流式細(xì)胞儀的課件資料

流式細(xì)胞儀的課件資料第1頁/共78頁流式細(xì)胞術(shù)發(fā)展史1930年Caspersson和Thorell開始致力于細(xì)胞計(jì)數(shù)的研究1934年Moldaven最早設(shè)想細(xì)胞檢測(cè)自動(dòng)化，用光電儀記錄流過一根毛細(xì)管的細(xì)胞1940年Coons提出結(jié)合熒光素的抗體去標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的特定蛋白1949年WallaceCoulter申請(qǐng)了在懸液中計(jì)數(shù)粒子的方法的專利1950年Caspersson用顯微UV-VIS檢測(cè)細(xì)胞第2頁/共78頁流式細(xì)胞術(shù)發(fā)展史1953年Croslannd-Taylor應(yīng)用分層鞘流原理，成功設(shè)計(jì)紅細(xì)胞光學(xué)自動(dòng)計(jì)數(shù)器1969年VanDilla及其同事在LosAlamos,NM發(fā)明第一臺(tái)熒光檢測(cè)細(xì)胞計(jì)1972年Herzenberg研制出細(xì)胞分選器1975年Kohler等提出單克隆抗體技術(shù)，為細(xì)胞研究提供大量的特異免疫試劑大量廠家不斷生產(chǎn)流式細(xì)胞儀第3頁/共78頁流式細(xì)胞術(shù)發(fā)展史目前國內(nèi)主要流式細(xì)胞儀廠家：BecktonDickinson(BD)公司BACKMANCOULTER公司第4頁/共78頁流式細(xì)胞儀構(gòu)造流式細(xì)胞儀(FlowCytometer，F(xiàn)CM)的結(jié)構(gòu)分五部分：流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)激光光源及光束成形系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)信號(hào)檢測(cè)與存貯、顯示、分析系統(tǒng)細(xì)胞分選及濃縮系統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)(FlowCytometry，F(xiàn)CM)圖示如下頁：第5頁/共78頁流式細(xì)胞儀構(gòu)造模式圖第6頁/共78頁流式細(xì)胞儀構(gòu)造示意圖第7頁/共78頁流動(dòng)室與液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)流動(dòng)室是儀器核心部件，被測(cè)樣品在此與激光相交。流動(dòng)室由石英玻璃制成，中央有一長(zhǎng)方形小孔，供單個(gè)細(xì)胞通過。流動(dòng)室內(nèi)充滿了鞘液，其作用是將樣品環(huán)形包繞。鞘液流速穩(wěn)定，樣品流在鞘流的環(huán)包下形成流體動(dòng)力學(xué)聚焦，從而得到準(zhǔn)確的細(xì)胞熒光信息。流動(dòng)室上裝有壓電晶體，受到振蕩信號(hào)可發(fā)生振動(dòng)。

第8頁/共78頁流動(dòng)室與液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)第9頁/共78頁激光光源及光束成形系統(tǒng)目前臺(tái)式機(jī)FCM，大多采用氬離子氣體激光器。激光光束在到達(dá)流動(dòng)室前，先經(jīng)過透鏡聚焦，形成約22×66μm的光斑，這樣激光能量較強(qiáng)，以激發(fā)熒光染料。臺(tái)式機(jī)的整個(gè)光路是封閉的，在安裝時(shí)由工程師調(diào)試完畢后，無需用戶作任何調(diào)節(jié)，使用十分方便。第10頁/共78頁激光光源及光束成形系統(tǒng)第11頁/共78頁光學(xué)系統(tǒng)FCM的光學(xué)系統(tǒng)由若干組透鏡、濾光片和小孔組成，它們將不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)分別送入到不同的電子測(cè)控器。主要光學(xué)原件：濾光片(Filter)長(zhǎng)通濾片

LongPassFilter,LP短通濾片

ShortPassFilter,SP帶通濾片

BandPassFilter,BP第12頁/共78頁長(zhǎng)通濾片第13頁/共78頁短通濾片第14頁/共78頁帶通濾片第15頁/共78頁信號(hào)檢測(cè)與分析當(dāng)細(xì)胞攜帶熒光素標(biāo)記物，通過激光照射時(shí)，產(chǎn)生代表細(xì)胞內(nèi)不同物質(zhì)、不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，這些信號(hào)以細(xì)胞為中心，向空間360度立體角發(fā)射，產(chǎn)生散射光和熒光信號(hào)。以激發(fā)光光源波長(zhǎng)488nm為例示意圖：第16頁/共78頁熒光信號(hào)示意圖第17頁/共78頁散射光信號(hào)散射光信號(hào)不依賴任何樣品的制備技術(shù)（如染色），因此稱為細(xì)胞的物理參數(shù)。前向散射角(ForwardScatter，F(xiàn)SC)：與細(xì)胞的大小有關(guān)，在FCM應(yīng)用中，常取FSC作閾值，來排除樣品中的各種碎片。側(cè)向散射角(SideScatter，SSC)：與激光束正交90度的散射光信號(hào)，與細(xì)胞粒度及復(fù)雜程度正相關(guān)。散射光信號(hào)波長(zhǎng)與激光相同。第18頁/共78頁散射光信號(hào)示意圖RightAngleLightDetectoraCellComplexityForwardLightDetector

aCellSurfaceAreaIncidentLightSource第19頁/共78頁熒光信號(hào)一種是細(xì)胞自身在激光照射下發(fā)出微弱的熒光信號(hào)，稱自發(fā)熒光。一種是經(jīng)過特異熒光素標(biāo)記后，受激發(fā)光照射得到的熒光信號(hào)，通過對(duì)這類熒光信號(hào)的檢測(cè)和定量就能了解所研究細(xì)胞參數(shù)的存在與定量。第20頁/共78頁常用熒光染料目前臺(tái)式機(jī)FCM配置488nm激光管常用染料有PI(PropidiumIodide)PE(Phycorey-thrin)FITC(FluoresceinIsothiocyanate)PerCP(PeridininChlorophyllProtein)PE-CY5等633nm激光管常用染料有APCAPC-Cy第21頁/共78頁FCM測(cè)量數(shù)據(jù)的存貯、顯示和分析目前FCM所采用的都是多參數(shù)指標(biāo)，熒光參數(shù)標(biāo)記物最多可達(dá)4個(gè)，數(shù)據(jù)的存貯采用列表排隊(duì)方式，可節(jié)省存貯空間。數(shù)據(jù)文件為二進(jìn)制文件，缺乏直觀性，數(shù)據(jù)的顯示常用以下幾種方式：直方圖散點(diǎn)圖等高線圖密度圖三維圖第22頁/共78頁直方圖直方圖(DistributionHistogram)橫坐標(biāo)代表熒光信號(hào)或散射光信號(hào)相對(duì)強(qiáng)度，單位是道數(shù)，可以是線性或?qū)?shù)坐標(biāo)?？v坐標(biāo)一般是細(xì)胞數(shù)。第23頁/共78頁散點(diǎn)圖散點(diǎn)圖(DotPlot)X坐標(biāo)為該細(xì)胞一參數(shù)相對(duì)含量，Y坐標(biāo)為該細(xì)胞另一參數(shù)的含量，可以將細(xì)胞亞群分開。第24頁/共78頁等高線圖和密度圖第25頁/共78頁三維圖第26頁/共78頁設(shè)門分析可以通過設(shè)“門”(Gate)，分析、分選感興趣的細(xì)胞。第27頁/共78頁FCM的分辨率分辨率是衡量FCM測(cè)量精度的指標(biāo)，通常用變異系數(shù)CV表示。一般要求CV<8，最好CV<3。第28頁/共78頁FCM圖片——臺(tái)式機(jī)第29頁/共78頁FCM圖片——大型機(jī)第30頁/共78頁FCM的檢測(cè)范圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大小細(xì)胞粒度細(xì)胞表面面積核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量細(xì)胞功能細(xì)胞表面/胞漿/核的特異性抗原細(xì)胞活性細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子酶活性激素結(jié)合位點(diǎn)細(xì)胞受體第31頁/共78頁FCM的臨床應(yīng)用HIV免疫分型，CD4絕對(duì)計(jì)數(shù)白血病和淋巴瘤的免疫分型腫瘤的細(xì)胞周期和倍體分析網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)干細(xì)胞計(jì)數(shù)殘量白血病細(xì)胞檢查HLA-B27檢查血小板功能及相關(guān)疾病第32頁/共78頁FCM的科研應(yīng)用樹突細(xì)胞研究干細(xì)胞研究癌癥病人的多藥耐藥性細(xì)胞動(dòng)力學(xué)功能研究環(huán)境微生物分析流式細(xì)胞術(shù)與分子生物學(xué)研究第33頁/共78頁FCM的應(yīng)用——腫瘤學(xué)細(xì)胞周期分析細(xì)胞凋亡的分析凋亡細(xì)胞的分析凋亡相關(guān)蛋白的分析腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的研究多藥耐藥基因的研究第34頁/共78頁細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期G2MG0G1s02004006008001000G0G1sG2MDNA分析細(xì)胞數(shù)量2N4N第35頁/共78頁DNA分析的臨床意義DNA分析診斷腫瘤DNA非整倍體細(xì)胞峰突出的四倍體細(xì)胞峰SPF>15%

DNA倍體分析：

結(jié)合臨床病理的形態(tài)學(xué)診斷，對(duì)一些惡性腫瘤進(jìn)行早期診斷，跟蹤隨訪和早期治療，大大提高一些腫瘤的治愈率和生存率。尤其對(duì)一些細(xì)胞抽吸物、體液、組織液的脫落細(xì)胞的分析，意義尤為重要。增殖狀態(tài)分析：

反映了腫瘤的生長(zhǎng)速度和侵襲性第36頁/共78頁正常人骨髓細(xì)胞DNA分析(ModiFIT)第37頁/共78頁多發(fā)性骨髓瘤第38頁/共78頁FCM在腫瘤早期診斷和鑒別診斷中的作用DNA非整倍體的出現(xiàn)可能是癌前病變發(fā)生早期癌變的一個(gè)重要標(biāo)志在病理形態(tài)學(xué)不能做出診斷前可提供確切診斷信息DNA非整倍體的交界瘤應(yīng)按惡性對(duì)待形態(tài)學(xué)表現(xiàn)良性的腫瘤出現(xiàn)非整倍體提示惡變可能DNA指數(shù)可作為判斷間葉組織腫瘤良惡性的輔助指標(biāo)第39頁/共78頁細(xì)胞凋亡分析細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死是兩個(gè)不同的過程細(xì)胞凋亡的主要檢查手段形態(tài)學(xué)檢測(cè)Ladders實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)與凋亡相關(guān)的病理過程HIV自身免疫性疾病腫瘤第40頁/共78頁細(xì)胞凋亡分析細(xì)胞凋亡的主要指標(biāo)細(xì)胞內(nèi)酶改變：Caspase-3活化細(xì)胞膜不對(duì)稱性改變，磷脂酰絲氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：AnnexinV/PI細(xì)胞核DNA的斷裂改變：TUNNEL實(shí)驗(yàn)（APO-BRDU，APO-DIRECT）凋亡相關(guān)蛋白：FasBcl-2第41頁/共78頁細(xì)胞凋亡—PI分析PI-FluorescenceEvents調(diào)亡細(xì)胞正常G0/G1期細(xì)胞第42頁/共78頁細(xì)胞凋亡—ActiveCaspases-3第43頁/共78頁細(xì)胞凋亡—Caspases-3第44頁/共78頁細(xì)胞凋亡—AnnexinV第45頁/共78頁細(xì)胞凋亡—AnnexinV第46頁/共78頁細(xì)胞凋亡—BrdU第47頁/共78頁FCM的應(yīng)用——免疫學(xué)淋巴細(xì)胞免疫分型淋巴細(xì)胞亞群分析CD4絕對(duì)計(jì)數(shù)HIV的診斷與研究淋巴細(xì)胞CD4/CD8分析CD4絕對(duì)計(jì)數(shù)T細(xì)胞活化細(xì)胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)第48頁/共78頁FCM的免疫學(xué)應(yīng)用免疫功能和免疫調(diào)控的研究淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的活化細(xì)胞因子的研究淋巴細(xì)胞的增殖樹突狀細(xì)胞的研究HLA-B27檢測(cè)第49頁/共78頁淋巴細(xì)胞亞群分析使用特異的單克隆抗體，進(jìn)行多色分析，同時(shí)分析淋巴細(xì)胞上多種抗原的表達(dá)，可以將淋巴細(xì)胞亞群區(qū)分開，進(jìn)行定量分析各淋巴細(xì)胞亞群的百分含量淋巴細(xì)胞亞群的絕對(duì)計(jì)數(shù)第50頁/共78頁臨床意義了解在不同情況下體內(nèi)免疫功能狀態(tài)輔助臨床疾病的診斷探索疾病的發(fā)病機(jī)理、病程、預(yù)后監(jiān)測(cè)、指導(dǎo)臨床治療方案免疫系統(tǒng)疾病免疫缺陷病，AIDS移植病人排斥反應(yīng)或移植物抗宿主反應(yīng)的檢測(cè)腫瘤病人化療后免疫力檢測(cè)第51頁/共78頁淋巴細(xì)胞亞群分析根據(jù)功能，淋巴細(xì)胞主要分為B淋巴細(xì)胞（CD19+），與體液免疫有關(guān)T淋巴細(xì)胞（CD3+），與細(xì)胞免疫有關(guān)總T和總B可以用來判斷某些免疫缺陷和自身免疫性疾病NK細(xì)胞（CD3-CD16+56+），行使免疫監(jiān)控功能，能夠介導(dǎo)對(duì)某些腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。第52頁/共78頁SimulTESTIMK-Lymphocyte試劑盒CD45/CD14，Leucogate：確定淋巴細(xì)胞門，評(píng)估門的有效性，并自動(dòng)計(jì)算淋巴細(xì)胞亞群占門內(nèi)淋巴細(xì)胞的比例，排除門內(nèi)雜細(xì)胞的干擾1/2a，陰性對(duì)照：確定淋巴細(xì)胞的陰性界值，評(píng)估實(shí)驗(yàn)的非特異染色CD3/CD19：分析T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞CD3/CD4：分析T輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞CD3/CD8：分析T抑制/細(xì)胞毒性細(xì)胞CD3/CD16+56：分析T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞第53頁/共78頁淋巴細(xì)胞雙色分析LeucoGATE：Back-Gating，準(zhǔn)確圈定淋巴細(xì)胞門，并評(píng)估門的有效性第54頁/共78頁淋巴細(xì)胞雙色分析第55頁/共78頁AIDS病人T細(xì)胞亞群分析第56頁/共78頁FCM的應(yīng)用——血液病學(xué)白血病和淋巴瘤免疫分型殘留白血病造血干細(xì)胞計(jì)數(shù)PNH診斷網(wǎng)織紅細(xì)胞分析血小板分析血小板膜糖蛋白分子的表達(dá)血小板活化網(wǎng)織血小板分析第57頁/共78頁FCM的應(yīng)用——分子生物學(xué)分選細(xì)胞后進(jìn)行FISH分選細(xì)胞后進(jìn)行PCR流式細(xì)胞免疫表型與聚合酶鏈反應(yīng)及熒光原位雜交（PCR-FISH）結(jié)合測(cè)定血液CD4＋細(xì)胞中HIV特異的DNA或RNA流式熒光原位雜交（Flow-FISH）測(cè)定染色體端粒長(zhǎng)度第58頁/共78頁性別選擇第59頁/共78頁FCM在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用我科室開展較多的有如下幾個(gè)方面的應(yīng)用：中藥對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡影響，抗腫瘤中藥成份的篩選中藥對(duì)細(xì)胞表面（細(xì)胞因子、激素）受體表達(dá)的影響中藥對(duì)細(xì)胞粘附分子表達(dá)的影響中藥對(duì)淋巴細(xì)胞亞群（反映免疫狀態(tài)）的影響針灸及中藥對(duì)細(xì)胞內(nèi)酶的表達(dá)影響中藥對(duì)生精細(xì)胞的影響研究中藥治療艾滋病的研究（我實(shí)驗(yàn)室僅提供技術(shù)支持）第60頁/共78頁本實(shí)驗(yàn)室流式細(xì)胞儀及應(yīng)用介紹生產(chǎn)廠家：美國BECTONDICKINSON(BD)公司型號(hào)：FACSCalibur激光器：488nm和633nm各一個(gè)熒光通道（共4通道6參數(shù)）FSC及SSC：480-495nmFL1：515-545nm

FL2：564-606nm

FL3：>670nm

FL4：653-667nm技術(shù)參數(shù)

分析速度10000個(gè)/秒，分選速度700個(gè)/秒。常用熒光染料光譜學(xué)特征第61頁/共78頁細(xì)胞周期分析——PI單染第62頁/共78頁細(xì)胞周期分析——PI單染第63頁/共78頁細(xì)胞周期分析——ModiFit分析第64頁/共78頁細(xì)胞周期分析——ModiFit分析第65頁/共78頁大鼠生精細(xì)胞分析——PI單染第66頁/共78頁細(xì)胞凋亡—PI加AnnexinV雙染FITC-AnnexinVPI第67頁/共78頁淋巴細(xì)胞亞群分析CY5.5-CD3FITC-CD4PE-CD8第68頁/共78頁培養(yǎng)細(xì)胞表面粘附分子表達(dá)第69頁/共78頁培養(yǎng)細(xì)胞表面粘附分子表達(dá)第70