細(xì)菌內(nèi)毒素和熱原檢查法

細(xì)菌內(nèi)毒素和熱原檢查法第1頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二基礎(chǔ)知識(shí)熱原：注入人體后可引起發(fā)熱反應(yīng)的物質(zhì)。1材料的致熱性。2因微生物污染造成的熱原反應(yīng)。第2頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二熱原的檢查方法體內(nèi)熱原檢查法——兔溫法（PT)——是一種體內(nèi)的、全熱原的檢查方法。1942年USP12版第一次收載。各國(guó)藥典至今仍在使用。體外熱原檢查法（ITP)——是一種體外的利用人血細(xì)胞反應(yīng)的全熱原檢查法。尚未有藥典收載，歐洲藥典將會(huì)收載。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（BET)——醫(yī)藥工業(yè)普遍接受控制內(nèi)毒素等于控制熱原。第3頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二熱原分類——按檢查法分內(nèi)毒素?zé)嵩锾m氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組分非內(nèi)毒素?zé)嵩齼?nèi)毒素外的熱原第4頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二熱原檢查法（家兔法）可用于檢測(cè)上述兩種原因產(chǎn)生的熱原反應(yīng)。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法只檢測(cè)產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素含量。試驗(yàn)驗(yàn)證未發(fā)現(xiàn)輸液器材料的致熱性，臨床發(fā)生的熱原反應(yīng)均為細(xì)菌內(nèi)毒素污染造成的。因此對(duì)輸液器成品可采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行熱原初試。第5頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二熱原通常是指能夠致熱的微生物的尸體及代謝產(chǎn)物，主要是細(xì)菌的內(nèi)毒素。細(xì)菌內(nèi)毒素：主要存在于革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁內(nèi)，菌體裂解時(shí)釋放出來(lái)。是磷脂，脂多糖和蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物，復(fù)合物中的脂多糖是內(nèi)毒素的主要成分，具有特別強(qiáng)的熱原活性。第6頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二熱原的致熱機(jī)理：細(xì)菌內(nèi)毒素，病毒，細(xì)菌及其他微生物，類固醇或某些材料釋放熱原質(zhì)，作用于動(dòng)物體單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等靶細(xì)胞后，促使其產(chǎn)生內(nèi)生性熱原，作用于下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞，結(jié)果使動(dòng)物體溫升高。第7頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二熱原反應(yīng)給臨床治療帶來(lái)極大的危害，一般熱原進(jìn)入人體后數(shù)分鐘至1小時(shí)內(nèi)，即會(huì)出現(xiàn)高熱癥狀，反應(yīng)嚴(yán)重者會(huì)造成死亡，故必須嚴(yán)格控制。細(xì)菌內(nèi)毒素的理化性質(zhì)1耐熱性：180~200攝氏度2小時(shí)干熱可完全破壞。（藥典為250攝氏度至少1小時(shí)。）

第8頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2濾過(guò)性：體積極小，可通過(guò)普通濾器。3水溶性：可溶于水，生產(chǎn)中可用無(wú)熱原水沖洗以除去熱原。4不揮發(fā)性5被吸附性：可被樹(shù)脂等吸附除去。6被酸堿破壞7被氧化劑破壞：30%雙氧水浸泡4小時(shí)，可完全破壞。第9頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二細(xì)菌內(nèi)毒素生物活性致熱性致死性引起血液白細(xì)胞中的粒細(xì)胞下降激活凝血系統(tǒng)血壓下降誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)內(nèi)毒素的耐受引起淋巴細(xì)胞的有絲分裂誘導(dǎo)抗感染的非特異性殺死腫瘤細(xì)胞與鱟試劑反應(yīng)第10頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法第11頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二概述：1968年發(fā)現(xiàn)并創(chuàng)造了鱟試驗(yàn)，至今仍是國(guó)際上通用檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的最簡(jiǎn)便有效的方法，其優(yōu)點(diǎn)在于：1科學(xué)性：有生物化學(xué)的理論基礎(chǔ)。2準(zhǔn)確性：是酶的分子生化反應(yīng)，專屬性高，重現(xiàn)性強(qiáng)。3靈敏性：鱟試劑和細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)靈敏度極高，第12頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二當(dāng)內(nèi)毒素量低到10-10g/ml濃度，它們都能起凝膠反應(yīng)，至今未發(fā)現(xiàn)一種物質(zhì)對(duì)鱟試劑的反應(yīng)比細(xì)菌內(nèi)毒素更靈敏。4實(shí)用性：方法快速，操作簡(jiǎn)單，無(wú)需特殊儀器設(shè)備，經(jīng)濟(jì)實(shí)用。由于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的優(yōu)越性，已被廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)。第13頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簱?jù)鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的機(jī)理，以判斷醫(yī)療器械或其浸提液中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法，醫(yī)療器械/材料須經(jīng)熱原實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)證實(shí)無(wú)材料致熱性，同時(shí)經(jīng)測(cè)定證實(shí)樣品對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)無(wú)干擾作用后，才能采用該方法。第14頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二實(shí)驗(yàn)原理細(xì)菌內(nèi)毒素在鈣離子，鎂離子參與下，激活鱟試劑中c因子，活化的c因子激活b因子，活化的b因子激活凝固酶原生成凝固酶，促使凝固蛋白原生成凝固蛋白，在支聯(lián)酶作用下形成凝膠。第15頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二內(nèi)毒素C因子活化c因子B因子活化b因子凝固酶元凝固酶凝固蛋白原凝固蛋白凝膠某些非熱原物質(zhì)G因子活化g因子第16頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二實(shí)驗(yàn)試劑：鱟試劑：是從棲生于海洋的無(wú)脊椎動(dòng)物“鱟”的藍(lán)色血液中提取的變形細(xì)胞溶解物，經(jīng)低溫冷凍干燥精制而成的生物制劑。鱟試劑的生物活性以其能檢出細(xì)菌內(nèi)毒素的最低有效濃度表示。鱟試劑的靈敏度是用細(xì)菌內(nèi)毒素來(lái)標(biāo)定的，因此標(biāo)定鱟試劑靈敏度所用的細(xì)菌內(nèi)毒素必須是統(tǒng)一且標(biāo)準(zhǔn)的。第17頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二實(shí)驗(yàn)試劑細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品：系自大腸桿菌提取精制得到的內(nèi)毒素，單位：EU.用于標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)定，仲裁鱟試劑靈敏度。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品：以細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)定，確定其效價(jià)。具備均一性和穩(wěn)定性。第18頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水：指與靈敏度為0.03EU/ML或更高靈敏度的鱟試劑在37±1℃條件下24小時(shí)不產(chǎn)生凝集反應(yīng)的滅菌注射用水。第19頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二實(shí)驗(yàn)用具

移液管（或刻度吸管，定量移液器）、凝集管（10×75mm）、三角瓶、小試管（16×100mm）、試管架、洗耳球、封口膜或金屬試管帽、時(shí)鐘、脫脂棉、吸水紙、剪刀砂輪。所有玻璃器皿須經(jīng)180℃干烤至少2小時(shí)。塑料用具應(yīng)使用其它適宜的除細(xì)菌內(nèi)毒素方法。第20頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二試劑

75%乙醇、蒸餾水、鉻酸洗液。

第21頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二操作方法

試驗(yàn)準(zhǔn)備洗液的配備配制鉻酸洗液或其他適宜的細(xì)菌內(nèi)毒素滅活劑。玻璃器皿的洗滌將洗滌的玻璃器皿用洗滌劑和自來(lái)水洗凈并空干水分后置洗液中浸泡4小時(shí)，取出，用自來(lái)水將殘余的洗液洗凈，再用新鮮蒸餾水沖洗干燥后置適宜的密閉金屬容器中，置烤箱。第22頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內(nèi)毒素，玻璃器皿置箱后將烤箱調(diào)至180℃，待烤箱溫度升到設(shè)定的溫度后開(kāi)始記時(shí)，須干烤至少2小時(shí)。達(dá)到時(shí)間后，關(guān)斷電源。待烤箱溫度自然降至室溫，在不開(kāi)啟金屬容器的情況下，可兩周內(nèi)使用，否則須再次加熱除去可能存在的外源性內(nèi)毒素。塑料制品清洗干凈后在30％雙氧水中浸泡4h，再用無(wú)熱原水充分沖洗后在60℃烘箱中烘干備用。第23頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二鱟試劑靈敏度復(fù)核

內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備取NSE或WSE一支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開(kāi)，防止玻璃屑落入瓶?jī)?nèi)。按標(biāo)準(zhǔn)品使用說(shuō)明書(shū)用移液管加入規(guī)定量的BET水溶解其內(nèi)容物，用封口膜將瓶口封嚴(yán)。置旋渦混合器上混合15分鐘，然后制備成所需濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液即2.0λ、1.0λ,0.5λ,0.25λ（λ為所復(fù)核鱟試劑的標(biāo)示靈敏度），每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混合30秒（詳細(xì)過(guò)程請(qǐng)參見(jiàn)使用說(shuō)明書(shū)）。第24頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二示例例如使用NSE(內(nèi)毒素含量為9000EU/支)時(shí)的方法如下：溶解：準(zhǔn)確吸取BET水1ml加入NSE的安瓿內(nèi)，用封口膜將瓶口封嚴(yán)，置旋渦混合器混合15分鐘，即為9000EU/ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。稀釋：取0.3ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液加上2.7mlBET水即為1→10稀釋液，得到900EU/ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。第25頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二取0.3mL1→10稀釋液，加上2.7mLBET水即為1→100稀釋液，得到90EU/ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。往后依次類推。也可寫成下列格式：第26頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二9000EU/ml→900EU/ml→90EU/ml→9EU/ml→1EU/ml→0.5EU/ml→0.25EU/ml→0.125EU/ml→0.0625EU/ml在上述稀釋過(guò)程中，每稀釋一步，均須旋渦混合器上混合30秒鐘。0.3ml2.7ml2.4ml0.3ml1ml1ml第27頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二待復(fù)核鱟試劑的準(zhǔn)備

在制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的同時(shí)，取0.1ml/支的鱟試劑18支輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底。用砂輪在瓶頸處輕輕劃痕，75%乙醇棉球擦拭后啟開(kāi)備用，加入0.1mlBET水，使鱟試劑充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。第28頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

若待復(fù)核鱟試劑的規(guī)格不是0.1ml/支時(shí)，按標(biāo)示量加入BET水溶解，將溶解后的鱟試劑溶液混勻后每0.1ml分配到10×75mm凝聚管中，要求至少分配18管備用。第29頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二加樣將已充分溶解的待復(fù)核鱟試劑18支(管)放在試管架上，排成5列，其中4支(管)4列分別加入2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液；2支(管)1列分別加入BET水，作為陰性對(duì)照。內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液和BET水加樣量均為0.1ml/支。第30頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二加樣結(jié)束后，用封口膜封口，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，連同試管架放入37攝氏度水浴中，試管架保持水平狀態(tài)，保溫60±2分鐘.第31頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二結(jié)果判定：將試管從水浴中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°時(shí)，管內(nèi)凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽(yáng)性，記錄為（＋）；凝膠不能保持完整并從管壁滑脫者為陰性，記錄為（－）。第32頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二鱟試劑靈敏度復(fù)核

如最大2.0λ濃度管均為陽(yáng)性，最低濃度0.25λ4管均為陰性，陰性對(duì)照為陰性，

按下式計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值即為鱟試劑靈敏度的復(fù)核結(jié)果（λc）。λc＝lg-1(ΣX/4)式中X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（lg）。反應(yīng)終點(diǎn)濃度是系列濃度遞減的內(nèi)毒素溶液中最后四個(gè)呈陽(yáng)性的結(jié)果濃度。第33頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二結(jié)果記錄陰性0.50.250.1250.0625-++---++---++---+---第34頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二舉例計(jì)算內(nèi)毒素稀釋液濃度d(EU/ml)X(lgd)0.25-0.602060.25-0.602060.25-0.602060.5-0.30103第35頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二舉例計(jì)算∑X=﹣2.10721λс=lg-1(-2.10721/4)=0.297測(cè)定值在標(biāo)示值的50%——200%之間，所標(biāo)示靈敏度可被確認(rèn)，此批鱟試劑可用于供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。第36頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二內(nèi)毒素限值的確定一次性使用輸液器內(nèi)毒素限值為20EU/套（GB/T14233.2-2005)供試品細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查第37頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二供試品細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查供試品溶液的制備每批輸液器取3套，管內(nèi)腔注入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水10mL，反復(fù)蕩洗5次后，兩端封閉，置37℃下2h，將腔內(nèi)的液體倒入一無(wú)菌無(wú)熱原玻璃容器內(nèi)。第38頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二舉例：所用鱟試劑標(biāo)示靈敏度為0.25EU/ml,則陽(yáng)性對(duì)照溶液的細(xì)菌內(nèi)毒素濃度為0.5EU/ml.陽(yáng)性對(duì)照溶液的制備用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水制成2λ濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素溶液。試劑制備第39頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二鱟試劑制備在制備供試品溶液、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的同時(shí)，取0.1ml/支的鱟試劑6支，手指輕彈瓶壁，使頸部瓶壁上的粉末落入瓶?jī)?nèi)，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%乙醇棉球擦拭后啟開(kāi)備用，防止玻璃屑落入瓶?jī)?nèi)，加入0.1ml/支水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。若使用的鱟試劑的規(guī)格不是0.1ml/支時(shí)，按標(biāo)示量加入BET水復(fù)溶，將溶解后的鱟試劑液混勻后每0.1ml分配到10×75mm凝集管中，要求至少分配6管備用。第40頁(yè)，共45頁(yè)，2023年，2月20日，星期二供試液的稀釋使用鱟試劑的靈敏度標(biāo)示值小于供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限量時(shí)，用檢查用水將供試液稀釋后進(jìn)行試驗(yàn)，公式如下：供試液稀釋倍數(shù)=X/λX——供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限量λ——使用鱟試劑的靈敏度標(biāo)示值