāng)大小，用流水沖洗幾分鐘。然后用滅菌劑（如70%酒精、10％的雙氧水和84K、0.1%的升汞）進(jìn)行材料的表面滅菌。在超凈工作臺上將外植體置入一個無菌的三角瓶或廣口瓶內(nèi)，用70%酒精處理較短時間，至少用無菌水沖洗一次；用無菌的鑷子將外植體移入另一無菌的瓶內(nèi)；倒入滅菌液處理一定時間，輕輕搖動滅菌器皿；到預(yù)定時間后倒出滅菌溶液，立即用無菌水沖洗3－5次，即可接種。第9頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一3、外植體的分化及芽的增值和繼代培養(yǎng)在啟動培養(yǎng)階段所獲得的芽、苗和胚狀體等數(shù)量不多，還需要增殖培養(yǎng)。試管苗增殖是快速繁殖的重要環(huán)節(jié)，是提供大量的遺傳性穩(wěn)定種苗的手段。增殖有下列4種途徑：第10頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一3、外植體的分化及芽的增值和繼代培養(yǎng)（1）無菌短枝型（minicuttingtype）：即無菌短枝扦插，又稱節(jié)培法或微型扦插法。將微小短枝扦插在試管的培養(yǎng)基上，促使其基部分化出根而成為一完整植株。該方法一次成苗，遺傳性狀穩(wěn)定。（2）叢生芽增殖型（organtype）：又叫叢生芽增殖型，在適宜的培養(yǎng)基上不斷誘導(dǎo)腋芽，從而形成叢生芽，然后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，誘導(dǎo)生根成苗。其遺傳性狀穩(wěn)定，繁殖速度快，是目前快速繁殖中采用的主要方法。第11頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一3、外植體的分化及芽的增值和繼代培養(yǎng)（3）器官發(fā)生型（organogenesistype）：由植物器官誘導(dǎo)愈傷組織，再誘導(dǎo)不定芽，切割不定芽誘導(dǎo)發(fā)根形成植株；也可以直接從離體器官和組織上誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生小植株。這種方法可能會發(fā)生不良變異，用于良種繁殖時應(yīng)注意。（4）胚狀體發(fā)生型（embryoidtype）：從植物器官、細(xì)胞或愈傷組織通過胚狀體途徑，經(jīng)原胚期、心形胚期、魚雷形胚期及子葉期發(fā)育成植株。胚狀體發(fā)生的特點(diǎn)是數(shù)量多，結(jié)構(gòu)完整，易成苗，繁殖速度快，受到國內(nèi)外普遍重視。第12頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一4、增殖培養(yǎng)應(yīng)注意的問題能否保持試管苗的繼代和增殖培養(yǎng)能力，是獲得大量試管苗并用于生產(chǎn)的關(guān)鍵問題。一般認(rèn)為分化再生能力衰退是由多種原因引起，在培養(yǎng)過程中，逐漸消耗了母體中原有的與器官形成有關(guān)的特殊物質(zhì)，一些組織經(jīng)長期繼代培養(yǎng)后發(fā)生了一些變化。不同植物保持再生的能力有很大差異。植物不同種類、同種不同品種、同一植株不同器官和部位，繼代增殖能力不同。一般是被子植物大于裸子植物；幼年材料大于老年材料；剛分離組織大于已繼代的組織；芽大于胚狀體并大于愈傷組織。培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件適當(dāng)與否對繼代培養(yǎng)影響頗大，所以常改變培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件來保持繼代培養(yǎng)。第13頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一4、增殖培養(yǎng)應(yīng)注意的問題玻璃化(vitrification)現(xiàn)象是莖尖脫毒、工廠化育苗和材料保存中的嚴(yán)重障礙。所謂玻璃化是試管苗葉、嫩梢呈水晶狀透明或半透明，整株矮小腫脹、失綠，葉片皺縮成縱向卷曲，脆弱易碎。玻璃苗分化能力下降，生根困難，移栽難以成活，有時高達(dá)50%以上，危害嚴(yán)重。細(xì)胞分裂素濃度和培養(yǎng)溫度與玻璃化呈正相關(guān)，瓊脂和蔗糖濃度與玻璃化苗的比例呈負(fù)相關(guān)。液體培養(yǎng)和密閉的封瓶口材料也是導(dǎo)致玻璃化的主要原因。增加培養(yǎng)基中Ca、Mg、Mn、K、P、Fe、Cu、Mn元素含量，降低N和Cl元素比例，特別是降低銨態(tài)氮濃度，提高硝態(tài)氮含量，增加自然光照強(qiáng)度和時間，可在一定程度上減輕玻璃化現(xiàn)象。第14頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一4、增殖培養(yǎng)應(yīng)注意的問題在植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)過程中，細(xì)胞、組織和再生植株以及后代中會出現(xiàn)各種變異，這種變異具有普遍性。影響遺傳穩(wěn)定性的因素有培養(yǎng)材料的基因型、試管苗繼代培養(yǎng)次數(shù)和離體器官發(fā)生方式等。應(yīng)盡量采用不易發(fā)生體細(xì)胞變異的增殖途徑，縮短繼代時間，限制繼代次數(shù)，取幼年的外植體材料，采用適當(dāng)?shù)纳L調(diào)節(jié)物質(zhì)種類和較低的濃度，減少或不使用在培養(yǎng)基中容易引起誘變的化學(xué)物質(zhì)，定期檢測，及時剔除異常苗，多年跟蹤檢測，調(diào)查再生植株開花結(jié)實(shí)特性，以確定其生物學(xué)性狀和經(jīng)濟(jì)性狀是否穩(wěn)定。第15頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一5、完整植株的獲得外植體通過大量增殖后，多數(shù)情況下形成無根的芽苗。絕大部分離體繁殖產(chǎn)生的芽、嫩梢需要生根培養(yǎng)才能得到完整的植株。生根難易與母株的年齡和所處的生理狀態(tài)有關(guān)，同時與取材季節(jié)和外植體所處的環(huán)境條件有關(guān)。對于難生根的植物不僅要從培養(yǎng)條件中去找原因，同時也應(yīng)從取材上考慮。一般為木本植物比草本植物，成年樹比幼年樹，喬木比灌木難生根。植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對不定根形成起著決定性作用，生長素促進(jìn)生根，而赤霉素、細(xì)胞分裂素、乙烯通常不利于發(fā)根。降低培養(yǎng)基的無機(jī)鹽濃度，有利于根的分化。生根需要適量的磷和鉀；Ca2+多數(shù)情況下有利于根的形成和生長；硼(B)、鐵(Fe)等微量元素對生根有利。生根培養(yǎng)時通常使用低濃度的蔗糖。由于植物根系形成與生長具有向暗性的特點(diǎn)，添加活性炭也可促進(jìn)試管苗生根。第16頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一6、試管苗煉苗和出瓶移栽試管苗長期在弱光、恒溫、高濕的特殊環(huán)境下生長，適應(yīng)性較差，在移植之前必須進(jìn)行鍛煉，增強(qiáng)小苗抗性以提高移苗成活率。目前較為成功的煉苗方法是采用“閉口”陽光下煉苗，可在較長的煉苗時間內(nèi)保持試管苗不污染，同時在煉苗中要提供適宜的溫度和陽光強(qiáng)度。試管苗移栽時從瓶中取出小苗，清洗干凈，迅速栽在已經(jīng)過消毒處理的基質(zhì)中，噴淋透水，放在干凈、排水良好的溫室或塑料保溫棚中，保持較高的空氣濕度，20天左右可定植到大田。基質(zhì)以疏松、排水性和透氣性良好者為宜，如珍珠巖、蛭石、河沙、過篩爐灰渣、椰糠等。第17頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一二、體細(xì)胞胚胎發(fā)生和人工種子1、體細(xì)胞胚胎發(fā)生2、人工種子第18頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一1、體細(xì)胞胚胎發(fā)生體細(xì)胞胚胎發(fā)生是指不通過配子受精，但經(jīng)胚胎發(fā)育形成胚的類似物，即胚狀體，再生長發(fā)育成完整植株的過程。在20世紀(jì)50年代末，Steward和Reinert幾乎同時在胡蘿卜根組織培養(yǎng)中觀察到了體細(xì)胞胚的形成。林木的體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究始于70年代后期，到90年代初得到迅速發(fā)展。目前，在已成功誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚胎的100多種植物中，有40多種木本植物。在杉、落葉松、云杉、松、黃杉和北美紅杉等屬針葉樹種中，至少有20個種成功地研制了體細(xì)胞胚；在楊、柳、鵝掌楸等闊葉樹種中，有20多個種觀察到體細(xì)胞胚胎發(fā)生或獲得了再生植株。其中，火炬松、挪威云杉、花旗松和輻射松等的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)和植株再生已應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。。我國已在云杉屬、火炬松、馬尾松、桉樹、桃樹、楓香、鵝掌楸、杉木和馬尾松等樹種中開展了相關(guān)研究。第19頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一美國ArborGen公司

火炬松體細(xì)胞胚胎發(fā)生及其苗木生產(chǎn)過程第20頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一1、體細(xì)胞胚胎發(fā)生體細(xì)胞胚胎發(fā)生有三個途徑：一是從外植體上直接發(fā)生；二是在固定培養(yǎng)基上，外植體先形成愈傷組織，再分化產(chǎn)生細(xì)胞胚；三是懸浮培養(yǎng)中，先產(chǎn)生胚性細(xì)胞團(tuán)，再形成體細(xì)胞胚。體細(xì)胞胚大多首先起源于一個胚性細(xì)胞，胚性細(xì)胞經(jīng)過首次分裂形成二細(xì)胞原胚，以后經(jīng)過細(xì)胞分裂形成多細(xì)胞原胚。原胚形成后，細(xì)胞進(jìn)行活躍分裂，很快形成球形胚結(jié)構(gòu)，進(jìn)而完成胚胎繁育。第21頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一1、體細(xì)胞胚胎發(fā)生在植物體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)過程中，影響誘導(dǎo)體細(xì)胞脫分化、再分化和發(fā)育過程的因素很多。選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w是成功誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的關(guān)鍵。目前松柏類植物幾乎均以合子胚為外植體。新鮮細(xì)胞系誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的能力較強(qiáng)，老化細(xì)胞形成胚的能力明顯下降。2，4－D是誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的必需條件，它是胚性感受態(tài)表達(dá)的重要因子。高濃度的2，4－D、BA和KT組合對快速誘導(dǎo)胚發(fā)生愈傷組織有利，而要形成后期原胚則必須將激素濃度降低。此外，也可采用NAA、BA和KT的組合，特別是在增殖培養(yǎng)階段，用NAA代替2，4－D更有利于體細(xì)胞胚的發(fā)生。長時間培養(yǎng)在2，4－D的培養(yǎng)基上易造成體細(xì)胞胚成熟能力的喪失。第22頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一1、體細(xì)胞胚胎發(fā)生ABA能抑制不正常胚的發(fā)育，促進(jìn)體細(xì)胞胚的正?；岣唧w細(xì)胞胚的發(fā)生頻率。胚細(xì)胞分化早期與多胺的生物合成關(guān)系較密切，多胺抑制劑可抑制球形胚的形成，但不影響愈傷組織生長，在球形胚后期不再影響胚的發(fā)育，可以提高體細(xì)胞胚的質(zhì)量。此外，影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生的因素還包括培養(yǎng)基、碳源、滲透壓、活性炭、光照、溫度、微量元素、氮源成分、瓊脂、蔗糖濃度以及pH值等。第23頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一2、人工種子人工種子即人為制造的種子，是一種含有植物胚狀體或芽、營養(yǎng)成分、激素以及其它成分的人工膠囊，又稱合成種子。這一技術(shù)是20世紀(jì)80年代來在植物離體繁殖的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，人工種子的產(chǎn)生，減少試管移苗、苗木包裝運(yùn)輸?shù)壬a(chǎn)環(huán)節(jié)。第24頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一2、人工種子人工種子由三部分構(gòu)成。①胚狀體：是由組織培養(yǎng)產(chǎn)生的有胚芽、胚根，類似天然種子胚的雙極性結(jié)構(gòu)，具有萌發(fā)長成植株的能力；②人工胚乳：保證胚狀體生長發(fā)育需要的營養(yǎng)物質(zhì)，一般以誘導(dǎo)胚狀體的培養(yǎng)基為主要成分，或外加一定量的植物激素、抗生素、農(nóng)藥以及除草劑等；③人工種皮：包裹在人工種子最外層的膠質(zhì)薄膜，這層薄膜既要保證內(nèi)外氣體交換暢通，又要防止水分及各類營養(yǎng)物質(zhì)的外滲，且具備一定的機(jī)械抗壓力。人工種子研制大致包括:外植體的選擇和消毒、愈傷組織的誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚的同步化、體細(xì)胞胚的分選、體細(xì)胞胚的包裹(人工胚乳)、包裹外膜、以及發(fā)芽成苗和體細(xì)胞胚變異等內(nèi)容。第25頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（1）人工胚乳及人工種皮人工胚乳：包裹胚的營養(yǎng)基質(zhì)稱為人工胚乳，對營養(yǎng)需求因種而異，但與細(xì)胞、組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基大體相仿，通常還要配加一定量的天然大分子碳水化合物（淀粉、糖類）以減少營養(yǎng)物泄漏。常用人工胚乳有：MS（或SH、White）培養(yǎng)基＋馬鈴薯淀粉水解物（1.5%）；1/2SH培養(yǎng)基＋麥芽糖（l.5%）等。尚可根據(jù)需要在上述培養(yǎng)基添加適量激素、抗生素、農(nóng)藥、除草劑等。第26頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（1）人工胚乳及人工種皮人工種皮是指胚狀體及其類似物以外部分的統(tǒng)稱。聚氯乙烯（商品名PolyoxWSR－N750）適用于包制種子。它可直接溶于MS培養(yǎng)基中，干燥后可固化，再遇水又會溶解。有多種水溶性膠均適用，其中以海藻酸鈉、明膠、樹膠、Gelrite為最佳。人工種子胞衣制作的方法有：干燥法、離子交換法和冷卻法。以離子交換法較實(shí)用、方便。此法又以海藻酸鈉最為常用，其價格低廉，使用方便，對胚狀體基本無毒害作用，具有一定的保水、透氣性能，經(jīng)CaCl2離子交換后，機(jī)械性能較好。為了克服人工種子易于沾粘和變干的缺點(diǎn)，美國杜邦公司以一種稱為Elvax4260的涂料對人工種子進(jìn)行表面處理，效果較好。此外以5％CaCO3或滑石粉抗粘，也有一定效果。第27頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（2）人工種子貯存由于農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)的季節(jié)性限制，人工種子需要貯存一定時間，但人工種子含水量大，容易萌發(fā)，種球易失水干縮，貯存難度較大，目前技術(shù)尚不成熟。一般將人工種子保存在溫度為4～7℃、相對濕度＜67％條件下。第28頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（3）人工種子的萌發(fā)與轉(zhuǎn)換：轉(zhuǎn)換（transformation）指人工種子在一定條件下，萌發(fā)、生長、形成完整植株的過程。轉(zhuǎn)換的方法可分為無菌條件下的轉(zhuǎn)換和土壤條件下的轉(zhuǎn)換。無菌條件下的轉(zhuǎn)換也稱離體條件下的轉(zhuǎn)換。是將新制成的人工種子播種在1/4MS培養(yǎng)基，附加1.5%麥芽糖，8g/L的瓊脂中，培養(yǎng)后統(tǒng)計人工種子形成完整植株的數(shù)目，即人工種子的轉(zhuǎn)換率。轉(zhuǎn)換率的高低主要取決于：①對提高體細(xì)胞胚質(zhì)量的培養(yǎng)基成分的研究；②改進(jìn)轉(zhuǎn)換條件的研究。如麥芽糖代替蔗糖，有利于體細(xì)胞胚的萌發(fā)和轉(zhuǎn)換。第29頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（3）人工種子的萌發(fā)與轉(zhuǎn)換：土壤條件下的轉(zhuǎn)換也稱活體條件下的轉(zhuǎn)換。人工種子真正目的是直接播種于土壤，即在活體條件下，使轉(zhuǎn)換成功。采用方法有：①無土培養(yǎng)試驗(yàn)。目前以蛭石和珍珠巖試驗(yàn)較多，附加低濃度無機(jī)鹽，0.75%麥芽糖有利于轉(zhuǎn)換。②土壤試驗(yàn)。人工種子的土壤轉(zhuǎn)換試驗(yàn)報道較少。在無機(jī)鹽轉(zhuǎn)換中沒有硝酸鉀、硫酸鎂、氯化鈣時就不會發(fā)生轉(zhuǎn)換，缺乏磷酸銨，轉(zhuǎn)換率下降。顯然這些無機(jī)鹽成分作為人工種子營養(yǎng)是不可缺少的。0.75%（v/w）麥芽糖有利于提高轉(zhuǎn)換率。因而推測，碳源在人工種子轉(zhuǎn)換中也是限制因子。為此，人工種子必須貯藏一定的養(yǎng)分或提供外源營養(yǎng)物質(zhì)。第30頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（4）研究進(jìn)展人工種子的研究與體細(xì)胞胚胎發(fā)生比較進(jìn)展較慢，其主要原因是體細(xì)胞胚胎形成后可以直接誘導(dǎo)再生成苗，而不一定要走人工種子的技術(shù)路線，此外，制備人工種子的包裹材料及附加成分成尚不成熟，且轉(zhuǎn)換率低。第31頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一三、遺傳標(biāo)記技術(shù)在林木遺傳育種中的應(yīng)用1、遺傳標(biāo)記的概念2、分子標(biāo)記技術(shù)3、遺傳標(biāo)記在林木遺傳育種中的應(yīng)用第32頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一1、遺傳標(biāo)記的概念遺傳標(biāo)記(geneticmarker)是指可以穩(wěn)定遺傳的、易于識別的特殊的遺傳多態(tài)性形式。在經(jīng)典遺傳學(xué)中，遺傳多態(tài)性是指等位基因的變異。在現(xiàn)代遺傳學(xué)中，遺傳多態(tài)性是指基因組中任何座位上的相對差異或者是DNA序列的差異。遺傳標(biāo)記主要有：形態(tài)標(biāo)記（morphologicalmarkers）、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記（cytologicalmarkers）、同工酶標(biāo)記（isozymemarkers）分子標(biāo)記（molecularmarkers）。第33頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一1、遺傳標(biāo)記的概念理想的分子標(biāo)記必須達(dá)到以下幾個要求：(1)多態(tài)性高，自然界存在著許多等位變異，不需專門創(chuàng)造特殊的遺傳材料；(2)表現(xiàn)共顯性，能夠鑒別出純合基因型和雜合基因型，提供完整的遺傳信息；(3)在基因組中大量存在且分布均勻；(4)選擇中性，即無基因多效性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)；(5)檢測手段簡單、快速，容易觀測記載，成本低；(6)實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好。第34頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（1）.形態(tài)標(biāo)記形態(tài)標(biāo)記即植物的外部特征特性。典型的形態(tài)標(biāo)記用肉眼即可識別和觀察；廣義的形態(tài)標(biāo)記還包括借助簡單測試即可識別的某些形狀如生理特性、生殖特性、抗病蟲性等。自然界的生物存在著許多非常明顯的形態(tài)標(biāo)記，如株高、果形、果色、花形、花色、種子的形態(tài)及色澤等等，這些一直是人類識別新品種的重要標(biāo)記。形態(tài)標(biāo)記的特點(diǎn)是簡單直觀，通過細(xì)心觀察從表型上就可將不同個體區(qū)分開來，長期以來用于林木遺傳種質(zhì)資源鑒定及品種選育。但形態(tài)鑒定需額外占用土地，標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)少，周期長，花費(fèi)大，易受環(huán)境、發(fā)育階段、生理因素和人為因素的影響，準(zhǔn)確性差，容易出現(xiàn)漏選、錯選，而且需要有豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和知識，一般用于對大量材料進(jìn)行初步篩選。第35頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（2）．細(xì)胞學(xué)標(biāo)記細(xì)胞學(xué)標(biāo)記能明確顯示遺傳多態(tài)性的細(xì)胞學(xué)特征。染色體的結(jié)構(gòu)和數(shù)量特征是常見的細(xì)胞學(xué)標(biāo)記，它們分別反映了染色體結(jié)構(gòu)上和數(shù)量上的遺傳多態(tài)性。染色體結(jié)構(gòu)特征包括染色體的核型和帶型。核型特征是指染色體的長度、形態(tài)、著絲粒的位置和隨體有無等，由此可以反映染色體的缺失、重復(fù)、倒位和易位等遺傳變異；帶型特征是指染色體經(jīng)特殊染色顯帶后，帶的顏色深淺、寬窄和位置順序等，由此可以反映染色體上常染色質(zhì)和異染色質(zhì)的分布差異。染色體數(shù)量特征是指細(xì)胞中染色體數(shù)目的多少。染色體數(shù)量上的遺傳多態(tài)性包括整倍性和非整倍性的變異，前者如多倍體，后者如缺體、單體、三體、雙體等非整倍體。第36頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（2）．細(xì)胞學(xué)標(biāo)記用具有染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)變異的材料與染色體正常的材料進(jìn)行雜交，其后代常導(dǎo)致特定染色體上的基因在減數(shù)分裂過程中的分離和重組發(fā)生偏離，由此可以測定基因所在的染色體及其相對位置。因此染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的特征可以作為一種遺傳標(biāo)記，用來區(qū)分不同物種和同一物種的不同種類。但是細(xì)胞學(xué)鑒定工作量較大，并不能很好地消除環(huán)境對性狀的影響，而且基因的顯隱性、上位性及連鎖等會影響分析結(jié)果，再加上標(biāo)記數(shù)目有限，對于染色體數(shù)目較多或染色體較小的植物難以進(jìn)行理想的鑒定分析。第37頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（3）．生化標(biāo)記生化標(biāo)記是以基因表達(dá)的直接產(chǎn)物——蛋白質(zhì)為特征的遺傳標(biāo)記，它包括貯藏蛋白標(biāo)記和同工酶標(biāo)記。生化標(biāo)記具有結(jié)果穩(wěn)定可靠，不受環(huán)境因素影響，呈共顯性，在分離世代中能反映各單株的基因型，檢測相對簡單快速，在種子和幼苗期就可以鑒定，且所需材料少，費(fèi)用不高等優(yōu)點(diǎn)。近年來，利用生化標(biāo)記在品種鑒定及變異體鑒定等方面開展了大量工作，其中應(yīng)用較多的是同工酶標(biāo)記。第38頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（3）．生化標(biāo)記同工酶（isozyme）一詞是Markert及Miller于1957年提出的，指來源相同，催化同一化學(xué)反應(yīng)，而蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、組成又不相同的一類酶。同工酶作為遺傳標(biāo)記有以下特點(diǎn)：首先它比較穩(wěn)定，不受環(huán)境因素的影響；其次，它在種子和幼苗期就可以鑒定，且所需試材少；再次，同工酶為共顯性，即來自雙親的一對等位基因可以在雜交后代中同時檢測出來。不象顯隱性狀那樣，雜交后代隱性性狀被顯性性狀所掩蓋。但是，在植物的群體研究中，僅有10～20種同工酶表現(xiàn)出位點(diǎn)的多態(tài)性。因而同工酶標(biāo)記也有其局限性，不能成為最理想的遺傳標(biāo)記。第39頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（4）．DNA分子標(biāo)記生物體之間的差異本質(zhì)上是DNA水平上的差異。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，遺傳標(biāo)記的概念發(fā)展為在核酸分子水平上具有相對差異的等位區(qū)域(也稱等位基因)。因它們廣泛存在于生物DNA，故稱之為DNA分子標(biāo)記。DNA的分子標(biāo)記是以DNA分子多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記。70年代初，分子標(biāo)記開始在植物遺傳育種研究中得到應(yīng)用，隨后尤其是近10年來，在人類基因組計劃的推動下，分子標(biāo)記的研究和應(yīng)用得到了迅速發(fā)展。第40頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（4）．DNA分子標(biāo)記與上述三種遺傳標(biāo)記相比，分子標(biāo)記具有以下優(yōu)越性：①1直接以DNA的形式表現(xiàn)，在植物體的各個組織、各發(fā)育時期均可檢測到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達(dá)與否的問題；②數(shù)量極多，遍及整個基因組；③多態(tài)性高；④表現(xiàn)為“中性”；⑤有許多分子標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性。第41頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（4）．DNA分子標(biāo)記DNA分子標(biāo)記檢測技術(shù)大致可分為三類：第一類是以電泳技術(shù)和分子雜交技術(shù)為核心的分子標(biāo)記技術(shù)，其代表性技術(shù)有限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）；第二類是以DNA聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)技術(shù)為核心的分子標(biāo)記技術(shù)，其代表性技術(shù)有隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RandomlyamplifiedpolymorphicDNA,RAPD）標(biāo)記、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplifiedfragmentlengthploymorphism，AFLP）和簡單重復(fù)序列（simplesequencerepeat,SSR）等；第三類是以DNA序列為核心的分子標(biāo)記技術(shù)，其代表性技術(shù)為表達(dá)序列標(biāo)記(expressedsequencestags,EST)和單核苷酸多態(tài)性（singlenudeotidepolymorphism,SNP）。第42頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（4）．DNA分子標(biāo)記現(xiàn)已形成了許多分子標(biāo)記系統(tǒng)，常用的分子標(biāo)記技術(shù)有RFLP、RAPD、AFLP、SSR等4種。經(jīng)過十幾年發(fā)展，標(biāo)記的種類日漸增多，已被廣泛應(yīng)用到遺傳多樣性分析，遺傳作圖及基因標(biāo)記等多方面。第43頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一①RFLP標(biāo)記RFLP的產(chǎn)生主要是由于在植物基因組DNA序列上的變化，造成限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionenzymes）酶切位點(diǎn)的增加或喪失以及內(nèi)切酶位點(diǎn)之間DNA片段的插入、缺失或重復(fù)等變化。1974年Grodzicker等人開發(fā)了DNA水平上的分子標(biāo)記——RFLP，它是最早發(fā)展的分子標(biāo)記。1980年，人類遺傳學(xué)家Bostein首先提出了用RFLP作為構(gòu)建遺傳連鎖圖的設(shè)想。1987年Donis-kellen等報道了第一張人類RFLP遺傳圖譜，開創(chuàng)了分子標(biāo)記應(yīng)用的新紀(jì)元。第44頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一①RFLP標(biāo)記限制性內(nèi)切酶能識別DNA順序上由特定堿基組成的識別位點(diǎn)（即限制性位點(diǎn)），并切開DNA。通常DNA上存在大量的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，因此限制性內(nèi)切酶能將很長的DNA分子降解成許多長短不一的小片段，片段的數(shù)目和長度反映了DNA上限制性酶切位點(diǎn)的分布情況。通過瓊脂糖凝膠電泳將這些片斷按大小分離開來，然后將他們按原來的順序和位置印記到易于操作的尼龍膜或硝酸纖維膜后，用放射性核素（如32P）或非放射性物質(zhì)（如生物素等）標(biāo)記的DNA為探針，與膜上的DNA雜交，即Southern印染雜交，若某一位置上的DNA酶切片斷與探針序列相似，則標(biāo)記好的探針就結(jié)合在這個位置上，后經(jīng)放射自顯影或酶學(xué)檢驗(yàn)，可顯示出不同材料對該探針的限制性酶切片段多態(tài)性情況，產(chǎn)生個體特異性的RFLP圖譜,參見下圖。第45頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一檢測限制性片段長度多態(tài)性的主要步驟第46頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一②RAPD:隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記技術(shù)RAPD是在1990年由Williams和Welsh以PCR為基礎(chǔ)發(fā)展起來的一種分子標(biāo)記技術(shù)，通常用1個（有時用2個）隨機(jī)引物（一般為8～10個堿基的寡核苷酸序列），非定點(diǎn)地對基因組DNA隨機(jī)擴(kuò)增，然后用凝膠電泳分開擴(kuò)增片段，這些擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性，從而形成了RAPD標(biāo)記。RAPD繼承了PCR技術(shù)效率高，樣品用量少，靈敏度高，檢測容易等優(yōu)點(diǎn)，但擴(kuò)增的重復(fù)性比AFLP低。第47頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一③AFLP標(biāo)記技術(shù)AFLP是1992年由荷蘭Keygene公司Zabeau和Vos（1992）發(fā)展的一種檢測DNA多態(tài)性技術(shù)。AFLP技術(shù)首先是通過限制性內(nèi)切酶將基因組DNA進(jìn)行切割，然后在DNA片段的粘性末端連接人工接頭，連接后的末端序列和接頭序列就是以后PCR反應(yīng)的引物結(jié)合位點(diǎn)。通常選擇在末端上分別填上1～3個選擇性核苷的不同引物，可以達(dá)到選擇性擴(kuò)增的目的。利用聚丙烯酰胺變性膠分離擴(kuò)增的DNA片段，可以得到大量的多態(tài)DNA譜帶（圖11－3）。

第48頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一③AFLP標(biāo)記技術(shù)AFLP反應(yīng)程序主要包括模板DNA制備、酶切和連接、片斷預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增，以及凝膠電泳檢測分析等。在進(jìn)行AFLP分析時，首先要制備高質(zhì)量基因組DNA，然后用兩種限制性內(nèi)切核酸酶酶切，限制性內(nèi)切酶一般有兩類：一種是識別4個堿基的，一種是識別6個堿基的。通常選用兩種酶組合。酶切完成后，用T4DNA連接酶，將接頭與酶切片段連接起來。酶切和連接也可以一起進(jìn)行。第49頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一③AFLP標(biāo)記技術(shù)制備好了模板DNA后，就要選擇適宜的引物進(jìn)行擴(kuò)增。對于一般的植物基因組，模板DNA的擴(kuò)增分為兩部分，即：預(yù)擴(kuò)增、選擇性擴(kuò)增。預(yù)擴(kuò)增的引物除了含有能與接頭及酶切位點(diǎn)相互補(bǔ)的序列外，有時還增加了一個選擇性堿基。這樣，被擴(kuò)增的片段種類為原總酶切片段種類的1/16。為了進(jìn)一步減少酶切片段的數(shù)量，再進(jìn)一步選擇性擴(kuò)增。選擇性擴(kuò)增采用的引物一般是在預(yù)擴(kuò)增引物的基礎(chǔ)上再增加兩個選擇性堿基，DNA的片段會減少到預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物的1/256。將預(yù)擴(kuò)增的產(chǎn)物稀釋20倍作模板，擴(kuò)增產(chǎn)物在聚丙烯酰胺電泳膠上分辨出來，能檢測到50～1000bp范圍內(nèi)的高清晰的帶。最初AFLP標(biāo)記的檢測采用放射自顯影，但它所利用的放射性標(biāo)記不僅價格高，而且其危害人體。因此，現(xiàn)在常用的是銀染技術(shù)或熒光標(biāo)記。第50頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一AFLP的基本步驟

（引自HartlandJones，2001）第51頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一④SSR標(biāo)記技術(shù)SSR技術(shù)又稱序列標(biāo)簽微衛(wèi)星（sequence-taggedmicrosatellites，STMS）、簡單重復(fù)序列多態(tài)性（simplesequencerepeatpolymorphisms，SSRP），是一類由幾個（多為1～6個）堿基組成的基序（motif）串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，其長度一般較短，廣泛分布于基因組的不同位置，如(CA)n、(AT)n、(GGC)n等重復(fù)。不同遺傳材料重復(fù)次數(shù)的可變性，導(dǎo)致了微衛(wèi)星長度的高度變異性，這一變異性正是微衛(wèi)星標(biāo)記產(chǎn)生的基礎(chǔ)。盡管微衛(wèi)星DNA分布于整個基因組的不同位置，但其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因此可以根據(jù)這兩端的序列設(shè)計一對特異引物，通過PCR技術(shù)將其間的核心微衛(wèi)星DNA序列擴(kuò)增出來，利用電泳分析技術(shù)就可獲得其長度多態(tài)性，即微衛(wèi)星標(biāo)記。微衛(wèi)星位點(diǎn)的重復(fù)單位拷貝數(shù)，可能由于有絲分裂過程中同源微衛(wèi)星間的不等交換或者復(fù)制過程中DNA滑動而高度可變，因而顯示出豐富的多態(tài)性。第52頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一④SSR標(biāo)記技術(shù)SSR的引物根據(jù)與微衛(wèi)星重復(fù)序列兩翼的特定序列設(shè)計，用來擴(kuò)增重復(fù)序列本身。由于重復(fù)的長度變化極大，所以這是檢測多態(tài)性的一種有效方法。為了提高分辨力，通常使用聚丙烯酰胺凝膠電泳，它可檢測出單個重復(fù)差異。也可以在同一個反應(yīng)試管中把PCR反應(yīng)與不同的SSR引物結(jié)合起來，這可節(jié)省時間，但是，這只能在不同引物的產(chǎn)物在大小上不重疊的情況下才能使用。很顯然，使用SSR技術(shù)的前提是需要知道重復(fù)序列兩翼的DNA序列的信息，這一方面可以在其它種的DNA數(shù)據(jù)庫中查詢，否則就必須先建立基因組文庫，再從中篩選可用的克隆，進(jìn)行測序，然后設(shè)計合適的引物。第53頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一

SSR的基本特點(diǎn)第54頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一(4)．DNA分子標(biāo)記上述分子標(biāo)記是基于基因組DNA水平的差異和相應(yīng)的檢測技術(shù)發(fā)展而來的。這些標(biāo)記在基因組中的分布以及相應(yīng)的檢測方法存在許多差異，各有其特點(diǎn)，相互有一定的互補(bǔ)性。現(xiàn)將不同分子標(biāo)記的特點(diǎn)匯總于下表，供比較選擇。第55頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一常用的分子標(biāo)記特性比較第56頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一

3、遺傳標(biāo)記在林木遺傳育種中的應(yīng)用（1）分子遺傳圖譜的構(gòu)建（2）林木基因的定位（3）分子標(biāo)記輔助育種第57頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（1）分子遺傳圖譜的構(gòu)建遺傳圖譜（geneticmap），又稱連鎖圖譜（linkagemap），是指遺傳標(biāo)記在染色體上的相對位置，或稱“遺傳距離”。遺傳圖譜是遺傳研究的重要內(nèi)容，又是研究種質(zhì)資源、育種及基因克隆等的理論依據(jù)和基礎(chǔ)。1980年，Bostein首先提出了利用RFLPs標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖譜的設(shè)想。1987年，Donis-Keller等發(fā)表了第一張人類的RFLPs連鎖圖，其飽和度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了經(jīng)典的圖譜。之后許多生物的RFLP圖譜相繼問世。隨著新的DNA標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，越來越多的物種構(gòu)建了遺傳圖譜，而且標(biāo)記的密度也越來越高。第58頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（1）分子遺傳圖譜的構(gòu)建遺傳連鎖圖譜構(gòu)建的前提是染色體的交換和重組。在細(xì)胞減數(shù)分裂時，非同源染色體上的基因相互獨(dú)立、自由組合。同源染色體上的連鎖基因產(chǎn)生交換與重組，交換的頻率隨基因間距離的增加而增大，因此可用重組率來揭示基因間的遺傳圖距，圖距單位用厘摩（centiMorgancM）表示，1cM的大小大致符合1%的重組率。遺傳圖譜的構(gòu)建過程主要包括：(1)選擇和建立適合的作圖群體；(2)確立遺傳連鎖群；(3)基因排序和遺傳距離的確定。第59頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（1）分子遺傳圖譜的構(gòu)建要建立好的遺傳連鎖圖譜，首先應(yīng)選擇合適的親本及分離群體，這直接關(guān)系到建立遺傳圖譜的難易程度、遺傳圖譜的準(zhǔn)確性及適應(yīng)性。遺傳連鎖圖譜構(gòu)建的基礎(chǔ)是分離群體（或作圖群體）。選擇合適的親本和適當(dāng)?shù)碾s交群體類型是關(guān)鍵。DNA序列差異是遺傳作圖的分子基礎(chǔ)，理論上應(yīng)該選擇親緣關(guān)系遠(yuǎn)而多態(tài)性大的品種或物種材料作為分離群體的親本，然而親本間差異過大，將會影響雜種染色體之間的配對和重組，結(jié)果降低了所建圖譜的可靠性和適用范圍。第60頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（1）分子遺傳圖譜的構(gòu)建一般用于分子標(biāo)記遺傳作圖群體為兩類：一類是暫時性分離群體，包括F2群體、回交一代群體、回交二代群體等；另一類是永久性分離群體，包括重組自交系群體（recombinantinbredlines，RIL）和加倍單倍體群體（doubledhaploid，DH）等。RIL群體是由F2經(jīng)多代自交一粒單傳（singleseeddescendant，SSD）得到基因組相對純合的群體。這些方法常用在作物遺傳作圖上。但林木長期異交，雜合度高，且世代周期長，高世代群體較難得到，因此，林木作圖群體構(gòu)建中使用這些群體較為困難。但林木高度雜合的群體被認(rèn)為是雜交一代，再作雜交則可產(chǎn)生類似雜交二代的分離群體，因此林木的高度雜合性演化成建立作圖群體的一個優(yōu)點(diǎn)。第61頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（1）分子遺傳圖譜的構(gòu)建當(dāng)對分離群體用合適的遺傳標(biāo)記分析，獲得各位點(diǎn)分離的數(shù)據(jù)后，便可進(jìn)行作圖。通過電腦軟件整理好數(shù)據(jù)，計算標(biāo)記間連鎖關(guān)系。現(xiàn)在已有許多專門用于遺傳連鎖分析的計算機(jī)軟件包，如由Lander、Green、Abrahamson等開發(fā)的MAPMAKER/EXP(ftp：///)。由VanOoijen等開發(fā)的MapQTL3.0版（http：//www.bib.wau.nl/）。第62頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（1）分子遺傳圖譜的構(gòu)建林木中，楊樹種間雜交容易，雜種優(yōu)勢明顯，可以建成大量的F1代或F2代分離群體，由于這些優(yōu)點(diǎn)，楊樹指紋圖譜繪制、遺傳圖譜構(gòu)建方面取得了較大的進(jìn)展。美國Minnesota大學(xué)的Liu等(1993)利用分子標(biāo)記構(gòu)建了首張楊樹遺傳圖譜，他們以美洲山楊(P.tremuloidesMichx)5個全同胞家系為材料，利用RFLP標(biāo)記和等位酶標(biāo)記構(gòu)建了世界上第一張楊樹遺傳圖譜，該圖譜包含了54個RFLP標(biāo)記和3個等位酶標(biāo)記，形成14個連鎖群，覆蓋基因組總長約664cM；。第63頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（1）分子遺傳圖譜的構(gòu)建1994年，美國華盛頓大學(xué)Bradshaw等（1995）研究小組年發(fā)表了一張具有較高密度而且比較完善的楊樹圖譜，他們利用毛果楊(P.trichocarpa)×美洲黑楊(P.deltoides)的F2群體，采用三種不同的分子標(biāo)記共獲得343個標(biāo)記，其中有111個RAPD標(biāo)記，215個RFLP標(biāo)記，17個STS標(biāo)記，通過連鎖分析有312個標(biāo)記分屬于35個不同的連鎖群(對)，其中19個較大的連鎖群覆蓋了基因組總長約1261cM，估計楊樹基因組長2400～2800cM。Bradshaw的工作在楊樹圖譜構(gòu)建方面建立了良好的研究基礎(chǔ)，為了滿足各個方面的需求，世界上其它研究小組亦紛紛開展了楊樹圖譜的構(gòu)建工作第64頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（1）分子遺傳圖譜的構(gòu)建我國的一些研究單位業(yè)已在遺傳圖譜的構(gòu)建中取得進(jìn)展，南京林業(yè)大學(xué)、中國科學(xué)院遺傳研究所合作，利用RAPD標(biāo)記，構(gòu)建了美洲黑楊×歐美楊（P.euramericana）的分子標(biāo)記連鎖圖譜。作圖群體大小為92個，通過對1040個10堿基寡核苷酸隨機(jī)引物的重復(fù)篩選，共選出127個引物用于作圖群體的隨機(jī)擴(kuò)增。這127個引物產(chǎn)生229個多態(tài)位點(diǎn)，通過多點(diǎn)連鎖分析，形成19個連鎖群及6個三連體和14個連鎖對。在19個連鎖群構(gòu)成的圖譜中含標(biāo)記129個，總圖距為1914.2cM。覆蓋楊樹基因組約73.62%，標(biāo)記間的平均間距為14.84cM。該研究獲得了中等密度的美洲黑楊×歐美楊的一個連鎖框架。第65頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（2）林木基因的定位A:質(zhì)量性狀質(zhì)量性狀通常是由單個和幾個基因控制，由于這些性狀只受單基因控制，所以利用分子標(biāo)記來定位，識辨目標(biāo)基因，及對目標(biāo)性狀的植株進(jìn)行直觀的選擇相對比較簡單。只要尋找與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記即可。連鎖的緊密程度越高，結(jié)果越可靠。楊樹抗銹病基因的定位研究進(jìn)展較大，美國的Newcombe等（1996），和Villar等（1996）分別利用不同的方法對美洲黑楊的抗銹病基因進(jìn)行了研究，共發(fā)現(xiàn)8個與抗銹病基因緊密連鎖的標(biāo)記，包括1個RFLP標(biāo)記，1個PCR標(biāo)記，3個RAPD標(biāo)記及3個AFLP標(biāo)記，這些標(biāo)記在研究楊樹的抗病基因定位及抗病基因在楊樹基因組中的分布具有潛在的應(yīng)用價值。第66頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（2）林木基因的定位A:質(zhì)量性狀分離群體分組分析法（bulkedsegregationanalysis，BSA）比較適用于林木基因定位。其原理是將分離群體中的個體依據(jù)研究的目標(biāo)性狀，如抗病、感病分成兩組，在每一組群中將各個體DNA等量混合，形成兩個DNA混合池，如抗病池和感病池。由于分組時僅對目標(biāo)性狀進(jìn)行選擇，因此兩個DNA混合池之間理論上就應(yīng)主要在目標(biāo)基因區(qū)段存有差異，運(yùn)用BSA法進(jìn)行基因定位時，除要考慮分離群體中個體的表現(xiàn)型與其基因型的關(guān)系外，還需要注意多態(tài)性標(biāo)記與目標(biāo)基因間的距離不可太遠(yuǎn)，構(gòu)成近等基因池的株數(shù)要適中。Devey等（1996）就是利用BSA法研究獲得與抗松皰銹病相距5cM以下的6個RAPD標(biāo)記。第67頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（2）林木基因的定位B:數(shù)量性狀分子標(biāo)記技術(shù)在林木遺傳和育種中的應(yīng)用的一個重要方面是數(shù)量性狀基因定位(quantitativetraillocus)，簡稱QTL定位。所謂QTL定位，是闡明控制有關(guān)數(shù)量性狀的主要基因數(shù)目，這些基因在染色體上的位置，以及其各自效應(yīng)和聯(lián)合效應(yīng)的遺傳圖。要準(zhǔn)確地定位QTL，就必須建立起詳盡的含各種標(biāo)記的QTL圖譜，標(biāo)記越多，就越有可能準(zhǔn)確地估計QTL的位置，這樣也就可以系統(tǒng)地在整個植物基因組中尋找與QTL有關(guān)的標(biāo)記。目前QTL定位的方法主要包括：單一標(biāo)記定位法、區(qū)間作圖法和復(fù)合區(qū)間作圖法等，利用這些方法，在理論上可逐步建立數(shù)量性狀遺傳的分子基礎(chǔ)，推進(jìn)分子遺傳學(xué)和數(shù)量遺傳學(xué)的學(xué)科交叉和發(fā)展，在實(shí)踐上可使林木育種從表型選擇逐步過渡到基因型選擇，大大提高育種效率。第68頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（2）林木基因的定位B:數(shù)量性狀美國華盛頓大學(xué)Bradshaw等（1994）通過對楊樹遺傳圖譜的構(gòu)建，在232個RFLP標(biāo)記和111個RAPD標(biāo)記組成的圖譜上，進(jìn)行了重要數(shù)量性狀如樹高、胸徑、材積、干形和分枝角的QTLs定位，進(jìn)而研究控制數(shù)量性狀的多基因數(shù)目及單基因的作用效應(yīng)等。例如材積生長性狀，根據(jù)苗木在田間生長表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)大部分變異是受4個QTL控制，占遺傳變異的86%，這說明控制材積性狀的多基因中，實(shí)質(zhì)上有86%是由起很大作用的4個基因支配的。還有更多的數(shù)量性狀如：木材比重、種子發(fā)芽、生根、抗干旱脅迫、抗病性的QTLs得到了較為深入的研究。利用分子標(biāo)記研究QTLs是基因組研究對數(shù)量遺傳學(xué)乃至整個遺傳學(xué)的一大貢獻(xiàn)，使數(shù)量性狀研究進(jìn)入了分子水平。第69頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一(3)分子標(biāo)記輔助育種分子標(biāo)記輔助選擇是形態(tài)標(biāo)記、生化標(biāo)記選擇的一個有益補(bǔ)充，它不受其它基因效應(yīng)和環(huán)境因素的影響，結(jié)果可靠，同時可在早期進(jìn)行選擇，大大縮短育種周期。顯然，這一技術(shù)對于林木更具有意義。首先要確定目標(biāo)性狀是由質(zhì)量性狀基因還是由QTL控制。很多性狀表現(xiàn)為質(zhì)量性狀遺傳的特點(diǎn)，最常見的有抗病性、抗蟲性，通過與目標(biāo)質(zhì)量性狀基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，是進(jìn)行質(zhì)量性狀選擇的有效途徑。篩選與多基因控制的數(shù)量性狀連鎖的分子標(biāo)記要比篩選與單基因性狀連鎖的分子標(biāo)記復(fù)雜的多，取決于分子標(biāo)記連鎖圖的飽和程度和度量QTL的準(zhǔn)確程度、QTL的有效分解、準(zhǔn)確鑒定和定位。第70頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一(3)分子標(biāo)記輔助育種分子標(biāo)記輔助選擇需要如下基本條件：（1）分子標(biāo)記與目標(biāo)基因的遺傳距離很小（一般應(yīng)小于5cM）或者是共分離的；（2）DNA的提取方法簡便自動化，已適用于大群體分析；（3）分子標(biāo)記盡可能轉(zhuǎn)化為PCR標(biāo)記；（4）建立多數(shù)據(jù)處理的分析軟件。第71頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一(3)分子標(biāo)記輔助育種分子標(biāo)記輔助選擇目前尚未廣泛應(yīng)用，主要原因是基因作圖的速度相當(dāng)緩慢，分子標(biāo)記的數(shù)量較少，林木上的分子標(biāo)記數(shù)量更加少。一些重要性狀的分子標(biāo)記與目標(biāo)性狀間的距離仍較大；分子標(biāo)記在不同的遺傳背景中表現(xiàn)不穩(wěn)定，特別是數(shù)量性狀遺傳的重要性狀的分子標(biāo)記極易受遺傳背景的影響；分子標(biāo)記輔助選擇所需要的實(shí)驗(yàn)設(shè)備及實(shí)驗(yàn)費(fèi)用很高，增加了選擇成本。但是，隨著分子標(biāo)記技術(shù)在林木遺傳育種中的廣泛使用，分子標(biāo)記連鎖圖的日趨飽和，與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記數(shù)量的增多，分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)成本的降低，分子標(biāo)記輔助選擇在林木育種中會起到重要的作用。第72頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一四、基因工程在林木育種中的應(yīng)用1、植物基因工程基本步驟2、基因工程技術(shù)在林木育種中的應(yīng)用第73頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一1、植物基因工程基本步驟基因工程包括的步驟有：目的基因分離和鑒定；植物表達(dá)載體的構(gòu)建；植物細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的篩選及轉(zhuǎn)基因植物的鑒定；外源基因表達(dá)的檢測等。第74頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一(1)目的基因分離和鑒定開展植物基因工程的工作，首先必須取得目的基因。獲取目的基因的途徑有直接分離和人工合成法。直接分離是利用的DNA限制性內(nèi)切酶將供體細(xì)胞中含目的基因的DNA片段切取分離出來。供植物轉(zhuǎn)基因的大部分目的基因是從植物細(xì)胞中分離出來的，例如從豆科植物的種子中分離得到多種種子貯藏蛋白基因，抗除草劑基因也是從植物中分離出來的；有的來自微生物和動物，如由蘇云金芽孢桿菌中可得到抗蟲基因（Bt基因），由病毒中得到抗病毒的基因。第75頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一(1)目的基因分離和鑒定目前人工合成基因的方法主要有：一是以基因轉(zhuǎn)錄mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的催化下合成雙鏈DNA，而獲得所需要的基因。另一條途徑是根據(jù)已知的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測出相應(yīng)的基因序列，再通過化學(xué)方法以4種脫氧核苷酸為原料合成目的基因。三是依據(jù)已知其他物種的目的基因進(jìn)行核苷酸同源序列分析，設(shè)計引物，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，快速、簡便地擴(kuò)增目的基因的DNA片段。

第76頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一(1)目的基因分離和鑒定由于植物的基因組非常龐大，核DNA總量高達(dá)5×108bp以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了原核生物的基因數(shù)目，且植物的性狀多屬數(shù)量性狀，加上植物的遺傳背景復(fù)雜，這一切都給植物基因的分離技術(shù)提出更高要求。近年來，隨著生物化學(xué)、酶學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的迅速發(fā)展，植物的基因分離技術(shù)日漸成熟，逐步形成了一整套高效的植物基因分離技術(shù)，如PCR技術(shù)、轉(zhuǎn)座子示蹤技術(shù)和基因組相減技術(shù)等。第77頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一PCR技術(shù)PCR技術(shù)是1985年美國加利福尼亞的Mullis等人開發(fā)的一項(xiàng)專利技術(shù)，它具有高度的專一性和靈敏度，能快速、簡便地擴(kuò)增DNA片段，是對已知序列進(jìn)行分子克隆的最有效的手段。PCR技術(shù)分離植物基因的方法是：首先提取植物的基因組DNA或mRNA，其中對mRNA先通過逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈ｃDNA，以染色體DNA或第一鏈cDNA為模板，以人工合成的一對寡聚核苷酸為引物，在dNTP存在的情況下，通過DNA模板的變性、模板與引物的退火以及引物的延伸3個階段的多次循環(huán)來擴(kuò)增目的基因。有時根據(jù)植物性狀的生理生化特征，先分離純化所需的蛋白質(zhì)或多肽，并對它進(jìn)行部分氨基酸序列分析，推出可能的核苷酸序列，根據(jù)這些序列人工合成兩個簡并的寡核苷酸引物，之后以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即可得到目的基因片段。第78頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一轉(zhuǎn)座子示蹤技術(shù)轉(zhuǎn)座子示蹤技術(shù)是根據(jù)植物或細(xì)胞的表型變異進(jìn)行基因分離的有效手段。其方法是：用帶有轉(zhuǎn)座子的隱性純合植物材料與所需分離的顯性基因純系親本雜交，篩選因轉(zhuǎn)座子插入而表現(xiàn)為隱性性狀的突變品系。然后用已克隆的轉(zhuǎn)座子為探針，對突變株系進(jìn)行Southern分析，通過常規(guī)分子克隆(如構(gòu)建基因文庫)分離目的基因片段。接著再以該基因片段為探針，從正常的顯性基因純系親本中克隆出相應(yīng)基因序列。目前已克隆了玉米的Ac/Ds轉(zhuǎn)座子，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入煙草、擬南芥、矮牽牛、馬鈴薯及番茄等植物中。第79頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一基因組相減技術(shù)這一技術(shù)是Straus和Ausubel于1989年根據(jù)Bautz提出的相減雜交分離缺失序列的概念提出的。其方法主要是利用缺失突變體與未缺失同源親本只有一二個核苷酸的差異，將大量特殊標(biāo)記的突變體DNA與少量未缺失親本DNA混合，變性后在適當(dāng)溫度下復(fù)性，待反應(yīng)體系中單鏈DNA重新配對成雙鏈后，除去標(biāo)記的突變體DNA和與之雜交配對的親本DNA。如此反復(fù)數(shù)次，反應(yīng)體系中突變體DNA所缺失那個親本DNA片段因無法與任何突變體DNA形成雜合體而保留在溶液中，對這個留在反應(yīng)體系中的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)過DNA分析，就能獲得這些DNA片段所含的基因。第80頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一染色體步查技術(shù)染色體步查是分離與已知DNA序列基因緊密連鎖基因的有效辦法。此技術(shù)主要依賴遺傳學(xué)和限制性酶切片段長度多肽性(RFLP)分析，以已知基因作為RFLP標(biāo)記，去獲得更趨近目的基因的DNA片段，然后以這些新的DNA為探針，逐步向目的基因靠近，最終克隆得到目的基因。第81頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一染色體步查技術(shù)染色體步查是分離與已知DNA序列基因緊密連鎖基因的有效辦法。此技術(shù)主要依賴遺傳學(xué)和限制性酶切片段長度多肽性(RFLP)分析，以已知基因作為RFLP標(biāo)記，去獲得更趨近目的基因的DNA片段，然后以這些新的DNA為探針，逐步向目的基因靠近，最終克隆得到目的基因。第82頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一(2)植物表達(dá)載體的構(gòu)建目的基因被分離后，往往需要經(jīng)過修飾才能應(yīng)用于植物基因工程。因?yàn)椋庠椿虿迦胧荏w基因后，其表達(dá)過程受基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯及翻譯后加工等一系列步驟影響。因此，主動修飾目的基因，構(gòu)建植物表達(dá)載體是植物基因工程必不可少的步驟。構(gòu)建植物表達(dá)載體的方法是在目的基因的5’端加上啟動子，有時還加上增強(qiáng)子，在3’端加上終止子，以便使外源基因能在植物中高效表達(dá)。目前常用的啟動子是從花椰菜花葉病毒(CaMV)中分離的35s啟動子。其次還有胭脂堿和章魚堿合成酶的Nos啟動子和Ocs啟動子，它們均具有真核生物啟動子的一些特性，能在植物細(xì)胞中使外源基因表達(dá)。第83頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一(2)植物表達(dá)載體的構(gòu)建在構(gòu)建植物表達(dá)載體時，可根據(jù)研究工作的目的選擇合適的啟動子。如需要目的基因在植物的多個時期、各個部位表達(dá)，就需選用組成型啟動子；如需要目的基因在特定時間表達(dá)，可選用發(fā)育特異啟動子或誘導(dǎo)啟動子；如需要目的基因在特定部位表達(dá)，就選用組織特異性表達(dá)啟動子。在轉(zhuǎn)錄終止方面，目前植物基因工程中常用的終止子是胭脂堿合成酶的Nos終止子和Rubisco小亞基基因的3’端區(qū)域。第84頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一(3)植物細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化植物遺傳轉(zhuǎn)化是利用生物及物理化學(xué)等手段，將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞以獲得轉(zhuǎn)基因植株的技術(shù)。近年來植物的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)得到迅速發(fā)展，建立了兩大類基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。一是以載體為媒介的基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)：如以土壤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒及Ri質(zhì)粒為載體的轉(zhuǎn)化方法；二是DNA直接轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。如PEG法、電擊法、基因槍法和花粉管通道法。除這些方法外，離子束介導(dǎo)法、碳水硅纖維法、替代轉(zhuǎn)化法及超聲波法等都先后成為外源DNA直接導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法。目前，林木轉(zhuǎn)基因主要采取根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。第85頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一(3)植物細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌中含有Ti質(zhì)粒，有一個DNA區(qū)段，即Ｔ－DNA，它可以整合到植物基因組上，而Ｔ－DNA插入外源DNA片段并不影響整合。野生的Ti質(zhì)粒作為基因工程載體并不合適，其質(zhì)粒大到200Kb，一種限制酶往往有十多個酶切位點(diǎn)，難以直接進(jìn)行基因操作。另外野生Ti質(zhì)粒引起轉(zhuǎn)化組織瘤性生長，使植株再生困難。后來人們對Ti質(zhì)粒進(jìn)行改造并發(fā)展成一種稱之為中間載體的質(zhì)粒，它可在大腸桿菌中復(fù)制并可插入目的基因。使這一載體從大腸桿菌轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌后，便可用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。目前用的大多數(shù)是改造后的Ti載體的質(zhì)粒。第86頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一(3)植物細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法主要有三種：一是整株浸染法。用農(nóng)桿菌浸染創(chuàng)傷部位，然后無菌培養(yǎng)愈傷組織；二是葉盤法。用打空器取得創(chuàng)傷的葉圓片，將葉圓片放入農(nóng)桿菌液讓其浸入葉片傷口，然后轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基上，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生植株，此法最常用；三是共培養(yǎng)法。將原生質(zhì)體與農(nóng)桿菌一起培養(yǎng)40小時左右，離心去菌后，在選擇培養(yǎng)基上得到轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化具有簡單、快速、高效的特點(diǎn)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的宿主植物主要是雙子葉植物，但目前已有很多在單子葉植物獲得轉(zhuǎn)化植株的例子。第87頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一(4)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的篩選植物細(xì)胞經(jīng)過目的基因轉(zhuǎn)化處理后，只有少數(shù)細(xì)胞被轉(zhuǎn)化，需將轉(zhuǎn)化細(xì)胞與未轉(zhuǎn)化細(xì)胞區(qū)分開來，并淘汰未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，然后利用植物細(xì)胞的全能性在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件下使轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)育為轉(zhuǎn)基因植株。標(biāo)記基因在植物的遺傳轉(zhuǎn)化過程中的作用是區(qū)分轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞，是篩選和鑒定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織和轉(zhuǎn)基因植株的有效方法。目前被廣泛應(yīng)用的標(biāo)記基因大致可分為選擇基因、報告基因兩類。還有一些基因兼具選擇和報告的功能。第88頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一選擇基因截至目前，被廣泛用于選擇的標(biāo)記基因主要有兩大類:一類是抗生素抗性基因類：如對卡那霉素和新霉素有抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ基因(NPTⅡ)，對氯霉素有抗性的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(CAT)，鏈霉素抗性的鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因及博來霉素和慶大霉素抗性基因等?？箍敲顾鼗颍∟PTⅡ）是植物轉(zhuǎn)化所用的第一個標(biāo)記，也是最常用的顯性選擇標(biāo)記。NPTⅡ酶可催化卡那霉素及其它氨基糖苷類抗生素氨基己糖上的3’－羥基發(fā)生依賴于APT的磷酸化，修飾后的卡那霉素不能再進(jìn)入細(xì)胞并與30s核糖體亞單位結(jié)合而導(dǎo)致mRNA的錯譯。潮霉素抗性基因(hpt)在某些作物上選擇效率較高，應(yīng)用也較多。第89頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一選擇基因另一類是抗除草劑基因類。有抗草甘膦的EPSPS基因及抗Glufosinate的bar基因等。草甘膦是可控制大多數(shù)有害雜草的非選擇性除草劑。抗草甘膦的EPSPS基因是5－烯醇丙酮酸莽草酸－3－磷酸合成酶的突變體。除草劑草甘膦是EPSPS合成酶的抑制劑。細(xì)胞或農(nóng)桿菌中分離的EPSPS基因與葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列融合，可顯著提高對草甘膦的抗性?？剐詷?biāo)記基因的編碼產(chǎn)物通常是分解除草劑或抗生素的酶，可賦予轉(zhuǎn)化細(xì)胞除草劑或抗生素抗性，從而使轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠在含有一定濃度除草劑或抗生素的篩選培養(yǎng)基上生長，非轉(zhuǎn)化細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基上則被除草劑或抗生素殺死。第90頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一報告基因它們大都是一些酶的基因，包括農(nóng)桿堿合成酶類如章魚堿合酶基因Ocs(或胭脂堿合酶基因，Nos)，抗生素轉(zhuǎn)化酶類，產(chǎn)生具有生化顯色的酶類(如GUS)及自身有光學(xué)活性的非酶蛋白類(綠色熒光蛋白，GFP)。GUS基因應(yīng)用較廣泛，可將無色底物5－溴－4氯－3吲哚葡糖苷酸（X－Glux）水解，產(chǎn)生藍(lán)色的水解產(chǎn)物，可用肉眼或在顯微鏡下觀測，也可用熒光分光光度計進(jìn)行定量測量。第91頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一標(biāo)記基因標(biāo)記基因是為了篩選、鑒定轉(zhuǎn)化子，對受體本身及環(huán)境來講，它的存在是多余的，甚至是有害的。人們關(guān)注這些存在于轉(zhuǎn)基因植物中的具有抗生素或除草劑抗性的標(biāo)記基因是否會對環(huán)境及人類健康有不良影響和損害。問題主要有：(1)抗生素抗性基因會不會轉(zhuǎn)移到微生物中，使病原菌獲得抗性，從而導(dǎo)致目前臨床使用的抗生素失效；(2)標(biāo)記基因會不會傳播到野生親緣種中，使雜草獲得這種抗性，變成現(xiàn)有除草劑無法殺滅的“超級雜草”；(3)具有抗生素或除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用，會不會由于基因的漂移破壞生態(tài)平衡。第92頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一標(biāo)記基因出于安全性考慮，科學(xué)工作者嘗試尋找新的標(biāo)記基因用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化或培育獲得無選擇標(biāo)記，以獲得無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物。對新的標(biāo)記基因的要求：一是能夠?qū)D(zhuǎn)基因植物進(jìn)行篩選和鑒定，二是必須對環(huán)境和生物都是安全的。近年來發(fā)現(xiàn)的生物安全標(biāo)記基因主要有6-磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(pmi)、木糖異構(gòu)酶基因(xylA)、核糖醇操縱子(rtl)和谷氨酸-1-半醛轉(zhuǎn)氨酶基因(hemL)、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因(ipt)、吲哚3-乙酰胺水解酶基因(iaaH)等。第93頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一(5)轉(zhuǎn)基因植物的鑒定與外源基因表達(dá)的檢測轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測主要包括PCR特異擴(kuò)增、分子雜交技術(shù)。PCR特異擴(kuò)增目的基因片段是當(dāng)今用于轉(zhuǎn)基因植物鑒定的所用的最簡單、最常用的方法。外源基因在植物基因組上整合的最可靠的檢測方法是Southern分子雜交?；虮磉_(dá)分為轉(zhuǎn)錄和翻譯兩階段，證明外源基因在轉(zhuǎn)錄水平上是否表達(dá)的主要檢測方法為Northern雜交；證明外源基因在翻譯水平是否表達(dá)，常用的分子雜交方法就為Western雜交。主要原理是依據(jù)外源目的基因的堿基序列，與含有標(biāo)記的探針發(fā)生同源配對，雜交后能產(chǎn)生雜交信號的轉(zhuǎn)化植株為轉(zhuǎn)基因植株；未產(chǎn)生的為非轉(zhuǎn)基因植株或者是轉(zhuǎn)入基因失活或者沉默的轉(zhuǎn)基因植株。第94頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一5.轉(zhuǎn)基因植物的鑒定與外源基因表達(dá)的檢測由于轉(zhuǎn)基因的目的是想通過外源基因在轉(zhuǎn)化植株體內(nèi)表達(dá)，來提高植株在這個方面的表達(dá)程度。特別是關(guān)于那些轉(zhuǎn)入基因的目的是增加植株抗性的研究中，為了測定基因是否轉(zhuǎn)入或者轉(zhuǎn)入后是否表達(dá)，可以給轉(zhuǎn)基因植株一定的選擇壓力，如果產(chǎn)生抗性，表明為轉(zhuǎn)基因植株。在轉(zhuǎn)抗病基因的植物中，連續(xù)多年人工接種病菌，一直表現(xiàn)抗性的植株可以確定為轉(zhuǎn)基因植株。在轉(zhuǎn)甜菜堿醛脫氫酶基因的植株，在含有NaCl的培養(yǎng)基和大田中篩選抗鹽轉(zhuǎn)基因植株等。第95頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一(5)轉(zhuǎn)基因植物的鑒定與外源基因表達(dá)的檢測大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植物的外源基因的表達(dá)都相當(dāng)?shù)?，現(xiàn)在認(rèn)為這是由于外源基因插入的位點(diǎn)效應(yīng)引起的；另外，外源基因的表達(dá)會受到植物體自身的同源基因或先前轉(zhuǎn)入的外源基因中的同源序列的影響而常表現(xiàn)為外源基因失活。外源基因?qū)胫参锛?xì)胞后，其表達(dá)與否及表達(dá)量的高低可通過三種方法進(jìn)行檢測。其一是與標(biāo)記基因和報告基因整合，通過兩者的活性高低檢測，即可知外源基因的表達(dá)水平。其二是直接檢測外源基因轉(zhuǎn)錄以及它的翻譯產(chǎn)物的多少，這是目前最具說服力的檢測方法。其三是效果檢測，如抗病毒基因工程中的攻毒試驗(yàn)、抗蟲基因工程中的抗蟲試驗(yàn)等。這是最直接、也是最后的檢測方法，是某一種植物基因工程成功與否的最后判斷標(biāo)準(zhǔn)。第96頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一2基因工程技術(shù)在林木育種中的應(yīng)用（1）抗蟲基因工程（2）抗病基因工程（3）抗旱和耐鹽堿基因工程（4）抗寒基因工程（5)與木材改良有關(guān)的基因工程（6)與開花發(fā)育、生根等有關(guān)的基因工程（7）抗環(huán)境污染基因工程第97頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（1）抗蟲基因工程蟲害嚴(yán)重影響樹木的生長和存活，甚至導(dǎo)致物種的消失和造林的失敗。大面積人工林更加劇了蟲害的蔓延，造成了毀滅性的森林災(zāi)害。因此，培育抗蟲的樹木新品種對人工林建設(shè)有重要意義。自1987年比利時的Vacek等首次獲得煙草Bt(蘇云金桿菌內(nèi)毒素基因)轉(zhuǎn)基因植株以來，Bt基因已轉(zhuǎn)入煙草、番茄、玉米、棉花、果樹及林木等多種植物中，一些轉(zhuǎn)Bt基因農(nóng)作物已進(jìn)入商品化生產(chǎn)。第98頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（1）抗蟲基因工程我國是楊樹抗蟲基因工程研究較早的國家之一，目前獲得的轉(zhuǎn)基因楊樹已相繼進(jìn)入大田試驗(yàn)及商業(yè)化階段。如中國林科院與中國科學(xué)院合作將Ｂt基因?qū)霘W洲黑楊、歐美楊和美州黑楊，獲得對舞毒蛾有毒殺作用的楊樹轉(zhuǎn)化再生植株，并進(jìn)入商品化生產(chǎn)階段。河北農(nóng)業(yè)大學(xué)將Bt基因和慈菇蛋白酶抑制劑基因構(gòu)建在一個植物表達(dá)載體上，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)將此表達(dá)載體上的雙基因轉(zhuǎn)入白楊優(yōu)良雜種741楊中，獲得了對楊扇舟蛾、舞毒蛾、美國白蛾等鱗翅目害蟲具高抗性的植株。轉(zhuǎn)基因植株的幼蟲死亡率達(dá)到80％以上，存活幼蟲生長發(fā)育受到明顯抑制，植株生長發(fā)育未受影響，現(xiàn)進(jìn)入商品化生產(chǎn)階段。到目前為止，轉(zhuǎn)Ｂt基因的樹種有楊樹、蘋果、核桃、落葉松、花旗松、火炬松和云杉等。第99頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（1）抗蟲基因工程轉(zhuǎn)抗蟲基因植株的應(yīng)用可以產(chǎn)生抗蟲效果，但存在的潛在問題也是明顯的。Bt毒蛋白仍存在殺蟲譜帶窄、毒力不夠強(qiáng)的問題。除了轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境安全考慮外，害蟲的耐受性是一個不容忽視的問題。由于樹木長期的生長過程中基因始終不變，而昆蟲經(jīng)過許多世代演化后，一旦對這種轉(zhuǎn)基因樹木產(chǎn)生抗性，轉(zhuǎn)基因植株將失去其自身的價值。第100頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（2）抗病基因工程抗病基因根據(jù)其作用對象可分為：抗病毒基因、抗真菌基因和抗細(xì)菌基因。在林業(yè)上，抗病毒基因工程研究起步較晚，目前使用的只有楊樹花葉病毒外殼蛋白（PMV-CP）基因、洋李痘病毒的外殼蛋白（PPV）基因和黃瓜花葉病毒外殼蛋白（CMV-CP）基因等幾種。英國牛津大學(xué)的Cooper研究小組克隆了楊樹花葉病毒外殼蛋白基因，將其轉(zhuǎn)化楊樹并獲得成功。Camara等（1995）把洋李痘病毒的外殼蛋白（PPV）基因分別導(dǎo)入李和杏中，獲得了較好的抗PPV特性。我國在這方面未見成功報道。第101頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（2）抗病基因工程林木抗真菌和細(xì)菌基因研究有一定的進(jìn)展。目前克隆出抗真菌性病害的基因有幾丁質(zhì)酶基因（Chi）和角質(zhì)酶基因（Cut），已構(gòu)建了能在楊樹細(xì)胞中表達(dá)的幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)系統(tǒng)。2001年Liang等將來自小麥的草酸氧化酶基因?qū)霔顦洌岣吡宿D(zhuǎn)基因植株的抗真菌能力。我國已從兔子中成功地克隆了防御素NP-1基因，構(gòu)建了植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將該基因?qū)朊讞?，檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株組織提取液對枯草桿菌、農(nóng)桿菌和立枯病原菌等多種微生物的生長均有不同程度的抑制作用。第102頁，共112頁，2023年，2月20日，星期一（3）抗旱和耐鹽堿基因工程植物抗?jié)B透脅迫是受多基因控制的復(fù)合遺傳性狀，與許多生理生化過程有關(guān)。能否對抗?jié)B透脅迫特征進(jìn)行遺傳改良，關(guān)鍵在于能否找到限速代謝步驟以及克隆到限速酶的基因。目前，已經(jīng)從不同植物中克隆到谷氨酸合成脯氨酸代謝途徑中的催化關(guān)鍵酶—吡咯啉5羧酸合成酶基因(P5CS)和膽堿合成甜菜堿的最后一個催化酶基因—甜菜堿醛脫氫酶基因(BADH)。除甜菜堿和脯氨酸外，其它滲透調(diào)節(jié)物甘露醇和山梨醇的合成關(guān)鍵酶1－磷酸甘露醇脫氫(mtlD)和6磷酸山梨醇脫氫酶基因(gutD)也相繼從大腸桿菌中被克