第十章基因重組要

第十章基因重組要第1頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)

DNA的重組

DNARecombination

第2頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二DNA重組接合作用(conjugation)轉(zhuǎn)化作用(transformation)轉(zhuǎn)導作用

(transduction)轉(zhuǎn)座

(transposition)同源重組

(homologousrecombination)位點特異的重組(site-specificrecombination)第3頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機制的Holliday模型。一、同源重組第4頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二Holliday模型中，同源重組主要4個關(guān)鍵步驟①兩個同源染色體DNA排列整齊②一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應的鏈連接，形成Holliday中間體③通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈DNA④Holliday中間體切開并修復，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)第5頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二片段重組體

：切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA。拼接重組體：切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA。

5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′第6頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二

內(nèi)切酶

(recBCD)DNA侵擾(recA)分支遷移

(recA)

內(nèi)切酶(recBCD)

DNA

連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′目錄第7頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片段重組體拼接重組體目錄第8頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二二、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組（一）接合作用當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸時，質(zhì)粒DNA從一個細胞（細菌）轉(zhuǎn)移至另一細胞（細菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用(conjugation)。第9頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二可接合質(zhì)粒如F因子(Ffactor)

質(zhì)?！毦旧w外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子第10頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二（二）轉(zhuǎn)化作用通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用

(transformation)。

第11頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二例：溶菌時，裂解的DNA片段被另一細菌攝取。第12頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二目錄第13頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二（三）轉(zhuǎn)導作用當病毒從被感染的（供體）細胞釋放出來、再次感染另一（供體）細胞時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導作用(transduction)。第14頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二λ噬菌體的生活史溶菌生長途徑(lysispathway)溶源菌生長途徑(lysogenicpathway)例目錄第15頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二第16頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二三、位點特異重組位點特異重組(site-specificrecombination)

是由整合酶催化，在兩個DNA序列的特異位點間發(fā)生的整合。例（一）λ噬菌體DNA的整合λ噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地識別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的長末端重復序列(longterminalrepeat,LTR)。

第17頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二例（二）細菌的特異位點重組沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變

第18頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二hix為反向重復序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進行特異位點重組(倒位)。H片段上有兩個啟動子P，其一驅(qū)動hin基因表達，另一正向時驅(qū)動H2和rH1基因表達，反向(倒位)時H2和rH1不表達。rH1為H1的阻遏蛋白基因。第19頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二H2鞭毛素

阻遏蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段hinH2IH1H1鞭毛素hinH2IDNA啟動序列H1啟動序列沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變第20頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二例（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L鏈)和兩條重鏈(H鏈)組成，分別由三個獨立的基因族編碼，其中兩個編碼輕鏈(和)，一個編碼重鏈。

輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：LVJCLVDJC第21頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-J重排均發(fā)生在特異位點上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的兩側(cè)均存在保守的重組信號序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的重組酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有兩個，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)RAG1和RAG2。

CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重組信號序列基因片段第22頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二V片段J片段RSSRSS間插DNAOHOHVJ單鏈切開RAG1RAG2分子內(nèi)轉(zhuǎn)酯反應單鏈切開轉(zhuǎn)移核苷酸修復、連接免疫球蛋白基因重排過程目錄第23頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二四、轉(zhuǎn)座重組由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座(transposition)。第24頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二插入序列(insertionsequences,IS)組成：二個分離的反向重復(invertedrepeats,IR)序列特有的正向重復序列一個轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因

IRTransposaseGeneIR發(fā)生形式：保守性轉(zhuǎn)座(conservativetransposition)復制性轉(zhuǎn)座(duplicativetransposition)（一）插入序列轉(zhuǎn)座第25頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二插入序列的復制性轉(zhuǎn)座目錄復制第26頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二轉(zhuǎn)座子(transposons)——可從一個染色體位點轉(zhuǎn)移到另一位點的分散重復序列。

轉(zhuǎn)座子組成：反向重復序列轉(zhuǎn)座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposaseGene有用基因（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座第27頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二第28頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二由轉(zhuǎn)座子介導的轉(zhuǎn)座目錄第29頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)

重組DNA技術(shù)DNARecombinationTechnique第30頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二重組DNA技術(shù)的發(fā)展史年

G.J.Mendel的豌豆雜交試驗1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗1973年美國斯坦福大學的科學家構(gòu)建第一個重組DNA分子1977年美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學上重要的藥物。1980年開始建造第一家應用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠1997年英國羅林研究所成功的克隆了多莉第31頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二相關(guān)概念DNA克隆工具酶目的基因基因載體基本原理重組DNA技術(shù)與醫(yī)學的關(guān)系本節(jié)主要內(nèi)容第32頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一）DNA克隆第33頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二技術(shù)水平：分子克隆(molecularclone)即DNA克隆

細胞克隆個體克?。▌游锘蛑参铮┑?4頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二DNA克隆應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復制能力的DNA分子——復制子(replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(recombinantDNA)

。

第35頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二生物技術(shù)工程:

基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細胞工程等目的①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程(geneticengineering)

——實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學。第36頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二（二）工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆轉(zhuǎn)錄酶

T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶第37頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基第38頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二限制性核酸內(nèi)切酶定義限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ第39頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二作用與甲基化酶共同構(gòu)成細菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護自身DNA。分類Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）第40頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名Hin

dⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶第41頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二Ⅱ類酶識別序列特點——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG第42頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口第43頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二同功異源酶來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ第44頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二同尾酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA第45頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二（三）目的基因

cDNA(complementaryDNA)基因組DNA(genomicDNA)第46頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二（四）基因載體定義為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA第47頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設計的載體稱為克隆載體。表達載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設計的載體稱為表達載體。第48頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二載體的選擇標準能自主復制；具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA。第49頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二1.質(zhì)粒

(plasmid)特點

能在宿主細胞內(nèi)獨立自主復制；帶有某些遺傳信息,會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。第50頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二目錄第51頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二第52頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)λgt系列（插入型，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適用基因組克?。?.噬菌體(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列第53頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二3.粘性質(zhì)粒(cosmid)第54頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)細菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他第55頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二二、重組DNA技術(shù)基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達

第56頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二

以質(zhì)粒為載體的DNA

克隆過程目錄第57頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二（一）目的基因的獲取1.化學合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)

（見第22章）第58頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二*化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列第59頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合*從基因組DNA文庫獲取目的基因目錄第60頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二限制酶切位點限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫目錄第61頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二mRNAcDNA雙鏈cDNA

重組DNA分子cDNA文庫

反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復制*從cDNA文庫獲取目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT目錄第62頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二（三）外源基因與載體的連接1.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接配伍末端連接非配伍末端連接（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建第63頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二BamHⅠ切割反應

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接目錄第64頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點BglⅡ切割位點+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。目錄第65頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二2.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端第66頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目錄第67頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二3.同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。第68頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體目錄第69頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二4.人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接。

第70頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二人工接頭及其應用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目錄第71頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導入方式轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)（四）重組DNA導入受體菌第72頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二（五）重組體的篩選

1.直接選擇法(1)抗藥性標記選擇(2)標志補救(markerrescue)(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡

2.免疫學方法如免疫化學方法及酶免檢測分析等第73頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二(插入失活法)抗藥性標記選擇目錄第74頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二組氨酸缺陷型大腸桿菌無組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進組氨酸合成λDNA重組體標志補救目錄第75頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二α互補目錄第76頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二α互補的檢測目錄第77頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二原位雜交目錄第78頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二Southern印跡目錄第79頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二雞的β肌球蛋白的克隆和檢出目錄第80頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為小結(jié)分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體

轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌篩篩選重組體

第81頁，共92頁，2023年，2月20日，星期二重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA

cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交目錄第82頁，