核酸重要理化性質(zhì)

核酸重要理化性質(zhì)第1頁(yè)/共17頁(yè)三、核酸的水解1.核酸的酸解和堿解

核酸分子中的磷酸二酯鍵可在酸或堿性條件下水解切斷（降解）。酸對(duì)核酸的作用因酸的濃度、溫度和作用時(shí)間不同而不同。嘌呤堿基比嘧啶堿基易被水解下來(lái)。DNA和RNA對(duì)堿的耐受程度有很大差別。例如，在0.3-1mol/LNaOH溶液中，在室溫至370C條件下RNA幾乎可以完全水解，生成2′-或3′-磷酸核苷；DNA在同樣條件下則不受影響，若加溫至1000C，4個(gè)小時(shí)也可得到小分子的寡聚脫氧核苷酸。這種水解性能上的差別，與RNA核糖基上2′-OH的羥基參與作用有很大的關(guān)系。在RNA水解時(shí)，2′-OH首先進(jìn)攻磷酸基，在斷開磷酯鍵的同時(shí)形成環(huán)狀磷酸二酯，再在堿的作用形成水解產(chǎn)物。第2頁(yè)/共17頁(yè)2、核酸的酶解生物體內(nèi)存在多種核酸水解酶。這些酶可以催化水解多聚核苷酸鏈中的磷酸二酯鍵。以DNA為底物的DNA水解酶（DNases）和以RNA為底物的RNA水解酶（RNases）。根據(jù)作用方式又分作兩類：核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶。核酸外切酶的作用方式是從多聚核苷酸鏈的一端（3′-端或5′-端）開始，逐個(gè)水解切除核苷酸；核酸內(nèi)切酶的作用方式剛好和外切酶相反，它從多聚核苷酸鏈中間開始，在某個(gè)位點(diǎn)切斷磷酸二酯鍵。（小球菌核酸酶即可外切又可內(nèi)切）在分子生物學(xué)研究中最有應(yīng)用價(jià)值的是限制性核酸內(nèi)切酶。這種酶可以特異性的水解核酸中某些特定堿基順序部位。第3頁(yè)/共17頁(yè)四、核酸的紫外吸收在核酸分子中，由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，因而具有獨(dú)特的紫外線吸收光譜，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作為核酸及其組分定性和定量測(cè)定的依據(jù)。第4頁(yè)/共17頁(yè)五．核酸的變性、復(fù)性與雜交1.核酸的變性（denaturation）與變性因素核酸的變性是指核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過程。變性核酸將失去其部分或全部的生物活性。核酸的變性并不涉及磷酸二酯鍵的斷裂，所以它的一級(jí)結(jié)構(gòu)(堿基順序)保持不變。能夠引起核酸變性的因素很多。溫度升高、酸堿度改變、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的變性。第5頁(yè)/共17頁(yè)RNA本身只有局部的雙螺旋區(qū)，所以變性行為所引起的性質(zhì)變化沒有DNA那樣明顯。利用紫外吸收的變化，可以檢測(cè)核酸變性的情況。因?yàn)樘烊粻顟B(tài)的DNA在完全變性后，紫外吸收(260nm)值增加25－40%.而RNA變性后，約增加1.1%。增色效應(yīng)：變性后DNA對(duì)260nm紫外光的吸收率（A260）比變性前明顯增加，這種現(xiàn)象稱為增色效應(yīng).第6頁(yè)/共17頁(yè)A260值增加粘度下降浮力密度增大分子量不變2.DNA變性后的表現(xiàn)第7頁(yè)/共17頁(yè)3.DNA的熱變性和解鏈溫度（Tm）用加熱的方法使DNA變性叫做熱變性DNA的變性過程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。因此，通常將DNA的變性達(dá)到50%時(shí)，即增色效應(yīng)達(dá)到一半時(shí)的溫度稱為DNA的解鏈溫度（meltingtemperature,Tm）,Tm也稱熔解溫度或DNA的熔點(diǎn)。

一般DNA的Tm值在70-85C之間RNA的Tm值tRNA的Tm值第8頁(yè)/共17頁(yè)G和C的含量高，Tm值高。因而測(cè)定Tm值，可反映DNA分子中G、C含量，可通過經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算：

（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44Tm大小可反映出DNA的均一性：均質(zhì)DNA的熔解過程發(fā)生在一個(gè)較小的溫度范圍內(nèi)；異質(zhì)DNA的熔解過程發(fā)生在一個(gè)較寬的溫度范圍內(nèi)。Tm與介質(zhì)中離子強(qiáng)度有關(guān)：DNA的保存應(yīng)在含鹽的緩沖液中溫度/0CA2600.020.11.0mol/LKCl第9頁(yè)/共17頁(yè)DNA變性（加熱或極端pH）第10頁(yè)/共17頁(yè)當(dāng)DNA的稀鹽溶液加熱到80-100℃時(shí)，雙螺旋結(jié)構(gòu)即發(fā)生解體，兩條鏈彼此分開，形成無(wú)規(guī)線團(tuán)。DNA變性后，它的一系列性質(zhì)也隨之發(fā)生變化，如紫外吸收(260nm)值升高,粘度降低等。第11頁(yè)/共17頁(yè)4、核酸的復(fù)性變性DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復(fù)性。DNA復(fù)性后，一系列物理、化學(xué)性質(zhì)將得到恢復(fù)。DNA復(fù)性的程度、速率與復(fù)性過程的條件有關(guān)。將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時(shí)，DNA不可能復(fù)性。但是將變性的DNA緩慢冷卻時(shí)，可以復(fù)性，這一過程也叫退火（annealing)。分子量越大復(fù)性越難。濃度越大，復(fù)性越容易。此外，DNA的復(fù)性也與它本身的組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)。復(fù)性反應(yīng)的速度用Cot1/2表示。Co為變性DNA復(fù)性時(shí)的濃度，t為時(shí)間，以秒表示。（P352）第12頁(yè)/共17頁(yè)DNA復(fù)性第13頁(yè)/共17頁(yè)5、核酸的雜交（hybridization）熱變性的DNA單鏈，在復(fù)性時(shí)并不一定與同源DNA互補(bǔ)鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，它也可以與在某些區(qū)域有互補(bǔ)序列的異源DNA單鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。這樣形成的新分子稱為雜交DNA分子。DNA單鏈與互補(bǔ)的RNA鏈之間也可以發(fā)生雜交。核酸的雜交在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究中具有重要意義。第14頁(yè)/共17頁(yè)核酸的雜交第15頁(yè)/共17頁(yè)核酸雜交的應(yīng)用Sout