第三章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)

第三章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)第1頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一一、限制性核酸內(nèi)切酶二、ＤＮＡ連接酶三、DNA聚合酶四、其他酶第2頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一一、限制性核酸內(nèi)切酶

（restrictionendonuclease）這類酶又簡(jiǎn)稱為限制性內(nèi)切酶或限制酶是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核苷酸內(nèi)切酶第3頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一１．寄主控制的限制（restriction）與修飾(modification)現(xiàn)象

人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙，即所謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡(jiǎn)稱（R/M體系）細(xì)菌的R/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的DNA與外來(lái)的DNA，并能使后者降解掉第4頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第5頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一R/M體系：

寄主是由兩種酶活性配合完成的一種是修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶另一種是核酸內(nèi)切限制酶第6頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶當(dāng)λ(k)噬菌體侵染E.coliB時(shí)，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識(shí)別的堿基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識(shí)別序列的特定堿基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能識(shí)別已甲基化的序列。第7頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

R/M體系的作用：保護(hù)自身的DNA不受限制；破壞外源DNA使之迅速降解第8頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一限制性內(nèi)切酶本是微生物細(xì)胞中用于專門水解外源DNA的一類酶，其功能是避免外源DNA的干擾或噬菌體的感染，是細(xì)胞中的一種防御機(jī)制。由于R/M現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)使得核酸內(nèi)切酶成為基因工程重要的工具酶。根據(jù)酶的功能、大小和反應(yīng)條件，及切割DNA的特點(diǎn)，可以將限制性內(nèi)切酶分為三類：Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶２．限制性內(nèi)切酶的分類第9頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一Ⅰ型酶：

1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分離出的核酸內(nèi)切酶。分子量較大，反應(yīng)需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。這類酶有特異的識(shí)別位點(diǎn)但沒(méi)有特異的切割位點(diǎn)，而且切割是隨機(jī)的，所以在基因工程中應(yīng)用不大。第10頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一Ⅲ型酶

這類酶可識(shí)別特定堿基順序，并在這一順序的3’端24~26bp處切開ＤＮＡ，所以它的切割位點(diǎn)也是沒(méi)有特異性的。

第11頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一Ⅱ型酶

1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中分離出來(lái)的限制酶。分子量較小（105Da），只有一種多肽，通常以同源二聚體的形式存在。反應(yīng)只需Mg++的存在，并且具有以下兩個(gè)特點(diǎn)，使這類酶在基因工程研究中，得到廣泛的應(yīng)用。識(shí)別位點(diǎn)是一個(gè)回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)，并且切割位點(diǎn)也在這一回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)上。許多Ⅱ型酶切割DNA后，可在DNA上形成粘性末端，有利于DNA片段的重組。

第12頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一主要特性I型II型III型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白結(jié)構(gòu)異源三聚體同源二聚體異源二聚體輔助因子ATPMg2+SAMMg2+Mg2+SAMATP識(shí)別序列TGAN8TGCTAACN6GTGC旋轉(zhuǎn)對(duì)稱序列GAGCCCAGCAG切割位點(diǎn)距距識(shí)別序列1kb處隨機(jī)性切割識(shí)別序列內(nèi)或附近特異性切割識(shí)別序列下游24--26bp處第13頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

第一個(gè)字母：大寫，表示所來(lái)自的微生物屬名的第一個(gè)字母

第二、三字母：小寫，表示所來(lái)自的微生物種名的第一、二個(gè)字母

其它字母：大寫或小寫，表示所來(lái)自的微生物的菌株號(hào)

羅馬數(shù)字：表示該菌株發(fā)現(xiàn)的限制酶的編號(hào)

3.限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則：例：

EcoRI:來(lái)自于Escheria

coli

RY13

的第一個(gè)限制酶

第14頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶Haemophilusinfluenzaed屬名種名株名嗜血流感桿菌d株HindIIHindIII1968年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中分離出

HindII和HindIII第15頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一4．限制酶的特性a.限制酶識(shí)別靶序列同DNA的來(lái)源無(wú)關(guān)；b.限制酶識(shí)別靶序列是唯一的（對(duì)某種限制酶只具一個(gè)限制位點(diǎn)的質(zhì)粒）。第16頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一二、Ⅱ型酶第17頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1.II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性

識(shí)別雙鏈DNA分子中4-8對(duì)堿基的特定序列，大部分酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列內(nèi)部或兩側(cè)，識(shí)別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱型回文結(jié)構(gòu)EcoRI的切割位點(diǎn)EcoRI的識(shí)別序列5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’第18頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’EcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’退火4-7℃

OH

P5‘…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C…5’POHEcoRI37℃第19頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一PstI等產(chǎn)生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃退火4-7℃OHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3‘…C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C…5’POH第20頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一PvuII等產(chǎn)生的平頭末端5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃第21頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.核酸內(nèi)切酶作用后的斷裂方式

（1）粘性末端：兩條鏈上的斷裂位置是交錯(cuò)地、但又是圍繞著一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)中心，這樣形式的斷裂結(jié)果形成具有粘性末端的DNA片斷。

第22頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一GGATCCCCTAGGGCCTAGGGATCCG+第23頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一5′-端突出粘性末端

3′-端突出5′

AATTC

3′Ｇ

5′Ｇ

3′ACGTC第24頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（2）平末端兩條鏈上的斷裂位置是處在一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的中心這樣形式的斷裂是形成具有平末端的DNA片斷。不易重新環(huán)化。

第25頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一HindGTCGACCAGCTGGTCCAGGACCTG+第26頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第27頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3．同裂酶（isoschizomers)

指來(lái)源不同但識(shí)別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶，同裂酶進(jìn)行同樣的切割，產(chǎn)生同樣的末端。但有些同裂酶對(duì)甲基化位點(diǎn)的敏感性不同。Example:

限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一對(duì)同裂酶(CCGG)，當(dāng)靶序列中有一個(gè)5-甲基胞嘧啶時(shí)HpaⅡ不能進(jìn)行切割，而MspⅠ可以。第28頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一4．同尾酶（isocaudamer）指來(lái)源不同、識(shí)別靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。利用同尾酶可使切割位點(diǎn)的選擇余地更大。第29頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

雜種位點(diǎn)（hybridsite）由一對(duì)同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端共價(jià)結(jié)合形成的位點(diǎn)。一般不能被原來(lái)的任何一種同尾酶識(shí)別。

BamHⅠG

GATCCBclⅠT

GATC

A

C

CTAG

G

A

CTAG

T

雜種位點(diǎn)：T

GATC

C（BamHⅠ）

（BclⅠ）

ACTAG

G

第30頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一5．限制片斷的末端連接作用

（１）分子間的連接：不同的DNA片斷通過(guò)互補(bǔ)的粘性末端之間的堿基配對(duì)而彼此連接起來(lái)。第31頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（2）分子內(nèi)的連接：由同一片斷的兩個(gè)互補(bǔ)末端之間的堿基配對(duì)而形成的環(huán)形分子第32頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一6.II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作大部分II型核酸內(nèi)切酶需要相似的反應(yīng)條件Tris--HCl50mMpH7.5MgCl210mM0-50mM低鹽酶NaCl0-150mM100mM中鹽酶DTT1mM150mM高鹽酶Volume20-100μlT37℃1-1.5h1U核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)1小時(shí)，完全水解1μg標(biāo)準(zhǔn)DNA所需的酶量第33頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一對(duì)鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時(shí)酶切，但應(yīng)注意：

BamHISmaI5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：5‘…GCTACATGGATTCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’第34頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：對(duì)鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法：

使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時(shí)酶解低鹽酶先切，然后補(bǔ)加鹽，高鹽酶再切一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切0.1倍體積的5MNaAcpH5.42.5倍體積的冰冷乙醇冰浴5分鐘、高速冷凍離心10分鐘、干燥第35頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一6．影響核酸內(nèi)切酶活性的因素：（１）DNA的純度：蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTTA、SDS、NaCl等DNase的污染(Mg++)

a.增加核酸內(nèi)切限制酶的用量；

b.擴(kuò)大酶催化反應(yīng)的體系（稀釋）；

c.延長(zhǎng)酶催化反應(yīng)的保溫時(shí)間。

d.加入亞精胺提高酶的消化作用，需適當(dāng)?shù)臏囟鹊?6頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（2）DNA的甲基化程度大腸桿菌中的dam甲基化酶在5‘GATC’3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影響大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG’3或5‘CCTGG’3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoRII等哺乳動(dòng)物中的甲基化酶在5‘CG’3序列中的C5位上引入甲基第37頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端pH值等，會(huì)使一些核酸內(nèi)切酶的識(shí)別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的Staractivity現(xiàn)象。

EcoRI在正常條件下識(shí)別并切割5‘GAATTC’3序列，但在甘油濃度超過(guò)5%（v/v）時(shí)，也可切割5‘PuPuATTPyPy3’或者5‘AATT’3（3）核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質(zhì)嘧啶堿基T/C嘌呤堿基A/G第38頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（4）酶切消化反應(yīng)的溫度：

大多數(shù)酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度37度（5）DNA的分子結(jié)構(gòu)：

某些核酸內(nèi)切限制酶切割超螺旋的質(zhì)?；虿《綝NA所需要的酶量要比消化線性的DNA高29倍第39頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一7．核酸內(nèi)切限制酶標(biāo)準(zhǔn)的緩沖液（1）.氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀：

不正確的NaCl或Mg++濃度，會(huì)降低限制酶的活性，還可能導(dǎo)致識(shí)別序列的改變

（2）.Tris-HCl：

維持最適的pH值（pH＝7.4）（3）.β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）：

維持酶的穩(wěn)定性（4）.牛血清蛋白（BSA）：維持酶的穩(wěn)定性第40頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一8．核酸內(nèi)切限制酶對(duì)DNA的消化作用（1）核酸內(nèi)切限制酶以同型二聚體形式與靶序列發(fā)生作用（2）核酸內(nèi)切限制酶對(duì)DNA的局部消化完全的酶切消化：識(shí)別序列n個(gè)堿基的核酸內(nèi)切限制酶，對(duì)DNA的切割能達(dá)到每隔4n切割一次的水平第41頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（3）核酸內(nèi)切限制酶對(duì)真核生物基因組的消化作用小分子量的片斷-----少（電泳-容易分離目的片斷）大分子量的片斷-----多（基因文庫(kù)）

第42頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1．ＤＮＡ連接酶2．體外連接1．ＤＮＡ連接酶2．體外連接第43頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1.1ＤＮＡ連接酶的作用機(jī)理

能夠?qū)NA鏈上彼此相鄰的3’-羥基（OH）和5’-磷酸基團(tuán)（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯鍵。只能連接缺口（nick），不能連接裂口（gap）。而且被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。第44頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第45頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第46頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

酶－－AMP（腺苷－磷酸）磷酸酰胺鍵DNA的腺苷酸復(fù)合物3’-OH對(duì)P原子作親核攻擊形成磷酸二酯鍵連接酶的作用機(jī)理此反應(yīng)是由焦磷酸(ppi)的水解作用激發(fā)的需要花費(fèi)兩個(gè)高能磷酸鍵（賴氨酸殘基）第47頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

1.2連接酶的來(lái)源

.DNA連接酶：大腸桿菌染色體編碼的

.T4DNA連接酶：大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼的

DNA連接酶－－NAD+T4DNA連接酶－－ATP第48頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一Ｔ４ＤＮＡ連接酶（DNAligase）

該酶常從Ｔ４噬菌體的受體細(xì)胞中提取，是由Ｔ４噬菌體基因組所編碼的，基因工程中常用的連接酶是Ｔ４連接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二脂鍵的形成，從而使兩個(gè)片段以共價(jià)鍵的形式結(jié)合起來(lái)

DNA連接酶對(duì)具有粘性末端的DNA分子經(jīng)退火后能很好地連接，對(duì)平末端的DNA分子也可以進(jìn)行連接，但連接效率較低，必須加大酶的用量。第49頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第50頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

1.3影響連接酶作用的因素（1）反應(yīng)溫度：連接缺口的溫度：37度

連接粘性末端的最佳溫度：4～15度（2）Ｔ４ＤＮＡ連接酶的用量：

平末端DNA分子的連接反應(yīng)中，最適1～2個(gè)單位。粘性末端DNA片斷之間的連接，酶濃度0.1個(gè)單位。

ATP的用量10μmol～1mmol/L之間（3）提高外源片斷與載體的濃度的比值，（10～20倍）第51頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.體外連接第52頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一體外連接的三種方式a.

用DNA連接酶連接具有互補(bǔ)粘性末端的DNA片斷b.用T4DNA連接酶將平末端的DNA片斷連接；或是用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給具平末端的DNA片斷加上poly(A)-poly(T)尾巴之后，再用DNA連接酶連接。c.先在DNA片斷末端加上化學(xué)合成的銜接物或接頭，形成粘性末端后，再用DNA連接酶連接

第53頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.1粘性末端DAN片斷的連接

由于具粘性末端的載體易發(fā)生自連，對(duì)載體的5’末端進(jìn)行處理，用細(xì)菌的或小牛腸的堿性磷酸酶移去磷酸基團(tuán)，使載體不能自連。而外源片斷的5’-P能與載體的3’-OH進(jìn)行共價(jià)鍵的連接。這樣形成的雜種分子中，每一個(gè)連接位點(diǎn)中載體DNA只有一條鏈與外源片斷相連，失去5’-P的鏈不能進(jìn)行連接，形成3’-OH和5’-OH的缺口。

第54頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第55頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第56頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.2平末端DNA片斷的連接

（1）T4DNA連接酶（2)用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶給平末端加上同聚物尾巴之后，再用DNA連接酶連接。常用的連接方法：同聚物加尾法、銜接物法和接頭連接法第57頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

同聚物加尾法用5’末端特異的核酸外切酶處理DNA片斷在A和B分別中加入dATP和dTTP同聚物尾巴10～40個(gè)堿基第58頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

同聚物加尾法或T4連接酶的平末端連接法，無(wú)法用原來(lái)的限制酶作特異性的切割，對(duì)獲得插入片斷進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

第59頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一銜接物連接法

平末端的另一種處理方式是利用銜接物（linker）進(jìn)行處理，人工加上粘性末端。銜接物是一種人工合成的小分子DNA，約10~20個(gè)核苷酸，其結(jié)構(gòu)特征是含有多種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的回文結(jié)構(gòu)。如：

CCGGATCCGGGGCCTAGGCC

將銜接物分子與平末端DNA分子連接，再用限制性核酸內(nèi)切酶酶切，便可產(chǎn)生粘性末端。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是克隆位點(diǎn)具有限制酶的酶切位點(diǎn)

HpaIIHpaIIBamHI

或Sau3A第60頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

銜接物（linker）：是指用化學(xué)方法合成的一段由10～12個(gè)核苷酸組成、具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。

第61頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一銜接物連接法第62頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一雙銜接物：可以實(shí)現(xiàn)定向克隆，防止發(fā)生自連，同時(shí)對(duì)克隆片斷的再刪除也比較方便。第63頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一雙銜接物連接法的基本程序cDNA鏈的合成通過(guò)DNA聚合酶合成第二鏈加入SalI銜接物SI核酸酶作用后的末端單鏈突出序列，由Klenow補(bǔ)齊，加入第二銜接物EcolI第64頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

在用DNA銜接物連接法時(shí)，如果待克隆DNA的片斷或基因內(nèi)部，含有與所加銜接物相同的限制位點(diǎn)，在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時(shí)，也會(huì)把克隆的基因切斷。第65頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（４）DNA接頭（adapter）連接法：

1978年，美國(guó)康奈爾大學(xué)生化分子生物學(xué)系的教授吳瑞博士發(fā)明的。它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷。粘性末端容易通過(guò)堿基配對(duì)形成如同銜接物一樣的二聚體分子。對(duì)DNA接頭分子末端，進(jìn)行必要的修飾。移走粘性末端5’-P，暴露出5’-OH，不能產(chǎn)生穩(wěn)定的二聚體分子。第66頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第67頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一DNA接頭連接法第68頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（５）熱穩(wěn)定的連接從嗜熱高溫方線菌的菌株中分離出來(lái)的。能在高溫下催化兩條寡核苷酸探針發(fā)生連接用的一種核酸酶?？擅黠@的降低形成非特異性連接產(chǎn)物的幾率，在85度下具有酶活性。重復(fù)升溫94度之后仍具有酶活性。

第69頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一寡核苷酸連接測(cè)定（oligonucletideligationassay,OLA）用兩個(gè)寡核苷酸探針，同已知序列的靶DNA雜交，探針在靶DNA分子的位置是相鄰的。

探針長(zhǎng)度是20～25bp連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（lingasechainreaction,LCR）連接擴(kuò)增反應(yīng)（lingaseamplicationreaction）用寡核苷酸探針通過(guò)DNA連接酶的作用擴(kuò)增已知序列的靶DNA的方法。需要4種引物。

第70頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一寡核苷酸連接測(cè)定

AGTGACCTTCACTGGA

AGTGACCTAGT

T

ACCTTCACTGGATCACTGGA

AGTGACCTACCTAGTGACCTACCT

待擴(kuò)增的DNA片斷PPBBDD地高辛配基生物素磷酸BBBBDDPP陽(yáng)性信號(hào)無(wú)信號(hào)鏈霉抗生素蛋白由于堿基錯(cuò)配不能形成磷酸二酯鍵檢測(cè)單堿基的取代、插入、及缺失而引起的多態(tài)性堿性磷酸酶堿性磷酸酶底物第71頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一LCR：ligasechainreaction，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。樣品DNA、探針(4)94度變性、NAD55度退火第72頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一三、DNA聚合酶第73頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

常用的DNA聚合酶：

大腸桿菌DNA聚合酶、大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ的Klenow大片斷酶、

T4DNA聚合酶、

T7DNA聚合酶、

反轉(zhuǎn)錄酶等。第74頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一共同點(diǎn)：

把脫氧核糖核苷酸連續(xù)的加到雙鏈DNA分子引物鏈的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不發(fā)生從引物模板上解離的情況。第75頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1.大腸桿菌DNA聚合酶

DNA聚合酶Ｉ（PolＩ）、

DNA聚合酶（Pol）、

DNA聚合酶（Pol）、

PolＩ和Pol的主要功能參與DNA的合成；

Pol的功能同DNA的復(fù)制有關(guān)；

PolＩ同DNA分子克隆的關(guān)系最為密切。第76頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1.1大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ：

1957年，美國(guó)的生物學(xué)家A.Kornberg首次證實(shí)，在大腸桿菌提取物中存在一種DNA聚合酶，即現(xiàn)在所說(shuō)的DNA聚合酶Ｉ。由polＩ基因編碼的一種單鏈多肽蛋白質(zhì)，分子量為109103dal。

DNA聚合酶Ｉ，可以被蛋白酶切割成兩個(gè)片斷，一個(gè)具有全部的3’5’的外切酶活性和5’3’的聚合酶活性，另一個(gè)具有全部5’3’的外切酶活性。第77頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

DNA聚合酶Ｉ的酶活性：1.5’3’的聚合酶活性；2.5’3’的外切酶活性；3.3’5’的外切酶活性（較低）。第78頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

1.2DNA聚合酶Ｉ發(fā)揮作用的條件：

1、底物：四種脫氧核苷5’-三磷酸（dNTP）；

2、Mg＋＋離子；

3、帶有3’-OH游離基團(tuán)的引物鏈；

4、DNA模板：?jiǎn)捂?，雙鏈（糖-磷酸主鍵上有一個(gè)或多個(gè)斷裂）。

第79頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第80頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

PolＩ第81頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

1.3DNA聚合酶Ｉ5’3’的核酸外切酶活性

1、5’3’的外切酶活性，所切割的DNA鏈必須是位于雙螺旋的區(qū)段上；

2、切割部位可以是末端磷酸二酯鍵，也可以是在距5’末端數(shù)個(gè)核苷酸遠(yuǎn)的一個(gè)鍵上發(fā)生；

3、DNA的合成可以增強(qiáng)5’3’的核酸外切酶活性；

4、5’3’核酸外切酶的活性位點(diǎn)同聚合作用的活性位點(diǎn)以及3’5’的水解作用位點(diǎn)是分開的。第82頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第83頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

1.4DNA聚合酶Ｉ的3’5’核酸外切酶活性

能催化DNA鏈發(fā)生水解作用，從DNA鏈3’-OH末端開始向5’的方向水解DNA，并釋放出單核苷酸分子。

對(duì)酶活的影響：

反應(yīng)物中缺乏dNTPs時(shí)，大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ的3’5’核酸外切酶活性，將會(huì)發(fā)揮作用。但對(duì)于底物是雙鏈的DNA，在具有dNTPs時(shí)，這種降解活性將會(huì)被5’3’的聚合酶活性所抑制。

第84頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

第85頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

1.5DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途：

通過(guò)DNA缺口轉(zhuǎn)移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標(biāo)記的DNA探針

DNA缺口轉(zhuǎn)移（nicktranslation）

在DNA分子的單鏈缺口上，DNA聚合酶Ｉ的5’3’核酸外切酶活性和聚合作用可以同時(shí)發(fā)生。當(dāng)外切酶活性從缺口的5’一側(cè)移去一個(gè)5’核苷酸之后，聚合酶作用就會(huì)在缺口的3’一側(cè)補(bǔ)上一個(gè)新的核苷酸，但polＩ不能在3’-OH和5’-P之間形成一個(gè)鍵，隨著5’一側(cè)的核苷酸不斷移去，3’一側(cè)的核苷酸又按序列增補(bǔ)，缺口便沿著DNA分子合成的方向移動(dòng)

第86頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

DNA雜交探針的制備

典型的反應(yīng)體系是。在25μl總體積中含有1μg純化的特定DNA片斷，并加入適量的DnaseＩ、PolＩ、α-32p-dNTPs和未標(biāo)記的dNTPs。

DnaseＩ：造成DNA分子的斷裂或缺口；

PolＩ

：進(jìn)行缺口轉(zhuǎn)移，使反應(yīng)混合物中的32p標(biāo)記的核苷酸取代原有的未標(biāo)記的核苷酸，最終從頭到尾都被標(biāo)記。第87頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

dNTP對(duì)PolＩ酶活性的影響

在低濃度dNTPs的條件下，PolＩ具有良好的活性，提高dNTPs濃度時(shí)，PolＩ則能夠更有效的合成DNA。低濃度的32p-dNTPs（2μmol/L）和高濃度的dNTPs（20μmol/L）一般希望有30%左右的32p-dNTPs參入DNA鏈（DnaseＩ數(shù)量）。

第88頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.Klenow片斷與DNA末端標(biāo)記

Klenow片斷：是由大腸桿菌DNA聚合酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶的處理之后，產(chǎn)生出來(lái)的分子量為761000dal的大片斷分子。仍具有5’3’的聚合酶活性和3’5’的外切酶活性，失去了全酶的5’3’外切酶活性。

第89頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.1Klenow片斷的主要用途：（1

）、修補(bǔ)經(jīng)限制酶消化的DNA所形成的3’隱蔽末端；（2）、標(biāo)記DNA片斷的末端；（3）、cDNA克隆的第二鏈cDNA的合成；（4）、DNA序列的測(cè)定。第90頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

2.2DNA片斷末端標(biāo)記：

具有3’隱蔽末端的帶標(biāo)記得的DNA片斷

5’GATCT…3’3’A…5’在反應(yīng)物中加入Klenow聚合酶α-32p-dGTP,一道溫育后生成：

5’GATCT…3’

3’32pGA…5’

或是同時(shí)加入α-32p-dATP＋dGTP5’GATCT…3’3’32p

AGA…5’第91頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

DNA片斷末端標(biāo)記可以作為用凝膠電泳法測(cè)定分子大小的標(biāo)記樣品。因?yàn)楸粯?biāo)記的DNA片斷是同它們的摩爾濃度成比例，而與他們的分子大小無(wú)關(guān)。所以在限制酶消化過(guò)程產(chǎn)生的大小DNA片斷都得到了同等程度的標(biāo)記。不能夠有效的標(biāo)記帶有5’突出末端的DNA分子第92頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

3.T4DNA聚合酶和取代合成法標(biāo)記DNA片斷

1）從T4噬菌體感染的大腸桿菌培養(yǎng)物中純化出的一種特殊的DNA聚合酶。具有5’3’的聚合酶活性和3’5’的外切酶活性。2）在沒(méi)有脫氧核苷三磷酸存在的情況下，3’外切酶活性便是T4DNA聚合酶的獨(dú)特功能。作用于雙鏈DNA片斷，并按3’5’的方向從3’-OH末端開始降解DNA。如果反應(yīng)物中存在一種dNTP時(shí)，它的水解作用進(jìn)行到暴露出同反應(yīng)物中唯一的dNTP互補(bǔ)的核苷酸時(shí)就會(huì)停止。3）在反應(yīng)過(guò)程中，通過(guò)T4DNA聚合作用，反應(yīng)物中的α-32p-dNTP逐漸地取代了被外切活性刪除掉的DNA片斷上原有的核苷酸，因此叫做取代合成。

第93頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

外切酶活性

聚合酶活性

無(wú)dNTPdNTP第94頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一取代合成法優(yōu)于缺口轉(zhuǎn)移法：

（1

）、不會(huì)出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)而缺口轉(zhuǎn)移制備的探針會(huì)出現(xiàn)這種結(jié)構(gòu)；（2）、應(yīng)用適宜的核酸內(nèi)切限制酶切割，便可很容易的變成特定序列的探針。第95頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一具EcoR1位點(diǎn)的DNA分子對(duì)DNA分子3‘端有控制的降解合成作用產(chǎn)生選擇性標(biāo)記T4DNA聚合酶的取代合成法標(biāo)記DNA斷末端及制備鏈的特異探針第96頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一４、反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）

這類酶來(lái)自于反轉(zhuǎn)錄病毒，它可以RNA為模板，催化合成DNA。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反轉(zhuǎn)錄酶兩種。

具有反轉(zhuǎn)錄酶活性和RNaseH活性。主要作用是以mRNA為模板合成cDNA；用來(lái)對(duì)5’突出末端的DNA片斷作末端標(biāo)記。第97頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第98頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第99頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

合成cDNA的主要步驟：（1

）、應(yīng)用poly(A)mRNA為模板，以12～18個(gè)堿基長(zhǎng)的oligo(dT)片斷作為引物，加入反轉(zhuǎn)錄酶，合成出cDNA第一鏈;（2）、用堿水解法除去mRNA模板，單鏈cDNA能自我折疊形成一種發(fā)夾結(jié)構(gòu)，作第二鏈的引物，用反轉(zhuǎn)錄酶或Klenow聚合酶催化第二鏈cDNA的合成；（3）、用SＩ核酸內(nèi)切酶消化除去單鏈區(qū)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。（4）、通過(guò)同聚物或合成的銜接物，使DNA分子克隆到適當(dāng)?shù)妮d體分子上。第100頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第101頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一5.T7DNA聚合酶：

1978年，S.Tabor從感染了T7噬菌體的大腸桿菌寄主細(xì)胞中純化出來(lái)的一種核酸酶。具有5’3’的聚合酶活性和很高的單鏈及雙鏈的3’5’核酸外切酶活性。第102頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

T7DNA聚合酶的用途：（1）、用于對(duì)大分子量模板的延伸合成；（不受DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，聚合能力較強(qiáng)可延伸合成數(shù)千個(gè)核苷酸）（2）、通過(guò)延伸或取代合成法標(biāo)記DNA3’末端（3）、將雙鏈DNA的5’或3’突出末端轉(zhuǎn)變成平末端的結(jié)構(gòu)。第103頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一6.修飾的T7DNA聚合酶對(duì)天然的T7DNA聚合酶進(jìn)行修飾，使之完全失去3’5’的外切酶活性。聚合作用的速率增加了3倍。第104頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

用途：（1）、作為一種DNA序列分析的工具酶：加工性能高；無(wú)3’5’的外切酶活性；具有催化脫氧核糖類似物聚合的能力。（2）、制備探針；可催化較低水平的dNTP

（<0.1μmol/L）參入。（3）、有效的填補(bǔ)和標(biāo)記具有5’突出末端的DNA片斷的3’-末端。聚合作用高；失去了3’5’的外切酶活性第105頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一4．其他酶第106頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1、末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaltransferase）該酶全稱為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase），它是從小牛胸腺中純化出來(lái)的一種小分子量的堿性蛋白質(zhì)，在二甲胂酸緩沖液中，能催化5’脫氧核苷三磷酸進(jìn)行5’－3’方向的聚合作用，逐個(gè)地將脫氧核苷酸分子加到線性DNA分子的3’-OH末端。

第107頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

它不需要模板，可以用含有的3’-OHDNA片段為引物，在3’-OH端加入核苷酸達(dá)幾百個(gè)它作用的底物可以是具有3’-OH末端的單鏈DNA,也可以是具有3’-OH突出末端的雙鏈DNA第108頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第109頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第110頁(yè)，共119頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

用途：

1.催化[α-