流式細(xì)胞術(shù)的學(xué)習(xí)教案

流式細(xì)胞術(shù)的學(xué)習(xí)教案第1頁(yè)/共48頁(yè)概念流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry，F(xiàn)CM或FACS）利用流式細(xì)胞儀對(duì)處在快速、直線、流動(dòng)狀態(tài)中的單細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速定量分析，同時(shí)對(duì)特定群體加以分選的現(xiàn)代細(xì)胞分析技術(shù)。流式細(xì)胞儀（FlowCytometer)集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。第2頁(yè)/共48頁(yè)流式細(xì)胞儀特點(diǎn)單細(xì)胞懸液或生物顆粒

分析速度高多參數(shù)精度高當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)第3頁(yè)/共48頁(yè)FACSCalibur特點(diǎn)：光路調(diào)節(jié)系統(tǒng)固定自動(dòng)化程度高操作簡(jiǎn)便使用壽命長(zhǎng)配備1-2根激光細(xì)胞分選速度慢，主要用于細(xì)胞分析臨床型（臺(tái)式機(jī)）第4頁(yè)/共48頁(yè)BDLSR第5頁(yè)/共48頁(yè)FACSVantageDiVa科研型（大型機(jī)）特點(diǎn)：多數(shù)字化適用用各類細(xì)胞分選4路分選第6頁(yè)/共48頁(yè)FACSAria科研型特點(diǎn)：分辨率高選配多種波長(zhǎng)和類型激光器可把感興趣細(xì)胞分選到特定培養(yǎng)孔或板上（4路和24孔板）適用于高速分選和多色分析第7頁(yè)/共48頁(yè)流式細(xì)胞儀檢測(cè)范圍細(xì)胞大小細(xì)胞粒度細(xì)胞表面面積核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量細(xì)胞結(jié)構(gòu)特異性抗原（細(xì)胞表面/胞漿/核）細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞活性酶活性激素結(jié)合位點(diǎn)細(xì)胞受體細(xì)胞功能第8頁(yè)/共48頁(yè)臨床研究

淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定、血小板分析、網(wǎng)織紅細(xì)胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、PNH診斷、人類同種異體器官移植中應(yīng)用、細(xì)胞因子測(cè)定、AIDS診斷與治療和療效評(píng)價(jià)、flow-FISH法測(cè)定端粒長(zhǎng)度第9頁(yè)/共48頁(yè)基礎(chǔ)研究

淋巴細(xì)胞功能、樹突狀細(xì)胞（DC）研究、造血干細(xì)胞研究、細(xì)胞周期分析、細(xì)胞凋亡分析、凋亡相關(guān)蛋白分析、細(xì)胞功能研究、多藥耐藥基因研究（MDR）、腫瘤相關(guān)基因表達(dá)研究、RNA測(cè)定、DNA測(cè)定、總蛋白測(cè)定、癌基因和抑癌基因表達(dá)產(chǎn)物測(cè)定、血管內(nèi)皮細(xì)胞研究第10頁(yè)/共48頁(yè)流式細(xì)胞儀的工作原理光學(xué)系統(tǒng)

激光光源 光收集系統(tǒng)液流系統(tǒng)

流動(dòng)室液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)電子系統(tǒng)

光電轉(zhuǎn)換 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)細(xì)胞分選系統(tǒng)第11頁(yè)/共48頁(yè)激光光源單波長(zhǎng)、高強(qiáng)度、高穩(wěn)定性多采用氬離子激光器或氦氖激光器一般選配2-4根激光，488nm、633nm和355nm、407nmUV激光最多檢測(cè)13個(gè)熒光參數(shù)第12頁(yè)/共48頁(yè)第13頁(yè)/共48頁(yè)LongpassShortpassBandpass460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50光收集系統(tǒng)：濾光片第14頁(yè)/共48頁(yè)

光收集系統(tǒng)：光電倍增管（PMT）第15頁(yè)/共48頁(yè)液流系統(tǒng)：流動(dòng)室、液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)第16頁(yè)/共48頁(yè)液流中心由單列勻速運(yùn)動(dòng)顆粒組成的液柱第17頁(yè)/共48頁(yè)細(xì)胞分選系統(tǒng)第18頁(yè)/共48頁(yè)FluorescenceActivatedCellSorting488

nm

laser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector第19頁(yè)/共48頁(yè)信號(hào)檢測(cè)--散色光FSC（小角散射)光它反應(yīng)細(xì)胞的相對(duì)大小和截面積的大小SSC(90度角散射光)代表細(xì)胞的顆粒度和精細(xì)結(jié)構(gòu)的變化全血細(xì)胞流式FSC-SSC圖它反應(yīng)細(xì)胞的物理特性,根據(jù)前側(cè)向散射光，可以把不同類型的細(xì)胞群加以區(qū)分第20頁(yè)/共48頁(yè)信號(hào)檢測(cè)--熒光信號(hào)自發(fā)熒光特異熒光特異熒光能量級(jí)激發(fā)激發(fā)態(tài)發(fā)射激光能量損失第21頁(yè)/共48頁(yè)數(shù)據(jù)顯示類型單參數(shù)直方圖（Histogram）X軸：代表熒光信號(hào)或散射光信號(hào)的強(qiáng)度，用“通道數(shù)”表示，可以與光強(qiáng)度之間線性關(guān)系或?qū)?shù)關(guān)系Y軸：代表該通道內(nèi)所出現(xiàn)具有相同光信號(hào)特征性細(xì)胞的頻率第22頁(yè)/共48頁(yè)二維等高圖和密度圖第23頁(yè)/共48頁(yè)P(yáng)seudo3DPlot3DPlot第24頁(yè)/共48頁(yè)

二維點(diǎn)圖DotPlot便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)不同的細(xì)胞群可以用不同的顏色標(biāo)記主要表達(dá)方式第25頁(yè)/共48頁(yè)光譜交叉Emissionwavelength(nm)530 580 630680730780FITCPEPE-TRPE-CY54colors-simultaneouscollection兩色以上熒光分析存在光譜交叉第26頁(yè)/共48頁(yè)熒光補(bǔ)償方法所有補(bǔ)償調(diào)為“0”調(diào)節(jié)電壓，用同型對(duì)照或陰性對(duì)照，使陰性群位于“左下角”依單陽(yáng)群體調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償?shù)?7頁(yè)/共48頁(yè)抗體使用原則

根據(jù)儀器型號(hào)和抗原表達(dá)強(qiáng)弱合理選擇熒光抗體低表達(dá)抗原標(biāo)記高S/N（信噪比）熒光素，如PE、APC使用雙標(biāo)以上抗體必做熒光補(bǔ)償?shù)?8頁(yè)/共48頁(yè)

樣品培養(yǎng)細(xì)胞新鮮組織石蠟包埋單細(xì)胞懸液

標(biāo)記熒光抗體檢測(cè)表型測(cè)定細(xì)胞分選流式細(xì)胞術(shù)操作流程統(tǒng)計(jì)學(xué)分析繼續(xù)培養(yǎng)第29頁(yè)/共48頁(yè)流式細(xì)胞儀測(cè)定常用的熒光染料有多種,他們分子結(jié)構(gòu)不同,激發(fā)光譜和發(fā)射光譜也各異,選擇熒光染料時(shí)必須依據(jù)流式細(xì)胞儀所配備的激光光源的發(fā)射光波長(zhǎng)(如氬離子氣體激光管,它的發(fā)射光波488ηm,氦氖離子氣體激光管發(fā)射光波長(zhǎng)633ηm）。488ηm激光光源常用的熒光染料及他們的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)分別是：

激發(fā)光波長(zhǎng)

發(fā)射光峰值

（ηm）（ηm）

FITC（異硫氰酸熒光素）

488

525（綠）

PE（藻紅蛋白）

488

575（橙紅）

PI

（碘化丙啶）

488

630（橙紅）

ECD

(藻紅蛋白-得克薩斯紅)

488

610（紅）

CY5

（化青素）

488

675（深紅）

PreCP(葉綠素蛋白)

488

675（深紅）

第30頁(yè)/共48頁(yè)

第二部分流式細(xì)胞術(shù)在不同領(lǐng)域的應(yīng)用第31頁(yè)/共48頁(yè)

細(xì)胞周期分析

第32頁(yè)/共48頁(yè)在細(xì)胞周期內(nèi),DNA含量隨細(xì)胞內(nèi)時(shí)相發(fā)生周期性變化。正常情況下,大多數(shù)細(xì)胞處于休止期(Go),

G1期細(xì)胞雖有DNA合成，但DNA含量仍為2N，為二倍體細(xì)胞,;處于活躍的DNA合成期(S期)的細(xì)胞DNA含量為2N-4N;正經(jīng)歷細(xì)胞分裂(G2/M期)的細(xì)胞含有最大量的DNA(4N)。細(xì)胞經(jīng)固定后用PI(碘化丙啶)等熒光染料染色即可上機(jī)測(cè)定。但標(biāo)本需先經(jīng)RNA酶處理以排除RNA干擾。第33頁(yè)/共48頁(yè)樣品制備

1000rpm5分鐘收集2X106個(gè)細(xì)胞PBS漂洗兩次70%酒精4度固定過夜收集固定的細(xì)胞PBS漂洗0.5PBS懸浮細(xì)胞2.5μl10μg/μlRNaseA37度消化1小時(shí)過300目細(xì)胞篩50μl0.1mg/mlPI（含1%Triton)，1000rpm5分鐘離心兩次混勻，室溫靜止5分鐘上機(jī)第34頁(yè)/共48頁(yè)建立獲取模式，獲取數(shù)據(jù)

（PI單染分析細(xì)胞周期，同時(shí)看凋亡）去甲斑蟊素對(duì)肝癌細(xì)胞周期的作用第35頁(yè)/共48頁(yè)數(shù)據(jù)分析

圈門去除細(xì)胞碎片，分析細(xì)胞凋亡圈門去除粘連體，分析細(xì)胞周期第36頁(yè)/共48頁(yè)細(xì)胞凋亡分析

第37頁(yè)/共48頁(yè)細(xì)胞核的改變：由于凋亡細(xì)胞核的改變，造成各種染色體熒光染料對(duì)凋亡細(xì)胞DNA可染性發(fā)生改變。研究表明，用各種染色體熒光染料對(duì)經(jīng)固定的凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色，其DNA可染性降低。許多學(xué)者把這種DNA可染性的降低認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的標(biāo)志之一。

第38頁(yè)/共48頁(yè)2.光散射特性：凋亡細(xì)胞形態(tài)上的改變影響它們的光散射特性。在流式細(xì)胞儀上，前散射光（FSC

）與細(xì)胞的大小有關(guān)，

側(cè)散射光（SSC）反映的是光在細(xì)胞內(nèi)的折射作用，與細(xì)胞內(nèi)的顆粒多少有關(guān)。在細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞固縮，體積變小，故前散射光降低，這一特性往往被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的特點(diǎn)之一。此外細(xì)胞凋亡時(shí)由于染色體降解，核破裂形成，細(xì)胞內(nèi)顆粒往往增多，故凋亡細(xì)胞側(cè)散射光常增加。

第39頁(yè)/共48頁(yè)AnnexinV-PE/7-AAD雙染色法雙陰：活細(xì)胞AnnexinV-PE單陽(yáng)：早期凋亡細(xì)胞雙陽(yáng)：晚期凋亡細(xì)胞7-AADd單陽(yáng)：壞死細(xì)胞第40頁(yè)/共48頁(yè)人外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)第41頁(yè)/共48頁(yè)T淋巴細(xì)胞T淋巴細(xì)胞檢測(cè)淋巴細(xì)胞第42頁(yè)/共48頁(yè)CD4+T（Th)淋巴細(xì)胞檢測(cè)淋巴細(xì)胞CD4+第43頁(yè)/共48頁(yè)CD8+Ts淋巴細(xì)胞檢測(cè)淋巴細(xì)胞CD8+第44頁(yè)