未知病原菌的分離鑒定

未知病原菌的分離鑒定第1頁(yè)/共35頁(yè)未知病原菌的分離鑒定

第2頁(yè)/共35頁(yè)病原菌檢測(cè)程序藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)本直接涂片、染色、鏡檢分離、鑒定生化試驗(yàn)(書(shū)p17-18)血清學(xué)試驗(yàn)(玻片凝集法)動(dòng)物試驗(yàn)(產(chǎn)毒性、分離)初步診斷分子生物學(xué)技術(shù)(核酸雜交、PCR、基因芯片核酸)

其他檢測(cè)技術(shù)觀察培養(yǎng)特征、形態(tài)特征病原菌抗原檢測(cè)形態(tài)結(jié)構(gòu)第3頁(yè)/共35頁(yè)臨床標(biāo)本中未知病原性球菌的分離鑒定程序

臨床標(biāo)本直接涂片、革蘭染色、鏡檢(形態(tài),排列,染色性)血瓊脂平板/巧克力血瓊脂平板(菌落性狀,溶血性,色素)可疑菌落

涂片,染色,鏡檢

純培養(yǎng)

生化反應(yīng)

致病性測(cè)定

藥敏試驗(yàn)

思考：如何從膿拭子、咽拭子中分離并鑒定病原性球菌？第4頁(yè)/共35頁(yè)查病原標(biāo)本膿血便、肛拭子選擇/鑒別培基生化反應(yīng)血清學(xué)鑒定雙糖發(fā)酵,橘櫞酸鹽利用試驗(yàn),尿素,靛基質(zhì)試驗(yàn)……玻片凝集試驗(yàn)SS平板,中國(guó)蘭,EMB未知腸道桿菌的分離鑒定程序

第5頁(yè)/共35頁(yè)伊紅美藍(lán)平板---

EMBEosin-methyleneblueagar,EMB第6頁(yè)/共35頁(yè)克氏雙糖鐵試驗(yàn)Doublesugarironslant第7頁(yè)/共35頁(yè)枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)Citrateslant第8頁(yè)/共35頁(yè)吲哚試驗(yàn)Indolebroth第9頁(yè)/共35頁(yè)玻片凝集第10頁(yè)/共35頁(yè)一、材料：5人/組1.待檢標(biāo)本：

膿拭子、咽拭子、尿液標(biāo)本、肛拭子1#、肛拭子2#

2.培養(yǎng)基：血平板 3塊/組

EMB平板 3塊/組克氏雙糖鐵斜面 3支/組 動(dòng)力-靛基質(zhì)-尿素半固體 3支/組3.其他：革蘭染液、玻片、10%膽鹽、靛基質(zhì)試劑、NS、兔血漿、

3%H2O2、沙門(mén)氏菌多價(jià)血清、志賀氏菌多價(jià)血清

二、方法(實(shí)驗(yàn)程序)三、結(jié)果四、討論設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)

臨床標(biāo)本中病原菌的分離與鑒定第11頁(yè)/共35頁(yè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖煜づR床標(biāo)本中常見(jiàn)病原菌的分離鑒定程序?qū)W習(xí)膿汁、痰、糞便、尿液等臨床標(biāo)本的檢查方法實(shí)驗(yàn)要求針對(duì)病例，對(duì)臨床標(biāo)本中的病原菌進(jìn)行分離和鑒定實(shí)驗(yàn)前制定方案，實(shí)驗(yàn)后寫(xiě)出實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)分組5人/組1套標(biāo)本/組（膿汁、痰、尿液、糞便）進(jìn)程安排實(shí)驗(yàn)分3次進(jìn)行第12頁(yè)/共35頁(yè)實(shí)驗(yàn)材料膿汁標(biāo)本：膿拭子培養(yǎng)基：血瓊脂平板其他：3%H2O2、兔血漿、生理鹽水、革蘭染液、玻片等第13頁(yè)/共35頁(yè)膿拭子

分離培養(yǎng)（血平板）革蘭染色革蘭染色觸酶實(shí)驗(yàn)血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方案第1次課第2次課第14頁(yè)/共35頁(yè)實(shí)驗(yàn)操作與觀察觸酶實(shí)驗(yàn)+-觸酶實(shí)驗(yàn)：挑取菌落置玻片上；滴加1～2滴3%H2O2，觀察結(jié)果；第15頁(yè)/共35頁(yè)實(shí)驗(yàn)操作與結(jié)果血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)+-凝固酶實(shí)驗(yàn)：取生理鹽水于玻片上，挑取待檢菌置于生理鹽水中，制成菌懸液，觀察有無(wú)自凝現(xiàn)象。向菌懸液中加1滴兔血漿并混合，觀察結(jié)果。第16頁(yè)/共35頁(yè)實(shí)驗(yàn)材料痰標(biāo)本：咽拭子培養(yǎng)基：血瓊脂平板其他：生理鹽水、10%膽鹽、Optochin紙片、革蘭染液、玻片等第17頁(yè)/共35頁(yè)咽拭子革蘭染色革蘭染色莢膜染色膽汁溶菌實(shí)驗(yàn)奧普托辛實(shí)驗(yàn)

分離培養(yǎng)（血平板）實(shí)驗(yàn)方案第1次第2次第3次觀察奧普托辛實(shí)驗(yàn)結(jié)果第18頁(yè)/共35頁(yè)實(shí)驗(yàn)操作奧普托辛實(shí)驗(yàn)：挑取菌落涂于血平板上，將optochin紙片貼于接種處；37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，觀察結(jié)果。第19頁(yè)/共35頁(yè)膽汁溶菌實(shí)驗(yàn)（平板法）：在血平板上標(biāo)記單個(gè)菌落直接在菌落上加一接種環(huán)去氧膽酸納溶液將平板37℃孵育20～30分鐘，觀察結(jié)果實(shí)驗(yàn)操作第20頁(yè)/共35頁(yè)莢膜染色：石炭酸復(fù)紅單染

1.涂片、自然干燥、火焰固定；

2.1滴石炭酸復(fù)紅，立即沖去，鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)操作第21頁(yè)/共35頁(yè)實(shí)驗(yàn)材料尿標(biāo)本：尿液培養(yǎng)基：EMB平板克氏雙糖鐵斜面培養(yǎng)基動(dòng)力-靛基質(zhì)-尿素半固體瓊脂培養(yǎng)基其他：革蘭染液、靛基質(zhì)試劑、玻片等第22頁(yè)/共35頁(yè)尿液

離心沉淀1500轉(zhuǎn)，10分鐘

分離培養(yǎng)（EMB平板）革蘭染色革蘭染色克氏雙糖鐵斜面培養(yǎng)基動(dòng)力-靛基質(zhì)-尿素半固體瓊脂培養(yǎng)基觀察結(jié)果觀察結(jié)果完成靛基質(zhì)試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方案第1次第2次第3次第23頁(yè)/共35頁(yè)實(shí)驗(yàn)材料糞便標(biāo)本：肛拭子（1#、2#）培養(yǎng)基：EMB平板克氏雙糖鐵斜面培養(yǎng)基動(dòng)力-靛基質(zhì)-尿素半固體瓊脂培養(yǎng)基其他：生理鹽水、靛基質(zhì)試劑、沙門(mén)菌多價(jià)血清、志賀菌多價(jià)血清、玻片等第24頁(yè)/共35頁(yè)肛門(mén)拭子1、2EMB平板克氏雙糖鐵斜面培養(yǎng)基動(dòng)力-靛基質(zhì)-尿素半固體瓊脂培養(yǎng)基觀察結(jié)果觀察結(jié)果完成靛基質(zhì)試驗(yàn)玻片凝集試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方案第1次第2次第3次第25頁(yè)/共35頁(yè)討論內(nèi)容針對(duì)實(shí)驗(yàn)步驟的討論；對(duì)結(jié)果的分析；還需要進(jìn)一步做哪些實(shí)驗(yàn)；此次實(shí)驗(yàn)成功或需要改進(jìn)的地方；其他預(yù)習(xí)：肥達(dá)反應(yīng)第26頁(yè)/共35頁(yè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

臨床標(biāo)本中病原菌的分離與鑒定

班級(jí)________

組別_________

姓名_________

學(xué)號(hào)_________

日期________

材料

1.待檢標(biāo)本：

2.培養(yǎng)基：

3.其他：

方法

結(jié)果

討論（包括對(duì)結(jié)果的分析、結(jié)論以及尚需追加實(shí)驗(yàn)等）

第27頁(yè)/共35頁(yè)肥達(dá)試驗(yàn)(Widaltest)

用已知的傷寒沙門(mén)菌O、H抗原、甲型副傷寒沙門(mén)菌、肖氏、希氏沙門(mén)菌H抗原的診斷菌液，與患者血清作定量凝集試驗(yàn)，檢測(cè)患者血清中的相應(yīng)抗體，輔助診斷傷寒、副傷寒。GeorgesWidalin1896(French)第28頁(yè)/共35頁(yè)Widaltest正常值：診斷傷寒：O凝集效價(jià)>1:80,H凝集效價(jià)>1:160;

診斷副傷寒：O凝集效價(jià)>1:80,H凝集效價(jià)>1:80

才有診斷價(jià)值.動(dòng)態(tài)觀察：抗體效價(jià)隨病程延長(zhǎng)而上升；雙份血清升高4倍或以上；O與H抗體的診斷意義：

O↑，H↑---腸熱癥(傷寒或副傷寒)的可能性大

O↓，H↓---患病的可能性小

O不高，H↑---預(yù)防接種/非特異性回憶反應(yīng)

O↑，H不高---感染早期或與傷寒沙門(mén)菌O抗原有交叉反應(yīng)的其他沙門(mén)菌感染少數(shù)病例在整個(gè)病程中，肥達(dá)試驗(yàn)始終呈“-”:

早期使用抗生素治療或患者免疫功能低下第29頁(yè)/共35頁(yè)Widaltest

(5人/組)材料：病人未知血清：1#，2#，3#菌液：O、H、PAH、PBH（已知Ag）方法：每組1塊多孔板/24支試管；每人2支吸管；第30頁(yè)/共35頁(yè)

棄0.5ml于消毒缸

12345 6 NS 0.50.50.50.50.50.5ml

未知血清(1:10)0.50.50.50.50.5

菌液(搖勻) 0.5 0.50.50.50.50.5ml(4種,1種/人)

1:401:801:1601:3201:640(陰性對(duì)照)

37℃，水浴過(guò)夜（完成一個(gè)完整的檢驗(yàn)）方法第31頁(yè)/共35頁(yè)

TOTHTAHTBHTCH意義

1:640

1:320

1:6401:320

1:640

1:160

1:640

1:160

肥達(dá)反應(yīng)結(jié)果舉例:發(fā)病早期不久前患過(guò)傷寒/菌苗接種/非特異回憶傷寒副傷寒甲肖氏副傷寒第32頁(yè)/共35頁(yè)“O”抗原凝集現(xiàn)象：（呈顆粒狀薄膜）100％凝集：“＋＋＋＋”：上層清亮，底部完全凝集，呈顆粒狀薄膜（有卷邊）。75％凝集：“＋＋＋”：上層不太清亮，底部凝集明顯。50％凝集：“＋＋”：上層混濁，下層凝集?？椎字醒胫虚g約50％白色沉淀，周?chē)钅?，約50％。25％凝集：“＋”：液體比較混濁，膜狀凝集少。0％凝集：“－”：如第6孔，混懸后，混濁均勻，底部無(wú)凝集。第33頁(yè)/共35頁(yè)“H”抗原