顯微鏡分辨率：概念、因素和計算

顯微鏡分辨率：概念、因素和計算在顯微鏡學(xué)中，‘分辨率’一詞用于闡述顯微鏡對細節(jié)進行區(qū)分的能力。換言之，這是樣本內(nèi)兩個能被觀察人員或者顯微鏡攝像頭區(qū)分的實體點之間的理想的距離。顯微鏡的分辨率本質(zhì)上與光學(xué)元件的數(shù)值孔徑（NA）以及用于觀察樣本標本的光波長有關(guān)。此外，我們必須考慮ErnstAbbe于1873年首次提出的衍射極限。本文章包含了這些概念的歷史介紹并使用相對簡單的術(shù)語對其進行了解釋。分辨率與數(shù)值孔徑數(shù)值孔徑（NA）與光通過的介質(zhì)的折射率（n）以及給定物鏡的孔徑角（α）有關(guān)（NA=n×sinα）。顯微鏡的分辨率不僅取決于物鏡的NA，還取決于整個系統(tǒng)的NA，要把顯微鏡聚光鏡的NA也納入考慮。在顯微鏡系統(tǒng)中，所有光學(xué)元件都正確對齊、具有相對較高的NA值并且相互協(xié)調(diào)工作，可以分辨出更多的圖像細節(jié)。分辨率還與標本成像所用的光波長有關(guān)；波長越短，可分辨的細節(jié)越多，波長越長則分辨細節(jié)越少。在處理分辨率時需要考慮三個數(shù)學(xué)概念：‘阿貝衍射極限’、‘艾里斑’和‘瑞利判據(jù)’。以下按時間順序逐一介紹。GeorgeBiddellAiry與‘艾里斑’（1835）GeorgeBiddellAiry（1801-1892）是英國數(shù)學(xué)家和天文學(xué)家。1826年，25歲的他被任命為三一學(xué)院的數(shù)學(xué)教授，兩年后，被任命為新劍橋天文臺的天文學(xué)教授。1835年到1881年期間，他是“皇家天文學(xué)家”，月球和火星上各有一處以他的名字命名的隕石坑。1835年，他在劍橋哲學(xué)學(xué)會學(xué)報上發(fā)表了一篇題為《有關(guān)圓孔徑物鏡的衍射》的論文。Airy在論文中以一個天文學(xué)家的視角描述了通過一個精良的望遠鏡觀察到的恒星周圍的光環(huán)或者射線的形狀及亮度。盡管是從不同的科學(xué)領(lǐng)域發(fā)表的文章，但這些觀察結(jié)果與其他光學(xué)系統(tǒng)，特別是顯微鏡存在著關(guān)聯(lián)。艾里斑(AiryDisc)是在衍射限制的系統(tǒng)中由圓形孔徑形成的聚焦的光點。如圖1所示，其呈現(xiàn)為中央亮點和周圍是明暗相間的同心環(huán)（更準確地說，這是艾里圖案Airypattern）。衍射圖案由光的波長和光所通過的孔徑大小決定。艾里斑的中心點含有大約84%的光強，其余16%分布于環(huán)繞該點的衍射圖案中。當然，用顯微鏡進行觀察時標本上會有許多光點，因此基于大量的艾里圖案來考慮，而非如“艾里斑”描述的單個光點來考慮是更妥當?shù)姆绞?。圖1右所示的艾里圖案三維表示又稱為‘點擴散函數(shù)’。圖1：艾里圖案，或稱艾里斑的典型現(xiàn)象，由其中心的理想的光點和環(huán)繞的衍射環(huán)組成。ErnstAbbe與‘Abbe衍射極限’（1873）ErnstKarlAbbe（1840-1905）是一位德國數(shù)學(xué)家和物理學(xué)家。他與CarlZeiss共同創(chuàng)立了“蔡司光學(xué)工作室”即現(xiàn)在的蔡司公司。除此之外，他還在1884年聯(lián)合創(chuàng)辦了SchottGlassworks。Abbe還是定義數(shù)值孔徑這一術(shù)語的首位學(xué)者。1873年，Abbe發(fā)表了自己的理論和公式對顯微鏡的衍射極限進行了解釋。Abbe發(fā)現(xiàn)，標本圖像由許多重疊的、多強度且存在衍射極限的點（或艾里斑）所組成。要提高分辨率（d=λ/2NA），標本必須使用波長（λ）更短的光來進行觀察，或者通過折射率相對高的成像介質(zhì)來進行觀察，又或者使用NA較高的光學(xué)組件來進行觀察（或者將全部3種因素組合起來）。但即便將所有這些因素都考慮在內(nèi)，顯微鏡系統(tǒng)的極限依然受到限制，因為系統(tǒng)復(fù)雜性，波長低于400nm的光在玻璃中的傳播特征，以及整套顯微鏡需要達到較高的NA。理想光學(xué)顯微鏡的橫向分辨率限制在200nm左右，而軸向分辨率約為500nm（有關(guān)分辨率極限示例，請參見下文）。JohnWilliamStrutt與‘瑞利判據(jù)’（1896）第三代瑞利男爵JohnWilliamStrutt（1842-1919）是一名英國物理學(xué)家，也是一位高產(chǎn)學(xué)者。他一生編寫了多達466篇論文，包括430篇科研論文。他的論文涉獵極廣，各種主題都有，如鳥類飛行、心理研究、聲學(xué)等等。1895年，他發(fā)現(xiàn)了氬并憑借這一發(fā)現(xiàn)于1904年獲得諾貝爾獎。Rayleigh以GeorgeAiry的理論為基礎(chǔ)上并進一步延伸，于1896年創(chuàng)造了“瑞利判據(jù)”理論(RayleighCriterion)。瑞利判據(jù)（圖2）在衍射極限系統(tǒng)當中定義了分辨率極限，換言之，就是何時能夠?qū)?個光點相互區(qū)分或分辨。使用艾里斑理論，如果2個單獨艾里斑的衍射圖案不重疊，則就可以輕松區(qū)分、‘分辨’兩者并認定滿足瑞利判據(jù)（圖2，左圖）。而當艾里斑的中心直接重疊于另一個艾里斑的第一理想的衍射圖案時，則兩者認定為‘剛好分辨’，同時依然可以區(qū)分為2個獨立的光點（圖2，中圖）。如果艾里斑再繼續(xù)相互接近，則兩者無法滿足瑞利判據(jù)，因此“無法被分辨”為2個不同的光點（或者標本圖像中的單獨細節(jié)；圖2，右圖）。圖2：分辨率極限（按瑞利判據(jù)來定義），兩個單獨艾里斑的重疊衍射圖案：左圖：分辨良好；中圖：剛好分辨；右圖：未分辨如何計算顯微鏡的分辨率將以上全部理論都考慮在內(nèi)就可以明顯看出，在計算分辨率的理論極限時需要考慮很多因素。分辨率還取決于樣本性質(zhì)。我們來看一下使用阿貝衍射極限以及使用瑞利判據(jù)進行的分辨率計算。首先應(yīng)當要牢記：NA=nxsinα式中n為成像介質(zhì)的折射率，α是物鏡孔徑角的一半。物鏡的理想的孔徑角大約為144o。該角度一半的正弦為0.95。如果使用油浸物鏡且折射率為1.52，則物鏡的理想的NA為1.45。如果使用‘干式’（無浸沒）物鏡，則物鏡理想的NA為0.95（因為空氣的折射率為1.0）。橫向（即XY）分辨率的阿貝衍射公式為：d=λ/2NA式中λ是標本成像所用的光波長。如果使用514nm的綠光及NA為1.45的油浸物鏡，則分辨率的（理論）極限將達到177nm。軸向（即Z）分辨率的阿貝衍射公式為：d=2λ/NA2同樣的，如果我們假設(shè)通過波長514nm的光來觀察標本且物鏡NA數(shù)值為1.45，則軸向分辨率為488nm。在阿貝衍射極限的基礎(chǔ)上，瑞利判據(jù)稍稍得到了細化：R=1.22λ/NAobj+NAcond式中λ為標本成像用的光波長。NAobj為物鏡NA。NAcond為聚光鏡NA?！?.22’是一個常系數(shù)。該數(shù)值根據(jù)Rayleigh的貝塞爾函數(shù)研究推導(dǎo)得出。這些主要用于對系統(tǒng)當中的問題，例如波的傳遞，進行計算。將聚光鏡的NA考慮在內(nèi)，空氣（折射率為1.0）通常是聚光鏡和玻片之前的成像介質(zhì)。假設(shè)聚光鏡的孔徑角為144o，則NAcond數(shù)值將等于0.95。如果使用514nm的綠光，油浸物鏡的NA為1.45，聚光鏡的NA為0.95，則分辨率的（理論）極限將達到261nm。如上所述，用于對標本成像的光波長越短，可以分辨的細節(jié)越多。因此如