核酸含量測定

核酸含量測定第1頁/共14頁2定磷法的原理首先將核酸樣品用硫酸消化成無機(jī)磷，利用定磷試劑測定無機(jī)磷量。反應(yīng)式為：(NH4)MoO4+H2SO4H2MoO4+(NH4)2SO4H3PO4+12H2MoO4H3P(Mo3O10)4+12H2O

H3P(Mo3O10)4Mo2O3?

MoO3（鉬藍(lán)）Vit?C第2頁/共14頁3

還原產(chǎn)物鉬藍(lán)在波長660nm測定吸光值，當(dāng)無機(jī)磷含量在1—25μg范圍內(nèi)，光吸收和含磷量成正比。

RNA的含磷量為9.5%，即1μgRNA磷相當(dāng)于10.5μgRNA。DNA的含磷量平均為9.9%。第3頁/共14頁4試劑酵母RNA樣品溶液：2000μg/mL標(biāo)準(zhǔn)磷原液：含磷量為1000μg/mL標(biāo)準(zhǔn)磷溶液：含磷量為10μg/mL，每組用干試管取15mL定磷試劑：含硫酸、鉬酸銨、Vit.C，淺黃色，如果變綠則不能使用,每組用100mL燒杯取70mL第4頁/共14頁5實(shí)驗(yàn)步驟1.核酸樣品用硫酸消化，將有機(jī)磷轉(zhuǎn)化成無機(jī)磷；2.制定定磷標(biāo)準(zhǔn)曲線；3.測定回收率和樣品總磷量。第5頁/共14頁61.樣品消化（每兩組或三組做一份）消化管123RNA/mL010標(biāo)準(zhǔn)磷原液/mL001dH2O/mL1005mol/LH2SO4/mL222消煮爐中消化2—6h至溶液無色透明，冷卻dH2O/mL111沸水浴中加熱10min（分解焦磷酸），冷卻用dH2O定容/mL505050混勻第6頁/共14頁72.定磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定（每人做一份）

每人取18支試管，按照下表平行操作：

1

234

5

6標(biāo)準(zhǔn)磷溶液/mL00.10.20.30.40.5dH2O/mL1.51.41.31.21.11.0定磷試劑/mL1.51.51.51.51.51.5用漩渦混合器混勻，45℃恒溫水浴保溫25分鐘用去離子水作為空白，660nm測定吸光值A(chǔ)660(1)A660(2)A660平均值A(chǔ)660平均值—空白0第7頁/共14頁8

3.測定總磷量和回收率（與2同時(shí)進(jìn)行）7（空白）

8（樣品）9（標(biāo)準(zhǔn)）定容溶液/mL1.51.50.15dH2O/mL001.35定磷試劑/mL1.51.51.5用漩渦混合器混勻，45℃恒溫水浴保溫25分鐘A660(1)A660(2)A660平均值A(chǔ)660平均值—空白0第8頁/共14頁9數(shù)據(jù)處理關(guān)于空白：1—6號管用于繪制定磷標(biāo)準(zhǔn)曲線，1號管作為空白。7—9號管用于樣品及回收率的測定，7號管作為空白。以每管含磷量(μg)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)畫標(biāo)準(zhǔn)曲線，直線應(yīng)過原點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品(x)和標(biāo)準(zhǔn)磷(y)的含磷量(μg)。第9頁/共14頁10計(jì)算回收率：

(2)計(jì)算樣品總磷量：

(3)計(jì)算RNA量：

(4)樣品RNA含量：第10頁/共14頁11操作注意事項(xiàng)1.每人獨(dú)立操作，不允許兩人穿插取樣；2.要求試劑及所有器皿清潔，不含磷；3.每管加樣和測定均要求平行操作；4.消化溶液定容后務(wù)必上下顛倒混勻后再取樣；5.各種試劑必須用移液管按順序準(zhǔn)確量取，移液管口用吸水紙擦凈，溶液盡量加到試管下部，標(biāo)準(zhǔn)溶液要求用差量法。6.漩渦混合器的使用：用點(diǎn)動(dòng)檔，試管豎直或稍傾斜垂直向下用力。7.測定吸光值時(shí)，用一個(gè)比色杯裝去離子水調(diào)節(jié)分光光度計(jì)零點(diǎn)，另一個(gè)比色杯按照從低濃度到高濃度的順序測定，不用潤洗，切忌甩比色杯，將藍(lán)色溶液撒在儀器和地面上。

第11頁/共14頁12思考題1.回收率的意義；2.實(shí)驗(yàn)所用的水質(zhì)、試劑質(zhì)量、定磷試劑的酸度對測定結(jié)果的影響。第12頁/共14頁13實(shí)