線粒體疾病的分子生物學(xué)檢驗(yàn)

線粒體疾病的分子生物學(xué)檢驗(yàn)第1頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二線粒體（Mitochondrion）21.真核細(xì)胞中的細(xì)胞器，二分裂方式進(jìn)行新陳代謝，平均壽命10天2.多數(shù)細(xì)胞含幾個(gè)到幾千個(gè)線粒體3.每個(gè)線粒體含2-10線粒體DNA（mtDNA）第2頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二3線粒體功能MitochondrialDisease.Chest2001;120:634–648ATP能量代謝第3頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二其他功能

儲(chǔ)存鈣離子調(diào)節(jié)膜電位并控制細(xì)胞程序性死亡細(xì)胞增殖與細(xì)胞代謝的調(diào)控合成膽固醇及某些血紅素

產(chǎn)熱

——Wikipedia第4頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二線粒體病

Mitochondrialdisorders發(fā)現(xiàn)-1962年，Lufe等發(fā)現(xiàn)一位年輕的瑞典婦女伴有異常增高的基礎(chǔ)代謝率，同時(shí)伴有線粒體結(jié)構(gòu)的異常和氧化磷酸化功能的異常。直到1988年，Wallace等報(bào)道了首例由線粒體DNA突變引起的人類疾病，明確了mtDNA突變可引起人類疾病。

定義-是遺傳缺陷引起線粒體異常，致使ATP合成障礙、能量來(lái)源不足等導(dǎo)致的一組異質(zhì)性病變，又稱為線粒體細(xì)胞病。發(fā)病率-約為1:5000（約每5000人中1人發(fā)病）Smeitink2006第5頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二線粒體病mitochondrialdisorders——是一組高度臨床變異性和遺傳異質(zhì)性的疾病線粒體蛋白16,569bpcirculardoublestranded(mtDNA)20%1,500nucleargenes80%

structuralproteinoftheOXPHOScomplexes

proteinrequiredforassemblyofOXPHOScomplexes

proteinsinvolvedinmtDNA

translation

proteinsinvolvedinmtDNA

maintenance

proteinsinvolvedinmitochondrialfusionandfissionDouglasC.Wallace,1817–1819——Shoubridge,2001;Schapira，2000第6頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二進(jìn)一步導(dǎo)致線粒體功能異常：①底物的運(yùn)輸缺陷；②底物的利用缺陷；③檸檬酸循環(huán)異常；④氧化磷酸化脫偶聯(lián)；⑤呼吸鏈異常。第7頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二發(fā)病特點(diǎn)

核基因突變——常染色體隱性、顯性遺傳或X-連鎖遺傳

線粒體基因突變——母系遺傳（突變的mtDNA在母血增加，受累及的后代發(fā)病頻率增加）mtDNA突變與臨床表型之間關(guān)系復(fù)雜，主要表現(xiàn)為同一種mtDNA突變可以引發(fā)多種不同的疾病表型，而同一種疾病表型又可以由多種不同的mtDNA突變誘導(dǎo)。遺傳異質(zhì)性嬰幼兒起病較常見(jiàn)第8頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

編碼線粒體結(jié)構(gòu)蛋白的核基因突變進(jìn)行性外眼肌麻痹（PEO）、線粒體神經(jīng)腸胃腦肌病、Leigh氏綜合征

線粒體蛋白質(zhì)翻譯相關(guān)的核基因突變2004年Miller等首次報(bào)道核基因編碼的線粒體核糖體蛋白亞單位16(MRPS16)純合突變，導(dǎo)致先天畸形伴張力衰竭、四肢水腫、肝轉(zhuǎn)氨酶活性升高并乳酸亞基中毒癥，該女嬰在出生后3天死亡。核基因突變第9頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二線粒體基因突變突變的影響：引起呼吸鏈功能缺陷氧化磷酸化酶異常閾值效應(yīng)：組織特異性突變的mtDNA在復(fù)制分離時(shí)可能不均等分配母系遺傳：不同突變后代發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)不同。

相比A8344G突變，攜帶A3243G突變的母系后代更容易發(fā)病。

突變分布：同質(zhì)性——各器官組織分布相同異質(zhì)性——不同組織、細(xì)胞分布不同

一般特點(diǎn)第10頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二母系遺傳（MaternalInheritance）11第11頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二同質(zhì)性突變與異質(zhì)性突變12線粒體基因同質(zhì)性（Homoplasmy）0或100%異質(zhì)性（Heteroplasmy）0-100%核基因純合子（Homozygous）0或100%雜合子（Heterozygous）50%第12頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二mtDNA同質(zhì)性/異質(zhì)性突變與閾值13第13頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二線粒體基因突變點(diǎn)突變目前已報(bào)道的mtDNA點(diǎn)突變將近330種，涉及mtDNA編碼的各個(gè)基因，其中結(jié)構(gòu)基因突變177種、tRNA基因突變137種、rRNA基因突變12種、D-Loop區(qū)突變2種LHON、線粒體腦肌病合并乳酸血征及卒中發(fā)作綜合征、肌陣攣癲癇、破碎紅纖維病、母系遺傳糖尿病伴耳聾綜合征等重排重排突變逾數(shù)百遺傳性痙攣性截癱等

(http：//)第14頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二線粒體疾病是復(fù)雜性疾病遺傳方式復(fù)雜常染色體隱性遺傳（AutosomalRecessive）常染色體顯性遺傳（AutosomalDominant）性連鎖遺傳（Sexlinked）母系遺傳（Maternallyinherited）臨床表型復(fù)雜累及多系統(tǒng)（Multisystemicinvolvement）影響幾乎所有組織器官（Anyorganortissuecanbeaffected）

15第15頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二線粒體功能涉及眾多的組織器官16第16頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二線粒體病的共同臨床特點(diǎn)

嬰兒期發(fā)?。?/p>

常見(jiàn)于嬰兒伴隨COX陰性肌纖維、腦病和Leigh綜合征。

兒童發(fā)病：

見(jiàn)于MELAS、MERRF、Leigh病、線粒體肌病、線粒體心肌病和KSS。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害：

共濟(jì)失調(diào)、癲癇、肌張力下降、脊髓病等

周圍神經(jīng)損害：

交感神經(jīng)病出現(xiàn)在MNGIE和Wolfram綜合征

視聽(tīng)神經(jīng)損害：

視神經(jīng)病出現(xiàn)在Leber病和顯性遺傳視神經(jīng)萎縮1型聽(tīng)力喪失出現(xiàn)在KSS

肌肉病

見(jiàn)于線粒體肌病、MELAS和KSS。眼外肌麻痹見(jiàn)于KSS和PEO（高度臨床變異性）Chinneryetal.Lancet2000第17頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二線粒體疾病的生化診斷當(dāng)患者基因變異不能被確定時(shí)，完整的生化檢查可以輔助診斷。代謝產(chǎn)物分析（血液、尿液、腦脊液等）血液可以正常，但腦脊液多異常，（動(dòng)脈比靜脈好）；乳酸/丙酮酸比高(>50:1)提示呼吸鏈?zhǔn)艿阶钄?。正常不除外線粒體疾病。酶測(cè)定

氧化磷酸化（OXPHOS）系統(tǒng)的酶活性測(cè)定。（western、比色法等）方法不穩(wěn)定一般情況下，血清CK（肌酸激酶）正?；蜉p度升高；升高占30%見(jiàn)于慢性進(jìn)行性眼外肌麻痹；mtDNA丟失時(shí)非常高。JinheritMetabDis.2011April;34(2):283-292第18頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二19線粒體疾病的生化診斷當(dāng)患者基因變異不能被確定時(shí)，完整的生化檢查可以輔助診斷。肌肉活檢線粒體病的肌肉病理改變特點(diǎn)：（1）出現(xiàn)線粒體結(jié)構(gòu)異常、細(xì)胞色素陰性肌纖維或破碎紅纖維（RRF）為主要病理改變。（2）上述病理改變出現(xiàn)的頻率高。（3）缺乏其他的肌肉病理改變。JinheritMetabDis.2011April;34(2):283-292第19頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二兒童及成人線粒體疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)A符合線粒體腦肌病各綜合征的臨床表現(xiàn)如KSS、CPEO、MELAS、MERRF等；多系統(tǒng)不明原因發(fā)病必須至少三個(gè)系統(tǒng)出現(xiàn)臨床癥狀除先證者外，至少有一個(gè)母系家族成員有發(fā)病可能排除其它代謝和非代謝疾病B肌活檢在骨骼肌中存在>2%破碎樣紅肌纖維主要診斷標(biāo)準(zhǔn)(Bernieretal,2002)(3,5)第20頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二21C有以下一種或多種呼吸鏈酶活性受抑制的表現(xiàn)：

50歲以下肌活檢COX陰性肌纖維>2%；50歲以上肌活檢COX陰性肌纖維>5%；任一組織中呼吸鏈酶活性<20%；任一細(xì)胞系中呼吸鏈酶活性<30%；多于兩組織內(nèi)相同呼吸鏈酶活性<30%；主要診斷標(biāo)準(zhǔn)第21頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二次要診斷標(biāo)準(zhǔn)：A癥狀符合線粒體腦肌病的臨床表現(xiàn)；至少以下一種提示肌肉中線粒體異常的表現(xiàn)：①30~50歲肌活檢RRF在1%~2%；②30歲以下肌活檢出現(xiàn)RRF；③電鏡下見(jiàn)廣泛線粒體異常；B

至少一種呼吸鏈功能受抑制的表現(xiàn)：①生化或極譜描記的呼吸鏈復(fù)合物活性在20%~30%；②用免疫方法證實(shí)呼吸鏈復(fù)合物表達(dá)減少；(Bernieretal,2002)(3,5)第22頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二次要診斷標(biāo)準(zhǔn)：C發(fā)現(xiàn)可能相關(guān)的mtDNA異常；D一種或多種氧化磷酸化受損的表現(xiàn)：①腦脊液或血中乳酸、丙酮酸和(或)丙氨酸增高；②若疑為KSS，腦脊液蛋白質(zhì)增高；③PET或31P-MRS證實(shí)肌肉或腦代謝降低；④最大氧分壓、平均氧分壓或乳酸閾值降低。(Bernieretal,2002)(3,5)第23頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

符合以上2個(gè)主要診斷指標(biāo)或1個(gè)主要診斷指標(biāo)及2個(gè)次要診斷指標(biāo)的即為確診線粒體?。环?個(gè)主要診斷指標(biāo)及1個(gè)次要診斷指標(biāo)或至少3個(gè)次要診斷指標(biāo)的為擬診線粒體??；

符合1個(gè)主要診斷指標(biāo)或在符合臨床表現(xiàn)的基礎(chǔ)上還具備1個(gè)次要診斷指標(biāo)的為疑診線粒體病。JinheritMetabDis.2011April;34(2):283-292第24頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二線粒體病診斷時(shí)應(yīng)注意

基因診斷與生化檢查如能量代謝情況、呼吸鏈和酶復(fù)合體活性等相結(jié)合

要區(qū)分病理性突變和正常衰老所致的線粒體基因突變

線粒體基因異常與臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度之間存在量效關(guān)系

散發(fā)與遺傳的相關(guān)性，診斷是否遺傳需排除環(huán)境、藥物和衰老等因素第25頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)

線粒體基因組與疾病線粒體基因組及其表達(dá)系統(tǒng)線粒體基因組與細(xì)胞核基因組的相互關(guān)系線粒體基因組變異與疾病26第26頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二27人類線粒體基因組Lightstrand:8tRNAand1mRNA(ND6)Heavystrand:14tRNA,2rRNA,and12mRNAPolycistronicwithposttranscriptionalprocessing

基因組小,僅16569bp

雙鏈環(huán)狀DNA

13結(jié)構(gòu)基因

/mRNA22tRNA基因

2rRNA基因12SrRNA基因16SrRNA基因

非編碼區(qū)D-loop（約1120bp）

L鏈復(fù)制起始區(qū)（約30～50bp，tRNAAsn-tRNACys）

高突變率線粒體基因組及其表達(dá)系統(tǒng)第27頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第28頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第29頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二ThetwostrandsofmtDNAaredifferentiatedbytheirnucleotidecontentwiththeguaninerichstrandreferredtoastheheavystrand,andthecytosinerichstrandreferredtoasthelightstrand.Theheavystrandencodes28genes,andthelightstrandencodes9genesforatotalof37genes.Ofthe37genes,13areforproteins(polypeptides),22arefortransferRNA(tRNA)andtwoareforthesmallandlargesubunitsofribosomalRNA(rRNA).第30頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二CategoryGenesNADHdehydrogenase

(complexI)MT-ND1,MT-ND2,MT-ND3,MT-ND4,MT-ND4L,MT-ND5,MT-ND6CoenzymeQ-cytochromecreductase/Cytochromeb

(complexIII)MT-CYBcytochromecoxidase

(complexIV)MT-CO1,MT-CO2,MT-CO3ATPsynthaseMT-ATP6,MT-ATP8Transportchain(13peptides)Manyofthegenesencodethetransportchain:第31頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2rRNAsMitochondrialrRNAisencodedbyMT-RNR1(12SrRNA)MT-RNR2(16SrRNA).第32頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二22tRNAsThefollowinggenesencodetRNA:AminoAcid

3-Letter

1-Letter

MTDNA

AlanineAlaAMT-TAArginineArgRMT-TRAsparagineAsnNMT-TNAsparticacidAspDMT-TDCysteineCysCMT-TCGlutamicacidGluEMT-TEGlutamineGlnQMT-TQGlycineGlyGMT-TGHistidineHisHMT-THIsoleucineIleIMT-TILeucineLeuLMT-TL1,MT-TL2LysineLysKMT-TKMethionineMetMMT-TMPhenylalaninePheFMT-TFProlineProPMT-TPSerineSerSMT-TS1,MT-TS2ThreonineThrTMT-TTTryptophanTrpWMT-TWTyrosineTyrYMT-TYValineValVMT-TV第33頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二HV2HV1340731636516024ControlregionD-loop576第34頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第35頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第36頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二Replication第37頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二HumanmitochondrialDNA(mtDNA)hasthreepromoters,H1,H2,andL(heavystrand1,heavystrand2,andlightstrandpromoters).TheH1promotertranscribestheentireheavystrandandTheLpromotertranscribestheentirelightstrand.TheH2promotercausesthetranscriptionofthetwomitochondrialrRNAmolecules.Transcription第38頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第39頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二Theprocessoftranscriptioninitiationinmitochondriainvolvesthreetypesofproteins:themitochondrialRNApolymerase(POLRMT),2.mitochondrialtranscriptionfactorA(TFAM),3.mitochondrialtranscriptionfactorsB1andB2(TFB1M,TFB2M).第40頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二condonAnti-condonNucleartRNAMt-tRNAGCUGCCGCAGCGGGCUGCUGC第41頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第42頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)

線粒體基因組與疾病線粒體基因組及其表達(dá)系統(tǒng)線粒體基因組與細(xì)胞核基因組的相互關(guān)系線粒體基因組變異與疾病43第43頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二核基因組與線粒體基因組的相互作用44核基因組編碼了1500多個(gè)線粒體蛋白線粒體基因組只編碼了13條多肽鏈“交叉對(duì)話（cross-talk）”機(jī)制第44頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)

線粒體基因組與疾病線粒體基因組及其表達(dá)系統(tǒng)線粒體基因組與細(xì)胞核基因組的相互關(guān)系線粒體基因組變異與疾病線粒體基因組變異堿基突變：點(diǎn)突變。其中結(jié)構(gòu)基因的點(diǎn)突變，與核基因組一樣，包括同義突變和錯(cuò)義突變?nèi)笔c插入：mtDNA拷貝數(shù)目突變：線粒體基因組變異與疾病耳聾，Leber遺傳性視神經(jīng)病變，糖尿病，高血壓，腫瘤45第45頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二46在線粒體相關(guān)疾病中常見(jiàn)的DNA點(diǎn)突變MELAS綜合征（線粒體腦肌病乳酸酸中毒及卒中樣發(fā)作）：A3243G(80%),T3271C（在tRNALeu(UUR)基因）MERRF（肌陣攣性癲癇伴破碎紅纖維）：A8344G(80%),T8356C（在tRNALys基因）Leber視神經(jīng)?。↙HON）：G11778A（在ND4基因），G3460A（在ND1基因）耳聾（Deafness）:A1555G,T1494C（在12SrRNA基因）A3243G（在tRNALeu(UUR)基因）2型糖尿?。═ype2Diabetes）:A3243G（在tRNALeu(UUR)基因）

NARP（共濟(jì)失調(diào)伴色素性視網(wǎng)膜炎神經(jīng)?。篢8993G,T8993C（在ATPase6基因）第46頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二線粒體病的分子診斷標(biāo)本選擇：

外周血白細(xì)胞——最常用毛發(fā)唾液尿液

骨骼肌——檢測(cè)mtDNA分子診斷的最好標(biāo)本第47頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二檢測(cè)已知DNA突變的方法：等位基因特異性寡核苷酸雜交（ASO）等位基因特異性擴(kuò)增（ASA）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCR-RLFP）連接酶鏈反應(yīng)（LCR）基因芯片技術(shù)檢測(cè)未知DNA突變的方法：?jiǎn)捂湗?gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）變性梯度凝膠電泳（DEEG）異源雙鏈分析（HA）DNA序列測(cè)序變性高效液相色譜（DHPLC）分子診斷方法第48頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二線粒體疾病中常見(jiàn)的突變核基因突變（nucleargenemutations）氧化磷酸化系統(tǒng)由核基因編碼的蛋白質(zhì),例如:Surf1,SCO2,NDUFV1,NDUFS1,etc.呼吸鏈缺陷:重復(fù)、缺失線粒體DNA點(diǎn)突變（mtDNApointmutations）LHON,MELAS,MERRF,NARP,etc.mtDNA缺失/重復(fù)（mtDNADeletions/duplications）

eg.KSS,Pearsonsynd,diabetes&deafness未知遺傳（unknowninheritance）49第49頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)

線粒體基因組與耳聾與耳聾相關(guān)的mtDNA突變耳聾相關(guān)的mtDNA突變的檢測(cè)50第50頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二“千手觀音”

21位聾啞演員中18人有藥物史部分患者使用正常劑量也會(huì)致聾“一針致聾”現(xiàn)象第51頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二突變位點(diǎn)基

因同質(zhì)性/異質(zhì)性疾

病首次報(bào)道aT961delT+C(n)ins961insC12SrRNA同質(zhì)性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Bacinoetal.(1995)Tangetal.(2002)T1095C12SrRNA同質(zhì)性/異質(zhì)性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Thyagarajanetal.(2000)C1494T＊12SrRNA同質(zhì)性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Zhaoetal.(2004)A1555G＊12SrRNA同質(zhì)性/異質(zhì)性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Prezantetal.(1993)G1606AtRNAVal異質(zhì)性綜合征型耳聾Tirantietal.(1998)A3243G＊tRNALeu(UUR)異質(zhì)性綜合征型耳聾vandenOuweland,etal.(1992)G7444ACO1/tRNASer(UCN)同質(zhì)性/異質(zhì)性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Pandyaetal.(1999)A7445G＊CO1/tRNASer(UCN)同質(zhì)性/異質(zhì)性非綜合征型耳聾Reidetal.(1994)7472insC＊tRNASer(UCN)同質(zhì)性/異質(zhì)性綜合征型耳聾Tirantietal.(1995)T7511C＊tRNASer(UCN)同質(zhì)性/異質(zhì)性非綜合征型耳聾Sueetal.(1999)T7512CtRNASer(UCN)同質(zhì)性/異質(zhì)性綜合征型耳聾Nakamuraetal.(1995)A8344G＊tRNALys異質(zhì)性綜合征型耳聾Shoffneretal.(1990)G8363AtRNALys異質(zhì)性綜合征型耳聾Santorellietal.(1996)T14709CtRNAGlu同質(zhì)性綜合征型耳聾Rigolietal.(2001)G15927AtRNAThr同質(zhì)性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Wangetal.(2008)第52頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)

線粒體基因組與耳聾與耳聾相關(guān)的mtDNA突變耳聾相關(guān)的mtDNA突變的檢測(cè)PCR-RFLP技術(shù)DHPLC技術(shù)DNA測(cè)序技術(shù)基因芯片技術(shù)53檢測(cè)位點(diǎn)引物序列(5′～3′)退火溫度(℃)產(chǎn)物長(zhǎng)度(bp)A1555GC1494TCGATCAACCTCACCACCTCT58802TGGACAACCAGCTATCACCAA7445GACGCCAAAATCCATTTCACT58987CGGGAATTGCATCTGTTTTT第53頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二54對(duì)1642例氨基糖苷類誘發(fā)的非功能性耳聾漢族聾兒進(jìn)行線粒體12SrRNA變異檢測(cè)J.Luetal./Mitochondrion.2010,10(4):380–390第54頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二55第55頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二12SrRNA基因中有68

個(gè)核苷酸變異所有的核苷酸變異均為同質(zhì)性68個(gè)核苷酸變異中，有3

個(gè)

C1494T其余

65

個(gè)變異為A1555G56第56頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二57第57頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二58第58頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第三節(jié)線粒體與Leber遺傳性視神經(jīng)病變與Leber遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)的mtDNA突變Leber遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)的mtDNA突變常用檢測(cè)技術(shù)59第59頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二Leber’sHereditaryOpticNeuropathy(LHON)第60頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二Leber’sHereditary

–inheritedfrommitochondrialDNAOptic–affectstheeyeNeuropathy–disease/abnormalityofnervous system第61頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二DegenerationofretinalganglioncellsandtheiraxonsInheritedfrommaternalmitochondrialDNAOccursduringyoungadulthood第62頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二AcutePhase:Painless,acuteonsetofcentralvisionlossLossofvisualacuity/colouroncesymptomsappearinoneeye,othereyeaffectedweekslaterSubacutePhaseatrophyofopticdisclegallyblindAsymptomaticuntilvisualblurringdevelopsSignsandSymptoms第63頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二MaternalinheritanceMutationoccursinmitochondrialDNA(mtDNA)OnlytheeggcontributesmtDNAtotheembryoGeneticsofLHON第64頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二(1)G11778A:50-60%LHONpopulation(2)G3460A:8-25%LHONpopulation(3)T14484C:10%LHONpopulationSinglePointMutations

3majorpathogenicmutations:第65頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二G14459AT14484C第66頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二Malesvs.FemalesLHONispredominantinmalesStudieslookingatx-linkagehavenotbeenconfirmednorstatisticallysignificant第67頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二Epidemiology–racedependent1177834601448470%Europeans90%Asians86%QuebecCanadiansDuetoFounderEffect

（奠基者效應(yīng)）Koreans第68頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二presenceofmixtureofmorethanonetypeoforganellargenomeiemtDNANumerouscelldivisionsandthuslotsoftimeisrequiredformutantallelestobeexpressedinmitochondriaSymptomsdon’tappearuntiladulthoodAlsoimplicatedasthereasonforvariabilityinseverityofvisionlossHeteroplasmy第69頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二PhotoreceptorsInterneuronsRGC(retinalganglialcells)NeuronsAxonsmakeupopticnerveRetina第70頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二FireactionpotentialsHugeATPdemandVerysensitivetoenergysupplyandmitochondriadefectsEspeciallyRGCsforcentralvisualfieldLimitedregeneration

abilitiesRGC:neurons第71頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二Otherneuronsinthebodycanbeaffectedtoo(CNS+PNS)ThisresultsinLeber`sPlusMovementdisordersTremorsCardiacconductiondefectsMS-like（多發(fā)性硬化樣）featuresAllNeuronsareVulnerable第72頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二ATPDemandLeberOxidativePhosphorylatione-TransportChainROSReactiveO2SpeciesOxidativestressRGC第73頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二Complex1

e-prematurelyleaktoO2

aka.NADHDehydrogenaseMitochondrialMatrixIntermembraneSpace3pointmutations4e-+4H++O2

2H2Oe-+O2

O2-第74頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二LessATPLeberATPDemandOxidativePhosphorylatione-transportchainROSReactiveO2SpeciesOxidativestressMoreSuperoxideO2-RGC第75頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二Leber:oxidativestress+ATPdeprivationAtrophy:wearingawayoftissueChronicoxidativestress:Apoptosis(celldeath)Thingsgowrong…Thelinkisimportant!!第76頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二GeneticTestingforthematernallyinheritedmitochondrialDNA.Avoidpotentialenvironmentalprecipitantssuchastobaccoandexcessivealcohol.Avoidmedicationswhichhavebeenshowntoinducethedisease(Ethambutol乙胺丁醇,Chloramphenicol氯霉素)第77頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二VisiondamagefromdegenerationofopticnerveMaternallyinheritedthroughmtDNA3pointmutationsComplexIROS(reactiveoxygenspecies)TreatmentAntioxidantsInhibitmitochondrial-dependentapoptosis第78頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二突變位點(diǎn)基因同質(zhì)性/異質(zhì)性首次報(bào)道*G3316AND1同質(zhì)性Saillardetal.(2000)T3394CND1同質(zhì)性Hofmannetal.(1997)G3460A*ND1同質(zhì)性/異質(zhì)性Huoponenetal.(1991)C3497TND1同質(zhì)性Kongetal.(2003）G3733AND1同質(zhì)性/異質(zhì)性Valentinoetal.(2004)C4171AND1同質(zhì)性/異質(zhì)性Kimetal.(2002)T4216CND1同質(zhì)性Torronietal.(1994）A4435GtRNAMet同質(zhì)性Herrnstadtetal.（2002）G7444ACOⅠ同質(zhì)性Huoponenetal.（1993）T10663CND同質(zhì)性Brownetal.(1995)G11696AND4同質(zhì)性/異質(zhì)性Zhouetal.（2006）G11778A*ND4同質(zhì)性/異質(zhì)性Wallaceetal.(1988)T12338CND4同質(zhì)性Wongetal.（2002）G14459AND6同質(zhì)性/異質(zhì)性Junetal.(1994)C14482G/AND6同質(zhì)性/異質(zhì)性Howelletal.(1998)T14484C*ND6同質(zhì)性/異質(zhì)性Johnsetal.(1992)A14495GND6異質(zhì)性Chinneryetal.(2001)T14502CND6同質(zhì)性O(shè)zawaetal.（1991）C14568TND6同質(zhì)性Wissingeretal.(1997)A14693GtRNAGlu同質(zhì)性/異質(zhì)性Tzenetal.（2003）A15951GtRNAThr同質(zhì)性Lietal.（2006）79原發(fā)性突變：G3460A，G11778A，T14484C的突變，占全部LHON的80-90％繼發(fā)性突變：T3394C，T4216C，C4019T，G5244A，C4777T，G9438A，G13708A，G15257A新突變：A4435G位于tRNAMet

基因可以調(diào)節(jié)ND4G11778A突變的外顯率與Leber遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)的mtDNA突變第79頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二80A4435G可以調(diào)節(jié)ND4G11778A突變的外顯率tRNAMet第80頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第三節(jié)線粒體與Leber遺傳性視神經(jīng)病變與Leber遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)的mtDNA突變Leber病變相關(guān)的mtDNA突變常用檢測(cè)技術(shù)PCR-RFLP技術(shù)PCR-SSCP技術(shù)DHPLC技術(shù)DNA測(cè)序技術(shù)81G3460A，G11778A，T11484C原發(fā)性突變測(cè)序圖第81頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第四節(jié)

線粒體與糖尿病線粒體糖尿病美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)(1997)/世界衛(wèi)生組織(1999)制定了新的糖尿病分型標(biāo)準(zhǔn)，將線粒體基因缺陷型糖尿病列為特殊類型糖尿病，屬于β細(xì)胞功能遺傳缺陷型糖尿病，約占糖尿病總數(shù)的1～3％據(jù)浙江省糖尿病防治中心提供的數(shù)據(jù)，浙江省糖尿病患病率為2.96%線粒體DNA突變與糖尿病線粒體糖尿病的檢驗(yàn)診斷82第82頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第四節(jié)

線粒體與糖尿病線粒體糖尿病線粒體DNA突變與糖尿病線粒體糖尿病的檢驗(yàn)診斷83第83頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二線粒體DNA突變與糖尿病突變位點(diǎn)累及基因同質(zhì)性/異質(zhì)性疾病首次報(bào)道C1310T12SrRNA同質(zhì)性糖尿病臨床表型Guanetal.(2010)A1438G12SrRNA同質(zhì)性糖尿病臨床表型Vawteretal.(2009)A3243G*tRNALeu(UUR)異質(zhì)性糖尿病合并耳聾Vandenetal.(1992)C3254AtRNALeu(UUR)異質(zhì)性妊娠糖尿病Ngetal.(2000)T3264CtRNALeu(UUR)異質(zhì)性糖尿病Matsuokaetal.(1997)T3271CtRNALeu(UUR)異質(zhì)性糖尿病Jakschetal.(1995)G3316AMT-ND1同質(zhì)性非胰島素依賴性糖尿病Ogiharaetal.(1995)T3394CMT-ND1同質(zhì)性非胰島素依賴性糖尿病Wallaceetal.(1995)T3398CMT-ND1同質(zhì)性糖尿病合并耳聾Jakschetal.(1995)A3399TMT-ND1同質(zhì)性妊娠糖尿病Ngetal.(2000)T4291CtRNAIle同質(zhì)性糖尿病臨床表型Liftonetal.(2004)A4833GMT-ND2同質(zhì)性非胰島素依賴性糖尿病Onayaetal.(2000)A7472CtRNASer(UCN)同質(zhì)性糖尿病合并耳聾Hannaetal.(2005)A8296GtRNALys同質(zhì)性/異質(zhì)性糖尿病合并耳聾Ohsawaetal.(1998)A10398GMT-ND3同質(zhì)性2型糖尿病Katoetal.(2003)A12026GMT-ND4同質(zhì)性糖尿病Onayaetal.(1998)C12258AtRNASer(AGY)異質(zhì)性糖尿病合并耳聾Turnbulletal.(1998)T14709C*tRNAGlu同質(zhì)性/異質(zhì)性糖尿病合并耳聾Moraesetal.(1995)T16189CMT-DLOOP同質(zhì)性2型糖尿病Poultonetal.(1998)84第84頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二85攜帶tRNALeu(UUR)A3243G突變的糖尿病家系第85頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二86399bp307bp92bpMUn-cut143B43B12

A3243G為異質(zhì)性突變RFLPDNASequencingDHPLCControlA3243GA3242GWT第86頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二87攜帶tRNAGly

T10003C突變的糖尿病家系

第87頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二88tRNAGlyT10003C為同質(zhì)性突變第88頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二89AtRNAGly/tRNAstRNAThr/tRNAs第89頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二90SecondarystructureoftRNAGlySecondarystructureoftRNALeu(UUR)第90頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二91第91頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第四節(jié)

線粒體與糖尿病線粒體糖尿病線粒體DNA突變與糖尿病線粒體糖尿病的檢驗(yàn)診斷PCR技術(shù)正向引物（F）：5′-TTCACAAAGCGCCTTCCCCC-3′反向引物（R）：5′-GCGATGGTGAGAGCTAAGGTC-3′擴(kuò)增片段398bp（3153～3551bp）DHPLC技術(shù)PCR-RFLP技術(shù)DNA測(cè)序技術(shù)92第92頁(yè)，共104頁(yè)，2023年，2月20日，星期二分子診斷研究（A3243G異質(zhì)性分析）收集病人外周血抽提DNAPCR擴(kuò)增目的片段

PCR-RFLP測(cè)序驗(yàn)證RT-ARMs-qPCR（amplification

refractory

mutationsystem）Pyrosequencing（焦磷酸測(cè)序）

TargetedNext-GenerationSequencing二代測(cè)序High-throughputsequencing實(shí)例第93頁(yè)，共104頁(yè)，202