蛋白質(zhì)化學(xué)-課件

第一章蛋白質(zhì)化學(xué)

蛋白質(zhì)的生物學(xué)意義蛋白質(zhì)的元素組成蛋白質(zhì)的氨基酸組成肽蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)的分類(lèi)蛋白質(zhì)是由許多不同的α-氨基酸按一定的序列通過(guò)酰胺鍵（肽鍵）縮合而成的，具有較穩(wěn)定的構(gòu)象并具有一定生物功能的大分子。蛋白質(zhì)的生物學(xué)意義1.生物體的組成成分-結(jié)構(gòu)蛋白,膠原蛋白2.酶-生物催化劑3.運(yùn)輸-血紅蛋白,肌紅蛋白4.運(yùn)動(dòng)-肌球蛋白,肌動(dòng)蛋白5.抗體-免疫球蛋白6.干擾素7.遺傳信息的控制8.細(xì)胞膜的通透性9.高等動(dòng)物的記憶、識(shí)別機(jī)構(gòu)第二節(jié)、蛋白質(zhì)的氨基酸組成氨基酸

是蛋白質(zhì)的基本組成單位。從細(xì)菌到人類(lèi)，所有蛋白質(zhì)都由20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸（20standardaminoacids)組成。（一）氨基酸的結(jié)構(gòu)通式（組成蛋白質(zhì)的20種）：19種氨基酸具有一級(jí)氨基（-NH3+）和羧基（-COOH）結(jié)合到α碳原子（Cα），同時(shí)結(jié)合到（Cα）上的是H原子和各種側(cè)鏈（R基）；另一個(gè)氨基酸Pro具有二級(jí)氨基（α-亞氨基酸）不帶電形式

H2N—Cα—HCOOHR+H3N—Cα—HCOO-R兩性離子形式Cα如是不對(duì)稱(chēng)C（除Gly），則：具有兩種立體異構(gòu)體[D-型和L-型]2.具有旋光性[左旋（-）或右旋（+）]（二）氨基酸的分類(lèi)(蛋白質(zhì)氨基酸-20種)根據(jù)R的化學(xué)結(jié)構(gòu)（1）脂肪族氨基酸：

1）疏水性：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys；

2）極性：Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln、Ser、Thr（2）芳香族氨基酸：Phe、Tyr（3）雜環(huán)氨基酸：Trp、His（4）雜環(huán)亞氨基酸：Pro中性氨基酸氨基酸的結(jié)構(gòu)、代號(hào):根據(jù)營(yíng)養(yǎng)分類(lèi)必需氨基酸：LeuTrpMetLysValIlePheThr半必需：HisArg非必需氨基酸：

兩三家來(lái)寫(xiě)一本書(shū)非蛋白質(zhì)氨基酸：鳥(niǎo)氨酸瓜氨酸除了常見(jiàn)的20種氨基酸蛋白質(zhì)中還含有一些稀有氨基酸，大多數(shù)是常見(jiàn)氨基酸的衍生物。如5-羥賴(lài)氨酸；4-羥脯氨酸；6-N-甲基賴(lài)氨酸；γ-氨基谷氨酸等。硒代半胱氨酸

不常見(jiàn)蛋白質(zhì)氨基酸（三）氨基酸的構(gòu)型、旋光性和光吸收

構(gòu)型：組成蛋白質(zhì)的氨基酸除Gly以外都有手性碳原子，在三維空間上就有兩種不同的排列方式，它們互為鏡影，這兩種不同的構(gòu)型分別稱(chēng)為D-型和L-型。

旋光性：

組成蛋白質(zhì)的氨基酸除Gly以外，都有手性碳原子，

所以都有旋光性。能使偏振光的偏振面的向左或向右旋轉(zhuǎn)，向左旋轉(zhuǎn)的稱(chēng)左旋，用“一”號(hào)表示，向右旋轉(zhuǎn)的稱(chēng)右旋，用“＋”號(hào)表示。

光吸收：

λ=210nm,所有氨基酸都有吸收峰λ=278nm,色氨酸有最大吸收峰（Trp）λ=274.5nm,酪氨酸有最大吸收峰（Tyr）λ=260.0nm,苯丙氨酸有最大吸收峰（Phe）組成蛋白質(zhì)的氨基酸中，Trp、Tyr和Phe對(duì)紫外光有一定的吸收，這是因?yàn)樗鼈兎肿又泻斜江h(huán)，是苯環(huán)的共軛雙鍵造成的（四）氨基酸的重要理化性質(zhì)一般物理性質(zhì)無(wú)色晶體，熔點(diǎn)極高（200℃以上），不同味道；水中溶解度差別較大（極性和非極性），不溶于有機(jī)溶劑。所以可以用乙醇析出氨基酸沉淀。有不同的味感,有的無(wú)味,有的味甜(甘氨酸,胱氨酸)有的味苦,有的味鮮(谷氨酸)。

光吸收性質(zhì):Tyr,Phe,Trp在紫外區(qū)有光吸收.

蛋白質(zhì)280nm有光吸收紫外檢測(cè)。兩性解離和等電點(diǎn)氨基酸在水溶液中或在晶體狀態(tài)時(shí)都以離子形式存在，在同一個(gè)氨基酸分子上帶有能放出質(zhì)子的—NH3+正離子和能接受質(zhì)子的—COO-負(fù)離子，為兩性電解質(zhì)。氨基酸等電點(diǎn)的確定(以甘氨酸為例)根據(jù)pK值（該基團(tuán)在此pH一半解離）計(jì)算：等電點(diǎn)等于兩性離子兩側(cè)pK值的算術(shù)平均數(shù)。pH=（pK1+pK2）/2pI=（pK1+pK2）/2谷氨酸組氨酸酸性氨基酸，以Asp為例：等電點(diǎn)等于兩個(gè)酸性解離基團(tuán)的pK值的算術(shù)平均數(shù)。堿性氨基酸，以L(fǎng)ys為例：等電點(diǎn)等于兩個(gè)堿性解離基團(tuán)的pK值的算術(shù)平均數(shù)。3.化學(xué)性質(zhì)（1）與茚三酮的反應(yīng)：Pro產(chǎn)生黃色物質(zhì)，其它為藍(lán)紫色。在570nm（藍(lán)紫色）或440nm（黃色）定量測(cè)定（幾μg）。用于對(duì)氨基酸的定性和定量（2）與2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反應(yīng)—sanger反應(yīng)NO2FO2N+HN—CH—COOHRNO2O2NHN—CH—COOHR+HF弱堿性DNP-氨基酸(黃色)測(cè)定氨基酸或肽,蛋白質(zhì)中游離的氨基(α-氨基,ε-氨基)（3）與苯異硫氰酸（酯）的反應(yīng)(Edman反應(yīng))PITCPTC-氨基酸PTH-氨基酸pH8.3重復(fù)測(cè)定多肽鏈N端氨基酸排列順序，設(shè)計(jì)出“多肽順序自動(dòng)分析儀”1．離子交換層析法

原理：分離氨基酸時(shí)，用離子交換樹(shù)脂作為支持物，利用離子交換樹(shù)脂上的活性基團(tuán)與溶液中的離子進(jìn)行交換反應(yīng)，由于各種離子交換能力不同，與樹(shù)脂結(jié)合的牢固程度就不同，在洗脫過(guò)程中，各種離子以不同的速度移動(dòng)，從而達(dá)到分離的目的。

這種分離主要與各種離子所帶電荷有關(guān)，在電荷相同時(shí)，與極性，非極性有關(guān)。五氨基酸的分離分析離子交換樹(shù)脂：化學(xué)本質(zhì)：是一種人工合成的聚苯乙烯一苯二乙烯組成的具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子聚合物。

基質(zhì)是由帶有電荷的樹(shù)脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱(chēng)之陰離子交換樹(shù)脂；帶有負(fù)電荷的稱(chēng)之陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。例題：利用陽(yáng)離子交換層析分離下列每一對(duì)氨基酸，哪一種氨基酸首先被pH7緩沖液從離子交換柱上洗脫出來(lái)。（a）Asp和Lys（b）Arg和Met（c）Glu和Val

答：（a）Asp（b）Met（c）Glu

第四節(jié)肽（peptide）

（一）肽的結(jié)構(gòu)和命名

肽是由兩個(gè)或兩個(gè)以上的氨基酸通過(guò)肽鍵連接而形成的化合物。Peptidebond二肽三肽四肽低于10稱(chēng)寡肽（oligopeptide）多肽（Polypeptide）氨基酸之間通過(guò)肽鍵連接形成的鏈稱(chēng)肽鏈。N端氨基酸殘基氨基酸殘基C端肽鏈書(shū)寫(xiě)方式：N端→C端用“-”表示肽鍵肽鏈有鏈狀、環(huán)狀和分支狀。

左右命名：根據(jù)氨基酸組成，由N端→C端命名丙氨酰甘氨酰亮氨酸

Ala－Gly－Leu(orAla?Gly?Leu)（1）谷光甘肽（GSH）H2N-CHCH2CH2CO—COOHγ-GluNHCHCO—CH2SHCys2GSHGSSG（2）催產(chǎn)素和升壓素

均為9肽，第3位和第9位氨基酸不同。催產(chǎn)素使子宮和乳腺平滑肌收縮，具有催產(chǎn)和促使乳腺排乳作用。升壓素促進(jìn)血管平滑肌收縮，升高血壓，減少排尿。NHCH2COOHGly由于肽中N端自由氨基和C端自由羧基之間的距離比氨基酸中的大，因此它們之間的靜電引力較弱。肽與氨基酸一樣具有酸、堿性質(zhì)，它的解離主要取決于肽鏈的末端氨基、末端羧基和側(cè)鏈R基。1．兩性解離與等電點(diǎn)（二）肽的理化性質(zhì)

肽的等電點(diǎn)定義：肽所帶凈電荷為“零”時(shí)，溶液的pH值。

例：已知末端α-COOH，pK3.6，末端α-NH3+pK8.0ε-NH+3pK10.6。計(jì)算Ala-Ala-Lys-Ala的等電點(diǎn)。pI=(8.0＋10.6)/2=9.3pI=1/2(8.0+10.6)=9.3今有一四肽甘氨酰谷氨酰賴(lài)氨酰丙氨酸,其pKα-COOH=3.7,pKα-NH2=7.8,pK側(cè)鏈COOH=4.6,pK側(cè)鏈NH2=10.2求該四肽的等電點(diǎn)?作業(yè):2．肽的化學(xué)性質(zhì)肽的化學(xué)性質(zhì)與氨基酸相似，如兩性解離、等電點(diǎn)等，但肽有與氨基酸不同的特殊反應(yīng).（1）雙縮脲反應(yīng)雙縮脲＋堿性CuSO4溶液紫色蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)：是指蛋白質(zhì)分子中所有原子在三維空間中的排布蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)層次一級(jí)結(jié)構(gòu)PrimaryStructure二級(jí)結(jié)構(gòu)SecondaryStructure超二級(jí)結(jié)構(gòu)SupersecondaryStructure結(jié)構(gòu)域Domain三級(jí)結(jié)構(gòu)TertiaryStructure四級(jí)結(jié)構(gòu)QuarternaryStructure第五節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)又稱(chēng)初級(jí)結(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、四級(jí)結(jié)構(gòu)的三度空間排列稱(chēng)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)/高級(jí)結(jié)構(gòu)/三維結(jié)構(gòu)或構(gòu)象。（一）蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)（化學(xué)結(jié)構(gòu)）1、

定義:就是蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的排列順序，即氨基酸的線(xiàn)性序列。一級(jí)結(jié)構(gòu)中包含的共價(jià)鍵（covalentbonds）：

肽鍵（peptidebond）二硫鍵（disulfidebond）HPhe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr–Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-AlaOHB鏈15710151920212530HGly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-AsnOH15102015A鏈711621SSSS牛胰島素的化學(xué)結(jié)構(gòu)—S————S——原則：將大化小，逐段分析，制成兩套肽片段，找出重疊位點(diǎn)，排出肽的前后位置，最后確定蛋白質(zhì)的完整序列。2、關(guān)于蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)序列的測(cè)定問(wèn)題序列測(cè)定前的準(zhǔn)備工作：樣品的純度相對(duì)分子質(zhì)量肽鏈的數(shù)目氨基酸組成一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定主要用小片段重疊的原理（1）末端分析：包括N端分析，C端分析（2）肽鏈的拆開(kāi)和分離（3）肽鏈的部分水解（4）肽段的分離和氨基酸序列測(cè)定（5）找重疊肽從而推斷整個(gè)肽鏈的氨基酸序列

（1）末端分析：包括N端分析，C端分析1)二硝基氟苯法（DNFB法或FDNB法）2)苯異硫氰酸(酯)法（PITC法/Edman降解法）

3)氨肽酶（aminopeptidase,Apase）法識(shí)別氨基端，并從氨基端開(kāi)始逐個(gè)水解N端分析N端氨基封閉的幾種情況1.焦谷氨酰環(huán)化-焦谷氨酸氨肽酶2.乙?；?.環(huán)狀肽C端分析

2)肼解法：也稱(chēng)聯(lián)氨法

1)羧肽酶（carboxypeptidase,Cpase）法

（2）肽鏈的拆開(kāi)和分離共價(jià)鍵(二硫鍵)非共價(jià)鍵-用變性劑來(lái)破壞非共價(jià)鍵,如8mol/L的尿素或6mol/L的鹽酸胍

過(guò)氧甲酸巰基化合物（3）肽鏈的部分水解化學(xué)方法－－溴化氰（CNBr）裂解法:甲硫氨酸酶解方法氨基酸序列測(cè)定:Edman降解法酶解法用測(cè)定核酸的順序來(lái)反推蛋白質(zhì)的順序是當(dāng)前很有發(fā)展前途的一種方法.（5）找重疊肽從而推斷整個(gè)肽鏈的氨基酸序列例子:氨基末端H羧基末端S第二套肽段SEOWTOUVERLAPSHO第一套肽段OUSPSEOVERLAHOWTHOWTOUSEOVERLAPSHOWTOUSEOVERLAPS二硫鍵位置的確定對(duì)角線(xiàn)電泳法

近年來(lái)由于DNA序列的測(cè)定發(fā)展很快，可將相應(yīng)于蛋白質(zhì)的DNA序列測(cè)定出來(lái)后，推出蛋白質(zhì)的序列，為蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定帶來(lái)了新的曙光。一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定展望HPhe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr–Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-AlaOHB鏈15710151920212530HGly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-AsnOH15102015A鏈711621SSSS牛胰島素的化學(xué)結(jié)構(gòu)—S————S——（二）蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)（構(gòu)象、高級(jí)結(jié)構(gòu)）

指:蛋白質(zhì)分子中所有原子在三維空間的排列分布和肽鏈的走向。構(gòu)型---在立體異構(gòu)體中，取代原子或基團(tuán)在空間的取向構(gòu)象當(dāng)單鏈旋轉(zhuǎn)時(shí)，分子中的基團(tuán)或原子可能形成不同的空間排布，這些不同的空間排列稱(chēng)為不同的構(gòu)象。

早在20世紀(jì)30年代，Pauling和Corey就開(kāi)始有X-射線(xiàn)衍射方法研究了氨基酸和肽的結(jié)構(gòu)，他們得到了重要的結(jié)論:(1)肽鍵的鍵長(zhǎng)介于C-N單鍵和雙鍵之間，具有部分雙鍵的性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。(2)肽鍵中的四個(gè)原子和它相鄰的兩個(gè)α-碳原子處于同一平面，形成了酰胺平面，也稱(chēng)肽(鍵)平面。(3)在酰胺平面中C=0與N-H呈反式。Cα—C—N—CαOH—CN—O-H+CαCα多肽鏈的主鏈由許多酰胺平面組成，平面之間以α碳原子相隔。而Cα-C鍵和Cα-N鍵是單鍵，可以自由旋轉(zhuǎn)，其中Cα-C鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱(chēng)ψ，Cα-N鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱(chēng)φ。ψ和φ這一對(duì)兩面角決定了相鄰兩個(gè)酰胺平面的相對(duì)位置，也就決定了肽鏈的構(gòu)象。1.蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)——指蛋白質(zhì)多肽鏈本身的折疊和盤(pán)繞方式，不涉及側(cè)鏈和整個(gè)肽鏈空間排列。（1）α-螺旋（α-helix）1）螺旋的每圈有3.6個(gè)氨基酸，螺旋間距離為0.54nm，每個(gè)殘基沿軸旋轉(zhuǎn)100°。每個(gè)氨基酸殘基沿軸上升0.15nm，螺旋上升時(shí)，每個(gè)殘基沿軸旋轉(zhuǎn)100o。2）每個(gè)肽鍵的羰基氧與遠(yuǎn)在第四個(gè)氨基酸氨基上的氫形成氫鍵（hydrogenbond），氫鍵的走向平行于螺旋軸，所有肽鍵都能參與鏈內(nèi)氫鍵的形成。3)α-螺旋有右手螺旋和左手螺旋之分，天然蛋白質(zhì)絕大部分是右手螺旋，到目前為止僅在嗜熱菌蛋白酶中發(fā)現(xiàn)了一段左手螺旋。

4)R側(cè)鏈基團(tuán)伸向螺旋的外側(cè)。RRRRRRRRR螺旋的橫截面影響α-螺旋的穩(wěn)定性的因素在多肽鏈中連續(xù)的出現(xiàn)帶同種電荷的極性氨基酸，α-螺旋就不穩(wěn)定?！?/p>

在多肽鏈中只要出現(xiàn)pro，α-螺旋就被中斷，產(chǎn)生一個(gè)彎曲（bend）或結(jié)節(jié)（kink）?！?/p>

Gly的R基太小，難以形成α-螺旋所需的兩面角，所以和Pro一樣也是螺旋的最大破壞者?！?/p>

肽鏈中連續(xù)出現(xiàn)帶龐大側(cè)鏈的氨基酸如Ile，由于空間位阻，也難以形成α-螺旋。●

(2)β-折疊（β-pleatedsheet）也是pauling等人提出來(lái)的，它是與α-螺旋完全不同的一種結(jié)構(gòu)。①β-折疊主鏈骨架以一定的折疊形式形成一個(gè)折疊的片層。②在兩條相鄰的肽鏈之間形成氫鏈。β-折疊片中，相鄰多肽鏈平行或反平行（較穩(wěn)定）。NNCNNCCC平行反平行（3）β-轉(zhuǎn)角（β-turn）為了緊緊折疊成緊密的球蛋白，多肽鏈常常反轉(zhuǎn)方向，成發(fā)夾形狀。一個(gè)氨基酸的羰基氧以氫鍵結(jié)合到相距的第四個(gè)氨基酸的氨基氫上。N—1CH—CC2CHN—HO=C3CHNC—4CH—NRRHOHRROHOβ-轉(zhuǎn)角經(jīng)常出現(xiàn)在連接反平行β-折疊片的端頭。（4）無(wú)規(guī)卷曲沒(méi)有一定規(guī)律的松散肽鏈結(jié)構(gòu)。酶的活性部位。2.超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域超二級(jí)結(jié)構(gòu)是指若干相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)中的構(gòu)象單元彼此相互作用，形成有規(guī)則的，在空間上能辨認(rèn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組合體。是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)至三級(jí)結(jié)構(gòu)層次的一種過(guò)渡態(tài)構(gòu)象層次。已知的超二級(jí)結(jié)構(gòu)主要有αα,βxβ,β-曲折和β-折疊筒等。

αα：是兩個(gè)α-螺旋互相纏繞，形成一個(gè)左手超螺旋。ββββcββαββαβαβ

結(jié)構(gòu)域是球狀蛋白質(zhì)的折疊單位。多肽鏈在超二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步繞曲折疊成緊密的近似球行的結(jié)構(gòu)，具有部分生物功能。

對(duì)于較大的蛋白質(zhì)分子或亞基，多肽鏈往往由兩個(gè)以上結(jié)構(gòu)域締合而成三級(jí)結(jié)構(gòu)。

有時(shí)也稱(chēng)功能域，功能域是指有功能的部分。功能域可以是一個(gè)結(jié)構(gòu)域，也可以是兩個(gè)或兩個(gè)以上的結(jié)構(gòu)域組成。

對(duì)那些較小的蛋白質(zhì)分子來(lái)說(shuō)，結(jié)構(gòu)域和三級(jí)結(jié)構(gòu)往往是一個(gè)意思，也就是說(shuō)是單結(jié)構(gòu)域的。一般來(lái)說(shuō)，大的蛋白質(zhì)分子可以由2個(gè)或更多個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。3.蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)——涉及到多肽鏈上的所有原子（包括主鏈和側(cè)鏈）在三維空間的分布。

定義:蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)是指在二級(jí)結(jié)構(gòu)，超二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上，多肽鏈再進(jìn)一步折疊盤(pán)繞成更復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，三級(jí)結(jié)構(gòu)主要靠非共價(jià)鍵來(lái)維持。下面以鯨肌紅蛋白為例，說(shuō)明蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，1963年Kendrew等通過(guò)鯨肌紅蛋白的x-射線(xiàn)衍射分析，測(cè)得了它的空間結(jié)構(gòu)。肌紅蛋白是由一條多肽鏈折疊盤(pán)繞成近似球狀的構(gòu)象。(2)主鏈的80%左右是右手螺旋，其余為無(wú)規(guī)卷曲，一條多肽鏈共有8個(gè)螺旋區(qū)（A、B、C、D、E、F、G、H），7個(gè)非螺旋區(qū)（二個(gè)在末端，中間有五個(gè)）。(3)氨基酸殘基的親水基團(tuán)幾乎全部分布在分子的表面，而疏水基團(tuán)幾乎全部在分子的內(nèi)部。(4)血紅素輔基垂直地伸出分子表面，通過(guò)一個(gè)His殘基和分子內(nèi)部相連。

它對(duì)肌紅蛋白的生物活性是必需的（與O2結(jié)合）。肌紅蛋白是1957年由JohnKendrew用X射線(xiàn)晶體分析法測(cè)定的有三維結(jié)構(gòu)的第一個(gè)蛋白質(zhì)。4.蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)——多個(gè)亞基（subunit）的空間排布和相互作用。亞基間以非共價(jià)鍵連接。

四級(jí)結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)的亞基聚合成大分子蛋白質(zhì)的方式（亞基是指一條多肽鏈或以共價(jià)鏈連接在一起的幾條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子的最小共價(jià)結(jié)構(gòu)單位）。血紅蛋白（hemoglobin）是由四個(gè)亞基組成，2個(gè)α-亞基，2個(gè)β-亞基，每個(gè)亞基由一條多肽鏈與一個(gè)血紅素輔基組成。４個(gè)亞基以正四面體的方式排列，彼此之間以非共價(jià)鍵相連（主要是離子鍵、氫鍵）

。

說(shuō)明:一般來(lái)說(shuō)亞基不具有生物活性，即使有也很小，只有當(dāng)這些亞基聚合成一個(gè)完整的蛋白質(zhì)分子后，才具有生物活性。球狀蛋白質(zhì)的構(gòu)象特點(diǎn)(1)在球狀蛋白質(zhì)分子中,一條多肽鏈往往通過(guò)一部分α-螺旋，一部分β-折疊，一部分β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲等使肽鏈折疊盤(pán)繞成近似球狀的構(gòu)象。(2)球狀蛋白質(zhì)的大多數(shù)極性側(cè)鏈總是暴露在分子表面形成親水面，而大多數(shù)非極性側(cè)鏈總是埋在分子內(nèi)部形成疏水核。(3)球狀蛋白質(zhì)的表面往往有內(nèi)陷的空穴，空穴周?chē)性S多疏水側(cè)鏈，是疏水區(qū)，這空穴往往是酶的活性部位或蛋白質(zhì)的功能部位。纖維狀蛋白質(zhì)的構(gòu)象

（1）角蛋白（keratin）α-角蛋白

纖維狀蛋白質(zhì)角蛋白(keratin)

角蛋白可分為兩類(lèi)，一類(lèi)是α-角蛋白，另一類(lèi)是β-角蛋白。α-角蛋白是角蛋白中的優(yōu)勢(shì)形式。它主要是由α-螺旋構(gòu)象的多肽鏈構(gòu)成的，多肽鏈大體上與角蛋白的長(zhǎng)向平行。一根毛發(fā)大纖維沿軸向排列。毛發(fā)具有高度有序的結(jié)構(gòu)。毛發(fā)性能就決定于α-螺旋結(jié)構(gòu)以及這樣的組織方式。

共價(jià)鍵次級(jí)鍵化學(xué)鍵肽鍵一級(jí)結(jié)構(gòu)氫鍵二硫鍵二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)疏水鍵鹽鍵范德華力三、四級(jí)結(jié)構(gòu)（三）蛋白質(zhì)分子中的共價(jià)鍵與次級(jí)鍵蛋白質(zhì)中的疏水基團(tuán)彼此靠近、聚集以避開(kāi)水的現(xiàn)象稱(chēng)之疏水相互作用（hydrophobic0interaction）或疏水效應(yīng)（hydrophobiceffect）。多肽鏈骨架的羰基和酰胺基之間，特別是在球蛋白內(nèi)部的那些基團(tuán)之間常常形成氫鍵。大多數(shù)氫鍵都是N-H……O類(lèi)型的范德華力包括吸引力和斥力兩種相互作用，范德華力只有當(dāng)兩個(gè)非極性殘基之間處于一定距離時(shí)才能達(dá)到最大。雖然范德華力相對(duì)來(lái)說(shuō)比較弱，但由于范德華力相互作用數(shù)量大，并且具有加和性，因此范德華力對(duì)球蛋白的穩(wěn)定性也有貢獻(xiàn)。帶有相反電荷的側(cè)鏈之間的離子相互作用也能幫助穩(wěn)定球蛋白，雖然這種作用很弱。a離子鍵b氫鍵c疏水鍵d范德華引力六、蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)分子具有多樣的生物學(xué)功能，需要一定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，還需要一定的空間構(gòu)象。（一）蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系1.種屬差異

蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異十分明顯，但相同部分氨基酸對(duì)蛋白質(zhì)的功能起決定作用。根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上的差異，可以斷定它們?cè)谟H緣關(guān)系上的遠(yuǎn)近。2.分子病——蛋白質(zhì)分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸排列順序與正常有所不同的遺傳病。從患者紅細(xì)胞中鑒定出特異的鐮刀型或月牙型細(xì)胞。鐮刀狀細(xì)胞貧血（sick-cellanemia）患者與正常人的血象比較1954年IngramV等人 指紋圖譜（fingerprint）水平為電泳,垂直為層析鐮刀狀細(xì)胞貧血（sick-cellanemia）β-鏈1234567Hb-AVal-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys…Hb-SVal-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys…Val取代Glu含氧-HbAO2O2粘性疏水斑點(diǎn)含氧HbS脫氧HbS疏水位點(diǎn)血紅蛋白分子凝集（二）蛋白質(zhì)構(gòu)象與功能的關(guān)系別（變）構(gòu)作用：含多亞基的蛋白質(zhì)由于一個(gè)亞基的構(gòu)象改變而引起其余亞基和整個(gè)分子構(gòu)象、性質(zhì)和功能發(fā)生改變的作用。因別構(gòu)而產(chǎn)生的效應(yīng)稱(chēng)別構(gòu)效應(yīng)。以血紅蛋白（Hb)的結(jié)構(gòu)與功能為例α、β鏈的三級(jí)結(jié)構(gòu)與肌紅蛋白的很相似，Hb接近于球體，4個(gè)亞基分別在四面體的四個(gè)角上，每個(gè)亞基上有一個(gè)血紅素輔基。成人：HbA：α2β298%HbA2：α2δ22%胎兒：HbF：α2γ21.血紅蛋白的結(jié)構(gòu)亞基與亞基之間通過(guò)非共價(jià)鍵締和在一起2.血紅蛋白中血紅素輔基的結(jié)構(gòu)任何亞基吸收氧分子后都會(huì)牽動(dòng)骨架3．血紅蛋白與氧的結(jié)合(氧合曲線(xiàn)/氧解離曲線(xiàn))YPO2四個(gè)亞基之間具有正協(xié)同效應(yīng)，氧合曲線(xiàn)是S型曲線(xiàn)。開(kāi)始，氧的結(jié)合要比肌紅蛋白對(duì)氧的結(jié)合慢（在脫氧血紅蛋白中，亞基之間的連接比較緊密），這種構(gòu)象不利于O2的結(jié)合，而當(dāng)?shù)谝粊喕c氧結(jié)合后，增加了其余亞基對(duì)氧的親和力。反之，當(dāng)氧分壓降低時(shí)，從氧合血紅蛋白失去一個(gè)氧分子，將引起其余的氧分子更易解離，說(shuō)明各亞基間存在一種協(xié)同效應(yīng)。TformRform氧合作用顯著改變Hb的四級(jí)結(jié)構(gòu)，血紅素鐵的微小移動(dòng)導(dǎo)致血紅蛋白構(gòu)象的轉(zhuǎn)換（從T態(tài)→R態(tài)）T態(tài)（tensestate）緊張態(tài) R態(tài)（relaxedstate）松馳態(tài)。血紅素中的二價(jià)鐵原子在與氧結(jié)合的前后，并不發(fā)生價(jià)數(shù)的改變總之，各種蛋白質(zhì)都有特定的空間構(gòu)象，而特定的空間構(gòu)象又與它們特定的生物學(xué)功能相適應(yīng)，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能是高度統(tǒng)一的。七、蛋白質(zhì)的性質(zhì)（一）蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量蛋白質(zhì)相對(duì)分子量在10000~1000000之間。測(cè)定分子量的主要方法有滲透壓法、超離心法、凝膠過(guò)濾法、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。最準(zhǔn)確可靠的方法是超離心法（Svedberg于1940年設(shè)計(jì)）：蛋白質(zhì)顆粒在強(qiáng)大離心力作用下從溶液中沉降下來(lái)。沉降系數(shù)（s）：?jiǎn)挝唬╟m）離心場(chǎng)里的沉降速度。沉降系數(shù)的單位常用S，1S=1×10-13s牛血清清蛋白沉降系數(shù)4.4×10-13s，表示為4.4S。（二）蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點(diǎn)蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)偏酸溶液中帶正電荷，在偏堿溶液中帶負(fù)電荷，在等電點(diǎn)pH時(shí)為兩性離子。電泳：帶電顆粒在電場(chǎng)中移動(dòng)的現(xiàn)象。分子大小不同的蛋白質(zhì)所帶凈電荷密度不同，遷移率即異，在電泳時(shí)可以分開(kāi)。1.自由界面電泳：蛋白質(zhì)溶于緩沖液中進(jìn)行電泳。2.區(qū)帶電泳：將蛋白質(zhì)溶液點(diǎn)在浸了緩沖液的支持物上進(jìn)行電泳，不同組分形成帶狀區(qū)域。（1）凝膠電泳：用凝膠（淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。1）圓盤(pán)電泳：玻璃管中進(jìn)行的凝膠電泳。+—2）平板電泳：鋪有凝膠的玻板上進(jìn)行的電泳。-+（三）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)布郎運(yùn)動(dòng)、丁道爾現(xiàn)象、電泳現(xiàn)象，不能透過(guò)半透膜，具有吸附能力蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定的原因：1）表面形成水膜（水化層）；

2）帶相同電荷。一方面由于蛋白質(zhì)表面的親水基團(tuán)會(huì)吸引它周?chē)乃肿?，使水分子定向排列在它的周?chē)?，形成“水化層”。另一方面由于蛋白質(zhì)在非等電點(diǎn)時(shí)帶有同種電荷，同種電荷相斥，也使蛋白質(zhì)分子保持一定的距離而不會(huì)聚合。（四）蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)1.鹽析：加高濃度中性鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出。2.加有機(jī)溶劑--乙醇、丙酮等，機(jī)理：破壞蛋白質(zhì)的水化膜。3.加重金屬鹽--重金屬鹽加入之后，與帶負(fù)電的羧基結(jié)合。重金屬沉淀蛋白質(zhì)會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性，長(zhǎng)期從事重金屬作業(yè)的人應(yīng)多吃高蛋白食品，以防止重金屬離子被機(jī)體吸收后造成對(duì)機(jī)體的損害。在酸性條件下，蛋白質(zhì)帶正電，可以與生物堿試劑的酸根離子結(jié)合而產(chǎn)生沉淀?！笆潦Y”的產(chǎn)生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有大量的單寧酸，使腸胃中的蛋白質(zhì)凝固變性而成為不能被消化的“柿石”4.加生物堿試劑--單寧酸、苦味酸、鉬酸、鎢酸、三氯乙酸能沉淀生物堿，稱(chēng)生物堿試劑。

5.加熱（五）蛋白質(zhì)的變性定義：天然蛋白質(zhì)受物理或化學(xué)因素的影響，其共價(jià)鍵不變，但分子內(nèi)部原有的高度規(guī)律性的空間排列發(fā)生變化，致使其原有性質(zhì)發(fā)生部分或全部喪失，稱(chēng)為蛋白質(zhì)的變性。（1）生物活性全部或部分喪失（2）一些側(cè)鏈基團(tuán)暴露，可滴定基團(tuán)增加（3）一些物理化學(xué)性質(zhì)的改變（4）生化性質(zhì)的改變變性蛋白質(zhì)的特性

有些蛋白質(zhì)的變性作用是可逆的，其變性如不超過(guò)一定限度，經(jīng)適當(dāng)處理后，可重新變?yōu)樘烊坏鞍踪|(zhì)。－－復(fù)性－－變性的可逆性反應(yīng)名稱(chēng)試劑顏色反應(yīng)有關(guān)基團(tuán)有此反應(yīng)的蛋白質(zhì)或氨基酸雙縮脲反應(yīng)NaOH、CuSO2紫色或粉紅色二個(gè)以上肽鍵所有蛋白質(zhì)米倫反應(yīng)HgNO3、Hg(NO3)2及HNO3混合物紅色

Tyr黃色反應(yīng)濃HNO3及NH3黃色、橘色

Tyr、Phe乙醛酸反應(yīng)(Hopking-Cole反應(yīng))乙醛酸試劑及濃H2SO4紫色

Trp坂口反應(yīng)(Sakaguchi反應(yīng))α-萘酚、NaClO紅色胍基Arg酚試劑反應(yīng)(Folin-Cioculteu反應(yīng))堿性CuSO4及磷鎢酸-鉬酸藍(lán)色酚基、吲哚基Tyr茚三酮反應(yīng)茚三酮藍(lán)色自由氨基及羧基α-氨基酸

（六）蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)—OHN2、超濾法:是最近幾年發(fā)展起來(lái)的一種新技術(shù)，利用分子大小不同，來(lái)分離蛋白質(zhì)。八蛋白質(zhì)的分離純化技術(shù)1、透析:3、等電點(diǎn)沉淀利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小這一特性，可以調(diào)溶液的pH，盡量接近它的等電點(diǎn)，而使蛋白質(zhì)沉淀。4、鹽析法

在蛋白質(zhì)的抽提液中加入一定量的中性鹽，使蛋白質(zhì)沉淀下來(lái)，常用的中性鹽為(NH4)2SO4、NH4Cl等。

5、電泳SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）

SDS（十二烷基硫酸鈉）是一種陰離子去污劑，帶有很多負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)結(jié)合以后，蛋白質(zhì)分子帶有足夠的負(fù)電荷，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷，蛋白質(zhì)分子原有的電荷就變得無(wú)足輕重了。另外,由于SDS的作用，改變了蛋白質(zhì)單體分子的形狀，均成長(zhǎng)橢圓棒狀。所以在電場(chǎng)上移動(dòng)的速度完全取決于蛋白質(zhì)分子的大小。6、離子交換層析

離子交換層析是根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的不同進(jìn)行分離純化。常用的陽(yáng)離子交換劑為羧甲基纖維素（CM-C），陰離子交換劑為二乙氨基乙基纖維素（DEAE-C）。7、凝膠過(guò)濾也稱(chēng)分子排阻層析、分子篩層析，這是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同來(lái)分離純化蛋白質(zhì)的一種方法。葡聚糖凝膠（商品名Sephadex）

聚丙烯酰胺凝膠(商品名Bio-GelP)瓊脂糖凝膠(商品名因生產(chǎn)廠(chǎng)家而不同)常用的凝膠:8、親和層析這是根據(jù)蛋白質(zhì)能與特異的配體相結(jié)合而設(shè)計(jì)的一種方法。蛋白質(zhì)＋配體蛋白質(zhì)配體復(fù)合物這種分離純化方法由于專(zhuān)一性強(qiáng)，理論上可以從復(fù)雜的體系中一步提取所需的物質(zhì)。本章較全面地介紹了蛋白質(zhì)化學(xué)的基本知識(shí)，重點(diǎn)闡述了氨基酸和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能間的依存關(guān)系。在學(xué)習(xí)氨基酸的結(jié)構(gòu)時(shí)應(yīng)聯(lián)系有機(jī)化學(xué)的羧酸結(jié)構(gòu)，在學(xué)習(xí)氨基酸的化學(xué)性質(zhì)時(shí)應(yīng)聯(lián)系氨基酸的結(jié)構(gòu)，再將氨基酸的結(jié)構(gòu)和特性與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和特性聯(lián)系起來(lái)。認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)的重要生物學(xué)意義。提要某種溶液中含有三種三肽：Tyr-Arg-Ser,Glu-Met-Phe和Asp-Pro-Lys,α-COOH基團(tuán)的pKa為3.8;α-NH3基團(tuán)的pKa為8.5。在哪種pH（2.0,6.0或13.0）下，通過(guò)電泳分離這三種多肽的效果最好？答：pH=6.0比pH=2.0或pH=13.0時(shí)電泳能提供更好的分辨率。因?yàn)樵趐H＝6.0的條件下每種肽都帶有不同的凈電荷(+1，-1，和0)，而在pH＝2.0的條件下凈電荷分別為+2，+1和+2，在pH＝13.0的條件下凈電荷分別為-2，-2和-2。下列試劑和酶常用于蛋白質(zhì)化學(xué)的研究中：

CNBr;異硫氰酸苯酯;丹黃酰氯；脲;6mol/LHCl;β-巰基乙醇;水合茚三酮;過(guò)甲酸;胰蛋白酶;胰凝乳蛋白酶。

其中哪一個(gè)最適合完成以下各項(xiàng)任務(wù)？

（a）測(cè)定小肽的氨基酸序列。

（b）鑒定肽的氨基末端殘基。

（c）不含二硫鍵的蛋白質(zhì)的可逆變性。若有二硫鍵存在時(shí)還需加什么試劑？

（d）在芳香族氨基酸殘基羧基側(cè)水解肽鍵。

（e）在蛋氨酸殘基羧基側(cè)水解肽鍵。

（f）在賴(lài)氨酸和精氨酸殘基側(cè)水解肽鍵。答：（a）異硫氰酸苯酯。（b）丹黃酰氯。（c）脲；β-巰基乙醇還原二硫鍵。（d）胰凝乳蛋白酶。（e）CNBr。（f）胰蛋白酶1、在寡聚蛋白質(zhì)中，亞基間的立體排布、相互作用以及接觸部位間的空間結(jié)構(gòu)稱(chēng)之謂()

A、三級(jí)結(jié)構(gòu)

B、締合現(xiàn)象

C、四級(jí)結(jié)構(gòu)

D、變構(gòu)現(xiàn)象2、形成穩(wěn)定的肽鏈空間結(jié)構(gòu)，非常重要的一點(diǎn)是肽鍵中的四個(gè)原子以及和它相鄰的兩個(gè)α-碳原子處于()

A、不斷繞動(dòng)狀